Articolo metodologico

Isolamento, espansione in vitro e caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali da tessuto adiposo epididimo di topo

DOI:

10.3791/65722

⸱

12 gennaio 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Immunobiology, Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Department of Medicine, Afya Medical Sciences College

In questo articolo

Sommario

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Il tessuto adiposo è un'ottima fonte di cellule staminali mesenchimali. Qui, portiamo l'estrazione, la coltivazione e la caratterizzazione passo dopo passo di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC) da topi svizzeri tessuto adiposo epididimale.

Abstract

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Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state ampiamente studiate come nuovo approccio terapeutico, principalmente per fermare l'infiammazione esacerbata grazie al loro potenziale di modulare la risposta immunitaria. Le MSC sono cellule immuno-privilegiate in grado di sopravvivere in riceventi di trapianto allogenico immunologicamente incompatibili sulla base di una bassa espressione di molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I e nell'uso della terapia cellulare per il trapianto allogenico. Queste cellule possono essere isolate da diversi tessuti, i più comunemente usati sono il midollo osseo e i tessuti adiposi. Forniamo un protocollo semplice per isolare, coltivare e caratterizzare le MSC dal tessuto adiposo epididimo dei topi. Il tessuto adiposo dell'epididimo viene asportato chirurgicamente, frammentato fisicamente e digerito con una soluzione di collagenasi di tipo II allo 0,15%. Quindi, le cellule staminali primarie derivate dal tessuto adiposo (ADSC) vengono coltivate ed espanse in vitro e la caratterizzazione fenotipica viene eseguita mediante citometria a flusso. Forniamo anche i passaggi per differenziare le ADSC in cellule osteogeniche, adipogeniche e condrogeniche, seguite dalla caratterizzazione funzionale di ciascuna linea cellulare. Il protocollo qui fornito può essere utilizzato per esperimenti in vivo ed ex vivo e, in alternativa, le cellule staminali di derivazione adiposa possono essere utilizzate per generare cellule immortalizzate simili alle MSC.

Introduzione

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Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono cellule multipotenziali adulte che si differenziano in cellule come osteoblasti, condroblasti e adipociti 1,2. Queste cellule risiedono in diversi organi e, per questo motivo, possono essere estratte da tessuti adulti come midollo osseo, muscoli, grasso, follicolo pilifero, radice dei denti, placenta, derma, pericondrio, cordone ombelicale, polmone, fegato e milza 3,4.

Gli effetti delle MSC sulla fisiologia e sul sistema immunitario sono stati riportati 5,6. Queste cellule sono state promettenti per il trattamento di diverse malattie, sia in medicina umana che veterinaria. Le MSC possono controllare l'infiammazione e promuovere l'angiogenesi e l'omeostasi tissutale attraverso diversi meccanismi, come il contatto cellula-cellula, i fattori solubili e le piccole vescicole extracellulari 7,8,9,10. Inoltre, le MSC sono cellule immuno-privilegiate in grado di sopravvivere in riceventi di trapianto allogenico immunologicamente incompatibili perché queste cellule mostrano una bassa espressione di molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I e sono utilizzate nella terapia cellulare per il trapianto allogenico11,12. La bassa immunogenicità combinata con il potenziale rigenerativo rende le MSC candidate ideali per la terapia cellulare, come la malattia del trapianto contro l'ospite (GvHD)13, il lupus eritematoso sistemico (LES)14 e la sclerosi multipla15, tra le altre16,17.

Nonostante il fatto che le MSC risiedano in diversi tessuti adulti, il tessuto adiposo offre vantaggi rispetto ad altre fonti, come l'accessibilità per il prelievo, con un intervento chirurgico minimo; gran numero di celle disponibili con alto tasso di espansione; e facile espansione in vitro utilizzando un protocollo facile da eseguire senza la necessità di apparecchiature specifiche e materiali a basso costo 18,19,20. Una volta estratte, le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC) devono essere caratterizzate come stabilito dalla Società Internazionale per la Terapia Cellulare (ISCT)21. Pertanto, le MSC devono mostrare una morfologia fibroblastica, aderenza alla coltura plastica, esprimendo un'alta percentuale (≥95%) di marcatori mesenchimali come l'endoglina (CD105), l'ecto-5'-nucleotidasi (CD73) e Thy-1 (CD90) e una bassa percentuale (≤2%) di marcatori ematopoietici come l'antigene comune leucocitario (CD45), la fosfoglioglicoproteina transmembrana (CD34), la glicoproteina di membrana ancorata ai glicolipidi (CD14), l'integrina alfa M (CD11b), la catena alfa associata al complesso del recettore dell'antigene delle cellule B (CD79α) o Antigene di superficie dei linfociti B B4 (CD19) e antigene leucocitario umano di classe II (HLA-II). Inoltre, è necessaria una caratterizzazione funzionale e le cellule dovrebbero essere in grado di differenziarsi in cellule di osteoblasti, condroblasti o adipoblasti21.

