Le cellule mononucleate isolate del sangue periferico possono essere utilizzate per l'analisi delle funzioni e dei disturbi immunitari, delle malattie metaboliche o delle funzioni mitocondriali. In questo lavoro, descriviamo un metodo standardizzato per la preparazione di PBMC da sangue intero e la successiva crioconservazione. La crioconservazione rende questo tempo e questo luogo indipendenti.
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Articolo metodologico
Crioconservazione e valutazione bioenergetica delle cellule mononucleate del sangue periferico umano
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le funzioni fisiologiche delle cellule eucariotiche si basano sull'energia fornita principalmente dai mitocondri. La disfunzione mitocondriale è legata alle malattie metaboliche e all'invecchiamento. La fosforilazione ossidativa gioca un ruolo decisivo, in quanto è fondamentale per il mantenimento dell'omeostasi energetica. Le PBMC sono state identificate come un campione minimamente invasivo per misurare la funzione mitocondriale e hanno dimostrato di riflettere le condizioni della malattia. Tuttavia, la misurazione della funzione bioenergetica mitocondriale può essere limitata da diversi fattori nei campioni umani. I limiti sono la quantità di campioni prelevati, il tempo di campionamento, che spesso è distribuito su più giorni, e le posizioni. La crioconservazione dei campioni raccolti può garantire una raccolta e una misurazione coerenti dei campioni. È necessario prestare attenzione per garantire che i parametri misurati siano comparabili tra le cellule crioconservate e quelle appena preparate. Qui, descriviamo i metodi per isolare e crioconservare le PBMC da campioni di sangue umano per analizzare la funzione bioenergetica dei mitocondri in queste cellule. Le PBMC crioconservate secondo il protocollo qui descritto mostrano solo lievi differenze nel numero di cellule e nella vitalità, nei livelli di adenosina trifosfato e nell'attività della catena respiratoria misurata rispetto alle cellule appena raccolte. Per i preparati descritti sono necessari solo 8-24 ml di sangue umano, il che consente di raccogliere campioni durante gli studi clinici in modo multicentralizzato e di determinarne la bioenergetica in loco.
Introduzione
Le cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) sono utilizzate per varie applicazioni in molti campi scientifici, tra cui lo studio di problematiche immunologiche e bioenergetiche, come quelle legate ai processi di invecchiamento o alle malattie degenerative 1,2. Le PBMC hanno una composizione eterogenea e sono costituite da linfociti (cellule B, cellule T e cellule NK), monociti e cellule dendritiche. Le cellule a volte mostrano grandi differenze e variazioni individuali all'interno di un soggetto, quindi sono necessarie procedure standardizzate per la gestione di queste cellule. Parametri importa....
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Protocollo
Tutti i protocolli descritti in questo manoscritto per la raccolta, l'isolamento e l'analisi del sangue sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Review Board dell'Università di Giessen, in Germania. È stato ottenuto il consenso dei pazienti per includere i loro campioni nello studio. Tutte le fasi per l'isolamento e la coltura cellulare vengono eseguite in una cabina di sicurezza biologica.
1. Puntura venosa
- Preparare tutta l'attrezzatura necessaria per la raccolta del sangue, tra cui spray disinfettante, tampone sterile, cannula per la raccolta del sangue con tubo da 80 mm e adattatore multiplo, laccio....
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Risultati
Vitalità e numero di cellule
Per ottenere il successo dell'isolamento e della crioconservazione, il numero di cellule e la vitalità devono essere i più alti possibile. Prima e dopo la crioconservazione, le cellule vengono contate e la loro vitalità viene determinata per garantire la salute e la qualità delle cellule. La Figura 3 è un'illustrazione rappresentativa delle PBMC prima e dopo la crioconservazione, la conta cellulare e la vitalità non differiscono molto. Ciò ind.......
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Discussione
Questo protocollo fornisce un mezzo per isolare e crioconservare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal sangue umano in modo adatto alle analisi bioenergetiche. Il metodo descritto offre la possibilità di isolare le PBMC in modo delicato e in grandi quantità, con un'elevata vitalità e un numero sufficiente di cellule per le misurazioni bioenergetiche. Ha lo svantaggio che anche con interruzioni minime, si verificano lunghi isolamenti, ma la successiva crioconservazione consente una misurazione della bio.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Ringraziamo l'équipe clinica dell'Ospedale Universitario di Giessen-Marburg per la raccolta del sangue. Questo lavoro è stato finanziato dall'università Justus Liebig.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,1 M Trietanolammina-HCl-tampone (pH = 8,0) | Auto-preparato-0,5 | ||
| M Trietanolammina-HCl-tampone | auto-preparato-1,0 | ||
| m Tris-HCl-tampone (pH = 8,1) | auto-preparato-1,01 | ||
| mM DTBB | auto-10 | ||
| % Triton X-100 | auto-10 | ||
| mM ossalacetato | Auto-preparato-14 | ||
| – 20 G aghi sterili per prelievo di sangue Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt 156353_v | ||
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG-70 | ||
| % Etanolo (EtOH) | Auto-preparato-Acetil | ||
| CoA Pancreac Applichem | A3753 | ||
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Salviette imbevute di alcol | ( 70% alcool isopropilico) | ||
| Antimicina A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | Con MilliQ Academic (autoprodotto) | - | |
| Ascorbato | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Soluzione di separazione | Biochrom | 6115 | |
| Armadio biologico di sicurezza MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonilcianuro-p-trifluorometossi-fenilidrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Contatore di cellule TC20 Contatore di cellule automatizzato | Bio-Rad | ||
| Centrifuga Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Vetrini di conteggio, doppia camera per contatore di cellule | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Spray | |||
| Guanti monouso in lattice, gomma o vinile. | |||
| Distrips (12,5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Etanolo (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80° C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutammato | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Supporto/adattatore | |||
| Incubatrice Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Siringa per iniezione | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Auto-preparato-Mr | ||
| . Frosty Contenitore per congelamento | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Multilettore CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Localizzatore di serbatoi di azoto 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomicina | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Ossalacetato | Sigma-Aldrich-Oxygraph-2K | ||
| Orobororus Instruments | |||
| Penicillina-Streptomicina | PAA | 15140122 | |
| Pipette Performance Pipettor 10 μ L, 100 μ L, 1000 μ L | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodio azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinato | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetrametilfenileniamina (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Laccio emostatico/ Bracciale | |||
| Tris(idrossimetil)ammino-metano | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Pompa a vuoto | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Bagnomaria WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
Riferimenti
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548(2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology. 8 (2), 48(2019).
- Kleiveland, C. R. Peripher....
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Ristampe e permessi