Qui, mostriamo come ottenere le MSCs dal tessuto adiposo dell'epididimo utilizzando la dissociazione meccanica e la digestione enzimatica per studi in vitro e la caratterizzazione morfologica preconizzata da ISCT.

Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida internazionali per l'etica animale e sono stati approvati dai comitati istituzionali di cura e uso dell'Università Statale di Santa Cruz con il numero di protocollo 021/22. I topi maschi svizzeri (6-8 settimane) sono stati acquistati presso il Laboratorio di Allevamento Animale, Mantenimento e Sperimentazione - Animal Research Facility dell'Università Statale di Santa Cruz (LaBIO-UESC), mantenuti in specifiche condizioni prive di agenti patogeni, ricevendo acqua e cibo ad libitum con cicli luce/buio di 12 ore.

NOTA: È possibile utilizzare altri lignaggi di topi; Si consiglia l'uso di topi adulti (6-8 settimane) poiché hanno tessuto adiposo più sviluppato e cellule con elevata attività proliferativa.

1. Preparazione

NOTA: Prima di procedere, preparare i seguenti reagenti descritti di seguito. Vedere la Tabella dei materiali per informazioni sui reagenti e sui fornitori di materiali. I dispositivi di protezione individuale come maschere, berretti, camici da laboratorio e guanti devono essere indossati in tutte le procedure pratiche.

  1. Estrazione del tessuto adiposo epididimo
    1. Riserva il materiale chirurgico: tre set di pinzette e forbici sterili, cinque aghi e un becher contenente 200 ml di etanolo al 70%.
    2. Preparare un anestetico terminale, mescolando ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
  2. Cultura ADSC
    1. Terreno basale: Preparare il terreno ad alto contenuto di glucosio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 50 μg/mL di gentamicina, 0,25 μg/mL di amfotericina B, 100 U/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina.
    2. Soluzione digestiva: Preparare lo 0,15% di collagenasi di tipo II in PBS sterilizzato in un filtro da 0,25 μm.
      NOTA: Non è necessario utilizzare i quattro antibiotici descritti nel terreno basale. Dipenderà dalle condizioni di coltura cellulare del laboratorio in cui viene eseguita.
  3. Caratterizzazione fenotipica delle ADSC
    1. Preparare l'albumina sierica bovina (BSA) all'1% in PBS.
    2. Diluire gli anticorpi anti-topo come indicato nella Tabella 1.
    3. Preparare il 2% di formaldeide in PBS.
  4. Differenziazione osteogenica delle ADSC
    1. Terreno di differenziazione osteogenico: Preparare DMEM integrato con acido ascorbico 5,67 M, desametasone 10 nM, β-glicerofosfato 0,02 M, FBS al 10% e penicillina/streptomicina all'1%.
    2. Per la colorazione di Von Kossa, preparare le seguenti soluzioni: 70% di etanolo in acqua, 5% di nitrato d'argento in acqua, acqua distillata, 5% di tiosolfato di sodio in acqua e 1% di eosina B in acqua.
  5. Differenziazione adipogenica:
    1. Terreno di differenziazione adipogenico: Preparare DMEM integrato con 0,5 mM di 3-isobutilil-1-metilxantina, 200 μM di indometacina, 1 μM di desametasone, 10 μM di insulina, 10% di FBS e 1% di penicillina/streptomicina.
    2. Per la colorazione con olio rosso, preparare le seguenti soluzioni: 10% di formalina in acqua deionizzata, 60% di isopropanolo in acqua deionizzata, lisocromo (colorante liposolubile) colorante diazo (soluzione di olio rosso O) in isopropanolo al 60% e ematossilina all'1% in acqua deionizzata.
  6. Differenziazione condrogenica:
    1. Terreno di differenziazione condrogenica: Preparare un terreno condrogenico integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina/streptomicina.
    2. Preparare il 10% di formaldeide in PBS.
    3. Per la colorazione di proteoglicani e glicosaminoglicani, preparare le seguenti soluzioni: colorazione di eteroglicani (Alcian Blue 1%) in acido acetico, pH 2,5, paraffina, ematossilina, diluizione della serie di etanolo in acqua (100%, 96%, 80% e 70%).

Anticorpo/fluoroforoDiluizioneCloneConcentrazione finale (μg/mL)Funzione e cellula in cui è espresso
CD34- PE1:100RAM342Fattore di adesione cellulare. Cellule staminali ematopoietiche.
CD45- APC1:10030-F112Assistenza nell'attivazione dei leucociti. Espresso nei leucociti.
CD71- FITC1:100C25Controlla l'assorbimento del ferro durante la proliferazione cellulare. Cellule proliferanti, reticolociti e cellule precursori.
CD29- FITC1:100Ha2/55Adesione e attivazione, embriogenesi, leucociti, cellule dendritiche, piastrine, mastociti, fibroblasti e cellule endoteliali.
CD90- PerCP1:100OX-72Segnalazione, adesione. Linfociti T, NK, monociti, cellule staminali ematopoietiche, neurone e fibroblasti.

Tabella 1: Anticorpi utilizzati per la caratterizzazione fenotipica delle ADSC mediante citometro a flusso. Elenco degli anticorpi con i rispettivi fluorocromi, diluizioni, clone e concentrazione finale, nonché la loro funzione nella cellula che viene espressa.

2. Metodi

NOTA: Il tessuto adiposo è distribuito in tutto il corpo in sedi sottocutanee o intra-addominali. Nei topi, i tessuti adiposi più comuni utilizzati per gli esperimenti includono l'epididimo sottocutaneo, il mesenterico e il retroperitoneale22. Qui vengono mostrati i passaggi per ottenere il tessuto adiposo epididimo (Figura 1).

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Figura 1: Disegno sperimentale per ottenere cellule staminali derivate dal tessuto adiposo da topi svizzeri. (A) Utilizzando aghi, posizionare l'animale sul pannello di sughero o polistirolo; (B) Sollevare la pelle usando una pinzetta, fare un taglio al centro della regione addominale e staccare la pelle dal peritoneo; (C) identificare il tessuto adiposo bianco sopra l'epididimo; (D) trasferire il tessuto in un terreno DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di antibiotici, lavare accuratamente il tessuto adiposo dell'epididimo con PBS e trasferire il tessuto nella soluzione digestiva; (E), frammentare il tessuto e (F) incubare a 37 °C per 1 ora agitando energicamente ogni 10 minuti; (G) dopo aver contato le cellule, impiattare in piastre a 6 pozzetti e osservare la morfologia cellulare al microscopio invertito. (F) La morfologia cellulare cambierà da rotonda a fibroblastica. Barra della scala = 22,22 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Estrazione del tessuto adiposo epididimo
    NOTA: Tenere presente che tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare per garantire una coltura cellulare pura e priva di contaminazioni.
    1. Eutanasia degli animali utilizzando una soluzione di ketamina e xilazina (100 e 10 mg/kg, come descritto al punto 1.1.2) per via intraperitoneale.
      NOTA: È possibile utilizzare altri metodi di eutanasia23. Assicurati che l'animale sia morto confermando l'assenza di battito cardiaco.
    2. Posizionare l'animale con il lato ventrale rivolto verso l'alto su una tavola di sughero o polistirolo ricoperta di un foglio di alluminio e fissarlo con aghi sterili (Figura 1A).
      NOTA: Per evitare contaminazioni, spruzzare alcol al 70% nella regione addominale. In alternativa, radere i capelli con un bisturi.
    3. Sollevare la pelle usando una pinzetta al centro della regione addominale e fare un taglio con le forbici sterili.
      NOTA: Sono necessari due set di pinzette e forbici sterili per evitare la contaminazione. Il primo serve per aprire l'animale, tagliando la pelle e lo strato peritoneale; il secondo serve a prelevare il tessuto adiposo dell'epididimo . Inoltre, riserva 150 ml di alcol al 70% in un becher per pulire forbici e pinzette tra un passaggio e l'altro.
    4. Introdurre le forbici sotto la pelle dell'animale e aprirle per staccarle dal peritoneo (Figura 1B). Sollevare lo strato peritoneale con una pinzetta e tagliare con le forbici sterili.
    5. Usa un altro set di pinzette e forbici sterili e identifica l'epididimo sopra i testicoli e il tessuto adiposo bianco sopra l'epididimo. Estrarre l'intero tessuto adiposo dell'epididimo utilizzando una pinzetta sterile, di circa 2 cm di dimensione, e tagliare molto vicino all'epididimo (Figura 1C).
    6. Mettere il grasso in una provetta conica sterile da 50 mL contenente terreno basale e metterlo sul ghiaccio (Figura 1D). Nel cofano, procedere con i passaggi successivi come descritto di seguito.
  2. Isolamento di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC)
    NOTA: Processare i campioni in una cappa a flusso laminare di classe biologica II e il personale deve indossare un camice da laboratorio, guanti e maschera chirurgica.
    1. Lavare accuratamente il tessuto adiposo epididimo con PBS.
      NOTA: Questo passaggio è essenziale per rimuovere il sangue e altre particelle dal campione. Il sangue può inibire l'enzima collagenasi di tipo II e compromettere l'esperimento.
    2. Utilizzando una pinzetta sterile, trasferire il tessuto adiposo dell'epididimo in una provetta da 50 mL contenente 15-20 mL di soluzione digestiva, preparata come al punto 1.2.2. Frammentare il tessuto con forbici sterili e incubare il tessuto a 37 °C per 1 ora (Figura 1E, F).
      NOTA: In questa fase è possibile utilizzare un bagno d'acqua o un'incubatrice a 37 °C. Ogni 10 minuti, la sospensione deve essere agitata energicamente per facilitare la digestione. Non prolungare il tempo di incubazione di 1 ora.
    3. Inattivare la collagenasi diluendo il campione 1:1 in terreno basale e centrifugare la sospensione a 250 x g per 10 min a 4 °C per ottenere la frazione vascolare dello stroma. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno basale.
    4. Verificare la vitalità e contare le cellule attraverso il metodo di esclusione del colorante blu di tripano in una camera Neubauer utilizzando una diluizione di 1:10 o 1:100.
      NOTA: La resa attesa è di circa 0,5-1 milione di cellule/g di tessuto adiposo lavorato e la vitalità è dell'80%.
    5. Piastra le cellule isolate (0,3-0,5 milioni) in 3 mL di terreno basale in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare le cellule per una notte a 37 °C con CO2 al 5 %.
    6. Giorno successivo: Togliere il terreno dal pozzetto e lavare le celle con PBS. Aggiungere 3 mL di terreno basale. Ripeti questo processo ogni 2 giorni fino a quando le cellule diventano confluenti al 90%.
      NOTA: Osservare sempre la morfologia delle cellule al microscopio invertito, passando da rotonda a fibroblastica (Figura 1H).
  3. Espansione delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC)
    NOTA: Una volta che le cellule crescono ~90% confluenti, procedere alla sottocoltura come descritto di seguito.
    1. Rimuovere il terreno dal pozzetto e lavare le celle con PBS. Aggiungere 0,5 mL/pozzetto di tripsina/EDTA (0,05 % tripsina; 200 mg/L EDTA) e incubare la piastra per 3-5 minuti a 37 °C per staccare le cellule.
      NOTA: Non superare i 5 minuti in tripsina/EDTA. Il completo distacco delle cellule deve essere verificato al microscopio invertito. Il processo può essere accelerato pipettando con attenzione su e giù o picchiettando il lato della piastra.
    2. Inattivare l'enzima diluendo il campione 1:1 in DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di antibiotici.
    3. Dividere la sospensione cellulare in 2 pozzetti e aggiungere 3 mL di terreno basale (DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di antibiotici). Incubare per una notte a 37 °C con CO2 al 5%.
    4. Cambiare il fluido il giorno successivo, poi ogni 2 giorni fino alla confluenza del 90%.
    5. Ripetere il processo fino al terzo passaggio e procedere alla caratterizzazione fenotipica e funzionale.
      NOTA: Osservare sempre la morfologia delle cellule al microscopio invertito, passando da rotonda a fibroblastica.
  4. Caratterizzazione delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC)
    1. Caratterizzazione fenotipica mediante citometria a flusso
      1. Staccare le celle utilizzando tripsina/EDTA, come descritto nei passaggi da 2.3.1 a 2.3.2.
      2. Raccogliere le cellule in una provetta conica (50 mL) e centrifugare a 250 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di PBS.
      3. Contare le cellule come descritto al punto 2.2.4 e seminare 0,5-1 x 106 cellule in 100 μL di PBS in una piastra a 96 pozzetti.
        NOTA: Il numero di pozzetti dipenderà dal colore del coniugato di fluorocromo e dai filtri/laser del citometro.
      4. Aggiungere gli anticorpi (Tabella 1) diluiti in BSA all'1% in PBS.
        NOTA: Non è necessario utilizzare il blocco Fc per evitare il legame aspecifico perché già utilizziamo BSA per diluire gli anticorpi. Riservare un campione di cellule senza ricevere anticorpi che verranno utilizzati come controllo della colorazione. Gli anticorpi possono essere combinati nello stesso pozzetto in base al colorante fluorocromo e al citometro disponibili in laboratorio. Tutti gli anticorpi descritti nella Tabella 1 possono essere aggiunti nello stesso pozzetto, ad eccezione del CD71 FITC e del CD29 FITC, che devono trovarsi in pozzetti diversi a causa dello stesso fluorocromo.
      5. Incubare la piastra per 30 minuti a 4 °C al buio.
      6. Lavare le celle, quindi completare il volume a 200 μl utilizzando PBS, centrifugare la piastra a 252 x g per 10 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
      7. Fissare le cellule aggiungendo 200 μL per pozzetto di formaldeide al 2% in PBS. Conservare le cellule al buio a 4 °C fino all'analisi nel citometro a flusso.
        NOTA: Per ottenere i migliori risultati, acquisire le cellule sul citometro a flusso il prima possibile. La luminosità della fluorescenza dei marcatori diminuisce significativamente dopo 48 ore per la maggior parte dei fluorocromi. Quindi, non superare le 48 ore per leggere la targa. Si consiglia l'acquisizione di 30.000 eventi.
      8. Utilizzare la strategia di gating presentata nella Figura 2B per selezionare la popolazione ASC.
    2. Caratterizzazione funzionale: Differenziamento osteogenico
      1. Staccare le cellule utilizzando tripsina/EDTA (come descritto nei passaggi da 2.3.1 a 2.3.2), raccogliere e centrifugare le cellule (come descritto nei passaggi 2.4.1.2 e 2.4.1.2) e contarle (come descritto nei passaggi 2.2.4).
      2. Piastra, in triplice copia, 2 x 105 cellule per pozzetto in piastre a 6 pozzetti in basale mediale (DMEM integrato con il 10 % di FBS e l'1 % di antibiotici); incubare a 37 °C in CO2 al 5%.
        NOTA: Saranno necessarie due piastre a 6 pozzetti, una per ogni tempo di differenziazione (14 e 21 giorni).
      3. Il giorno successivo, cambiare il terreno con un terreno osteogenico (passaggio 1.4.1).
        NOTA: riservare 3 pozzetti in coltura solo con il terreno basale, che sarà il controllo per la differenziazione.
      4. Colture di cellule per 14 e 21 giorni in terreni osteogenici e cellule di controllo, cambiando terreno ogni 3 giorni. Procedere alla colorazione di Von Kossa (passaggio 1.4.2) per valutare i noduli mineralizzati alla fine di ogni periodo di coltura.
      5. Aspirare il terreno da ogni pozzetto e lavare le cellule due volte con PBS. Fissare le celle con 2 ml di etanolo al 70% per una notte a temperatura ambiente (RT). Lavare accuratamente le celle in acqua corrente.
      6. Aggiungere 2 mL di soluzione di nitrato d'argento al 5% e incubare la piastra in luce ultravioletta per 1 ora. Lavare le celle con acqua distillata. Aggiungere 2 mL di tiosolfato di sodio al 5% e incubare per 5 minuti. Lavare con acqua distillata.
      7. Controcolorante con 2 mL di eosina per 40 s. Lavare con acqua distillata fino a rimuovere la soluzione colorante e visualizzare la colorazione utilizzando un microscopio ottico.
    3. Caratterizzazione funzionale: Differenziamento adipogenico
      1. Staccare le cellule utilizzando tripsina/EDTA (come descritto nei passaggi da 2.3.1 a 2.3.2), raccogliere e centrifugare le cellule (come descritto nei passaggi 2.4.1.2 e 2.4.1.2) e contarle (come descritto nei passaggi 2.2.4).
      2. Piastra 2 x 105 cellule per pozzetto in piastre a 6 pozzetti in basale mediale (DMEM integrato con il 10 % di FBS e l'1 % di antibiotici); incubare a 37 °C in CO2 al 5%.
        NOTA: Saranno necessarie due piastre a 6 pozzetti, una per ogni tempo di differenziazione (14 e 21 giorni).
      3. Il giorno successivo, cambiare il terreno in terreno adipogenico (passaggio 2.5.1).
        NOTA: Riservare 3 pozzetti in coltura solo con il terreno basale come controllo.
      4. Coltura di cellule per 14 e 21 giorni in terreno adipogenico, cambiando terreno ogni 3 giorni. Al termine di ogni periodo di coltura, procedere alla colorazione Oil-Red O (passaggi 2.4.3.5-2.4.3.7), un indicatore dell'accumulo di lipidi intracellulari.
      5. Aspirare il terreno da ogni pozzetto. Lavare le celle due volte con PBS. Fissare le cellule in 2 mL di formalina al 10% per 1 ora. Lavare una volta con PBS e poi una volta con acqua.
      6. Colorare con 2 mL di soluzione di Olio-Rosso O in isopropanolo al 60% per 5 minuti. Lavare una volta con acqua distillata.
      7. Controcolorante con 2 mL di ematossilina all'1% diluita 1:2 in acqua distillata per 1 min. Lavare con acqua distillata fino a rimuovere la soluzione colorante e visualizzare i campioni colorati utilizzando un microscopio ottico.
    4. Caratterizzazione funzionale: Differenziazione condrogenica
      1. Staccare le cellule utilizzando tripsina/EDTA (come descritto nei passaggi da 2.3.1 a 2.3.2), raccogliere e centrifugare le cellule (come descritto nei passaggi 2.4.1.2 e 2.4.1.2) e contarle (come descritto nei passaggi 2.2.4).
      2. Mettere 5 x 105 ADSC in quattro provette coniche in polipropilene e centrifugare a 450 x g per 5 minuti per formare un pellet. Scartare il surnatante.
      3. Coltura dei pellet in una provetta conica in un mezzo condrogenico (fase 1.6.1) o solo terreno basale (controllo della differenziazione) per 14 e 21 giorni a 37 °C in CO2 al 5%. Cambiare il fluido ogni 3 giorni ed evitare di rimuovere i pellet.
        NOTA: Ogni pellet cellulare si riferisce a ciascun periodo di coltura, nonché ai rispettivi controlli coltivati solo con terreno basale.
      4. Alla fine di ogni punto di coltura, raccogli i pellet usando una pinzetta a punta fine e mettili in una piastra a 24 pozzetti. Procedere con il sezionamento istologico e la colorazione dei proteoglicani e dei glicosaminoglicani (passaggi 2.4.4.5.-2.4.4.9).
        NOTA: Ogni pellet viene lavorato in un pozzetto separato.
      5. Fissare i pellet in 2 mL di formaldeide tamponata al 10% per 30 min. Scartare la soluzione di formaldeide e aggiungere 2 ml di etanolo al 70%. Rimuovere il pellet dal tubo conico utilizzando una punta e incorporare i pellet nella paraffina.
      6. Utilizzando un microtomo di paraffina rotante, eseguire sezioni istologiche di 5 μm. Incubare le sezioni per 15 minuti a 60 °C e immergerle due volte in xilene (per 5 e 15 minuti).
      7. Reidratare i campioni immergendo le sezioni istologiche in bagni di alcol a concentrazioni decrescenti (100%, 96%, 80% e 70%) per 2 minuti ciascuno, quindi risciacquare con acqua deionizzata per 5 minuti.
      8. Procedere alla colorazione dei campioni con blu di Alcian 1% in acido acetico, pH 2,5, per 30 minuti.
      9. Controcolorare con ematossilina per 1 minuto e lavare con acqua distillata. Monta con DPX (montante per istologia) o un'altra soluzione di montaggio e visualizza i campioni utilizzando un microscopio ottico.

Risultati

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Le cellule estratte dal tessuto adiposo secondo il protocollo qui presentato hanno mostrato una morfologia che corrisponde ai criteri minimi per le MSC proposti dall'ISCT. Una panoramica del protocollo è mostrata nella Figura 1. Fenotipicamente, le ADSC hanno mostrato aderenza alla morfologia plastica e fibroblastica nei primi giorni di coltura cellulare (Figura 2A). Inoltre, sono cresciuti in modo omogeneo e hanno formato colonie. Inoltre, le ADSC hanno mostrato una bassa espressione di CD34 (2,12%) e CD45 (1,81%), entrambi marcatori ematopoietici, e un'alta espressione di CD71 (42,6%), CD29 (74,2%) e CD90 (55,1%), tutti marcatori di cellule mesenchimali (Figura 2B).

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Figura 2: Caratterizzazione fenotipica di cellule derivate dal tessuto adiposo. (A) Morfologia delle ADSC che cambia da rotonda a fibroblastica nei giorni 2, 4 e 8 di coltura; barra della scala = 22,22 μm. (B) Istogrammi per i marcatori espressi (CD71, CD29 e CD90) o meno (CD34 e CD45) da ASC. Questa figura è stata riprodotta con il permesso di Miranda et al.24. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dal punto di vista funzionale, le ADSC hanno mostrato multipotenza nel differenziarsi in osteoblasti, adipoblasti e condroblasti quando coltivate in terreni condizionati per ciascun lignaggio per 14 o 21 giorni (Figura 3). La colorazione di Von Kossa ha rivelato noduli mineralizzati nella matrice extracellulare, caratteristici del processo di osteogenesi (Figura 3). La colorazione Oil-red O ha evidenziato vacuoli lipidici nel citoplasma delle ADSC e la colorazione con Alcian Blue ha confermato la presenza di glicosaminoglicani nella matrice extracellulare (Figura 3). Insieme, le caratteristiche fenotipiche e funzionali hanno confermato la popolazione di cellule estratte dal tessuto adiposo dell'epididimo come MSC.

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Figura 3: Caratterizzazione funzionale di cellule derivate dal tessuto adiposo. Potenziale multilineage osteogenico, adipogenico e condrogenico dell'ADSC dopo 14 e 21 giorni in coltura. Barra della scala = 50 μm (pannello superiore), 100 μm (pannello centrale e inferiore). Questa figura è stata riprodotta con il permesso di Miranda et al.24. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Le MSC possono essere estratte da diversi tessuti. Nonostante il midollo osseo rappresenti una fonte comune di MSC sia nei murini che nell'uomo25,26, abbiamo scelto di lavorare con il tessuto adiposo in questo studio per la sua ricchezza di MSC, la distribuzione nel corpo e la facilità di accesso. In alternativa, le cellule staminali di derivazione adiposa possono essere utilizzate per generare cellule immortalizzate simili alle MSC27.

Alcuni punti dell'estrazione meritano un'attenzione particolare per la buona riuscita dei protocolli qui condivisi. Innanzitutto, evidenziamo la cura per raccogliere il tessuto che deve essere eseguita in condizioni asettiche. Quindi, assicurati che i topi siano adeguatamente disinfettati con alcol al 70% prima di iniziare l'intervento chirurgico. Un altro punto importante è quello di non utilizzare lo stesso set di pinzette e forbici per prelevare il tessuto adiposo dell'epididimo, evitando così qualsiasi fonte di contaminazione.

Una seconda preoccupazione è l'elaborazione dei tessuti. I frammenti nella provetta conica devono essere agitati correttamente e vigorosamente con 10 minuti di incubazione a 37 °C. È molto importante cambiare il mezzo il giorno successivo e poi ogni 2-3 giorni. Si consiglia di osservare la coltura quotidianamente, controllando il colore del mezzo, la forma delle cellule e qualsiasi interferenza nell'ambiente della coltura.

Una terza preoccupazione riguarda il miglior tempo/passaggio per la caratterizzazione delle MSC. Qui, si consiglia di farlo al terzo passaggio delle celle, ma questo non è obbligatorio. Dipende dall'obiettivo dello studio. Nel terzo passaggio, abbiamo circa l'80% delle cellule caratterizzate come MSC, il che è sufficiente per gli obiettivi di questo studio, ad esempio. La caratterizzazione fenotipica viene eseguita analizzando l'espressione di marcatori ematopoietici (CD34 e CD45, ad esempio) e mesenchimali (CD29, CD73, CD90 e CD105, ad esempio). Inoltre, l'International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT)21 evidenzia che le ADSC dovrebbero avere una morfologia simile a quella dei fibroblasti e aderire alla plastica della piattaforma di coltura. La morfologia può essere osservata al microscopio durante la coltura in crescita. La caratterizzazione funzionale viene eseguita analizzando il potenziale delle ADSC di differenziarsi in cellule di osteoblasti, adipoblasti e condroblasti. Nella caratterizzazione fenotipica, la percentuale di marcatori mesenchimali ed ematopoietici può variare a seconda della specie animale e della fonte cellulare, non soddisfacendo pienamente i numeri raccomandati dall'ISCT. Ad esempio, l'ISCT raccomanda per le MSC umane l'≥95% di CD105, CD73, CD90 e il ≤2% di CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79a o CD19, Antigene leucocitario umano - Isotipo DR (HLA-DR)21. Inoltre, è importante fare la caratterizzazione funzionale e confermare la multipotenza delle cellule che si differenziano in osteoblasti, condrociti e linee adipocitarie. Almeno due di questi lignaggi sono raccomandati per dimostrare la multipotenza.

Oltre a questi punti evidenziati, alcuni saggi qui suggeriti possono essere sostituiti, ad esempio il rosso di alizarina S invece della colorazione di Von Kossa, il candore acido periodico invece del blu di alciano e la reazione a catena della polimerasi (PCR) invece della citometria a flusso.

Tra i tre tipi di tessuto adiposo descritti nell'uomo (bianco, marrone e beige), il tessuto adiposo bianco ha la più alta fonte di MSC28. Questo tessuto può essere ottenuto dalle regioni sottocutanee, addominali e inguinali, come il grasso sopra l'epididimo qui riportato. La frammentazione fisica e la digestione enzimatica da parte della collagenasi utilizzate nel protocollo qui condiviso derivano dalla frazione vascolare stromale (SVF) composta da molti tipi di cellule, ad eccezione degli adipociti, che vengono esauriti durante il processo.

In conclusione, i principali vantaggi dell'utilizzo del tessuto adiposo come fonte di MSC includono la loro abbondanza e facilità di metodi per l'isolamento cellulare, associati al potenziale terapeutico delle MSC come proprietà antinfiammatorie e rigenerative.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ricerca sostenuta da una sovvenzione del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) e della Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11). Questo studio è stato finanziato in parte dal PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85). MGAG e URS grazie alla borsa di studio concessa rispettivamente dalla Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) e dalla Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
140 ° C Sterilizzazione ad alta temperatura CO2 IncubatoreRADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, CinaC180
3-Isobutil-1-metilxantinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI7018
Acido acetico glacialeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1748
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA9186BioReagent, adatto per la rilevazione di glicoproteine. 1% in acido acetico, pH 2,5
Alcool 70%Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA65350-M70% in acqua
Amfotericina BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1662
Anticorpi anti-topo anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)BD Biosciences, San Diego, CA, USA555005Funzioni nella cellula: Adesione e attivazione, embriogenesi, Leucociti, DC, piastrine, mastociti, fibroblasti e cellule endoteliali
Anticorpi anti-topo anti-CD34 PE (Clone RAM34)BD Biosciences, San Diego, CA, USA551387Funzioni nella cellula: Fattore di adesione cellulare. Cellule staminali ematopoietiche
Anticorpi anti-topo anti-CD45 APC (Clone 30-F11)BD Biosciences, San Diego, CA, USA559864Funzioni nella cellula: Aiuta nell'attivazione dei leucociti
Anticorpi anti-topo anti-CD71 FITC (Clone C2)BD Biosciences, San Diego, CA, USA553266Funzioni nella cellula: Controlla l'assorbimento del ferro durante la proliferazione cellulare. Cellule proliferanti, reticolociti e precursori
Anticorpi anti-topo anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)BD Biosciences, San Diego, CA, USA557266Funzioni nella cellula: Segnalazione, adesione. Linfocita T, NK, monocita, HSC, neurone, fibroblasto
Acido ascorbicoSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1008
Pipette automaticheThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA4700850NFinnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kit
BecherNon applicabile1 unità
albumina sierica bovinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA7906
Piastre per colture cellulari (6 pozzetti)Merck, Darmstadt, GermaniaZ70775907 unità sterili. Piastre per colture tissutali TPP
Piastre per colture cellulari (96 pozzetti. Merck, Darmstadt, GermaniaCLS35307701 unità sterile. Wells, 96, superficie trattata con coltura tissutale (TC), pozzetti chiari a fondo tondo,
terreno condrogenicoDerivazione Pro condrogenesi dello stelo... Life TechnologiesA1007101TGF-β 2, TGF-β 3, desametasone, insulina, transferrina, ITS, sodio-l-ascorbato, piruvato di sodio, ascorbato-2-fosfato
Collagenasi tipo IILife Technologies, California, USA17101015
sughero o polistirolo rivestito in alluminioNon applicabile1 unità
di cotoneNon applicabile50 g
di desametasoneSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD4902
Forbice da dissezioneNon applicabile03 unità DPX sterile
Mountant per istologiaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA6522
Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD5523Con 1000 mg/L di glucosio e L-glutammina, senza bicarbonato di sodio, in polvere, adatto per colture cellulari
Eosina BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA861006
Siero fetale bovino (FBS)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAF4135
FormaldeideSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA47608
FormalinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAHT501128
GentamicinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG1397
HematoxylinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAH3136
Ago ipodermico (0,3 mm x 13 mm)Non applicabile5 unità
IndometacinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI0200000
InsulinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI3536
IsopropanoloSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA56393570% in soluzione H2O
Ketamina-D4 cloridratoSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAK-0061,0 mg/mL in metanolo (come base libera), materiale di riferimento certificato, Cerilliant®
Camera NeubauerSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USACamera di conteggio BR718620BRAND BLAUBRAND Modello Neubauer. Con clip,
puntali per pipette Nichiryo a doppia riga (0,1– 10 μ L)Merck, Darmstadt, GermaniaZ645540Gamma di volume 0,1– 10 μ L, allungato, confezione sfusa. Puntali sterili
per pipette Nichiryo (1– 10 mL)Merck, Darmstadt, GermaniaZ717401Gamma di volume 1– 10 mL, universale, confezione sfusa. Puntali per
pipette sterili Nichiryo (200 μ L)Merck, Darmstadt, GermaniaZ645516Volume massimo 200 μ L, laureato, ministack. Soluzione sterile
di olio-rosso OSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAO13910,5% in isopropanolo
ParaffinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA107.15146– 48, in blocco
Penicillina/StreptomicinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USASoluzione P4333stabilizzata, con 10.000 unità di penicillina e 10 mg di streptomicina/mL, 0,1 μ m filtrato, BioReagent, adatto per colture cellulari
Soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS).Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP3813in polvere, pH 7,4, per la preparazione di soluzioni da 1 L. Provette coniche in polipropilene bilanciate e sterili
(15 mL)Falcon, Fisher Scientific14-959-53AProvette coniche sterili
in polipropilene (50 mL)Falcon, Fisher Scientific14-432-222 unità
bisturi sterile (opzionale)Non applicabile1 unità
Nitrato d'argentoSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA85228
Tiosolfato di sodioSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA72049
Pinzetta chirurgica (15 cm)Non applicabile3 unità
di topi maschi svizzeri sterili (6– 8 settimane)Bioterium, Santa Cruz State University021/22
siringa (1 mL)Non applicabile1 unità
Trypan Blue DyeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT81540,4%, liquido, filtrato sterile, adatto per colture cellulari
Tripsina/EDTA (acido etilendiamminotetraacetico)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT3924
XilazinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR3263
β-glicerofosfato sale disodico idratoSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG9422BioUltra, adatto per colture cellulari, ≥ 99% (titolazione)
di sterile

Riferimenti

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  1. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  2. Pittenger, M., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. npj Regen Med. 4, 22(2019).
  3. Lin, W., et al. Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities. BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).
  4. Mazini, L., et al. Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing. Int J Mol Sci. 21 (4), 1306(2020).
  5. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  6. Uccelli, A., et al. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  7. Dong, J., et al. Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67(2023).
  8. Maffioli, E., et al. Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines. J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).
  9. Akiyama, K., et al. Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis. Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).
  10. Wang, Y., et al. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).
  11. Li, C., et al. Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice. Cell Biosci. 11, 187(2021).
  12. Zhang, J., et al. The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy. Stem Cell Res Ther. 6, 234(2015).
  13. Jurado, M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study. Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).
  14. Zhang, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484(2022).
  15. Fernández, O., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study. PLoS One. 13 (5), 0195891(2018).
  16. Abdolmohammadi, K., et al. Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation. Life Sci. 312, 121206(2023).
  17. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272(2022).
  18. Lee, R. H., et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).
  19. Strem, B. M., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
  20. Kern, S., et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  21. Dominici, M. D., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Berryman, D. E., et al. Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621(2017).
  23. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).
  24. Miranda, V. H. S., et al. Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment. PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635(2020).
  25. Li, H., et al. Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells. Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).
  26. Boregowda, S. V., et al. Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).
  27. Sreejit, P., et al. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  28. Bunnell, B. A. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Cells. 10 (12), 3433(2021).

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