Guaine di mais staccate per l'imaging su cellule vive dell'infezione da patogeni fungini del mais fogliare

Renata Belisário; Maria F. Torres; Ester A. S. Buiate; Katia V. Xavier; Etta M. Nuckles; Lisa J. Vaillancourt

doi:10.3791/65755

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Articolo metodologico

Guaine di mais staccate per l'imaging su cellule vive dell'infezione da patogeni fungini del mais fogliare

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DOI:

10.3791/65755

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15 settembre 2023

Renata Belisário¹ , Maria F. Torres¹^,² , Ester A. S. Buiate¹^,³ , Katia V. Xavier¹^,⁴ , Etta M. Nuckles¹ , Lisa J. Vaillancourt¹

¹Department of Plant Pathology, University of Kentucky, ²Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, ³Bayer Crop Science, ⁴Everglades Research and Education Center, University of Florida

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto descrive in dettaglio un protocollo di inoculazione ottimizzato che utilizza guaine fogliari di mais staccate per studi citologici, fisiologici e molecolari riproducibili delle interazioni del mais con i patogeni fungini delle piante. Le guaine fogliari facilitano l'osservazione in tempo reale delle interazioni cellulari tra la pianta vivente e il fungo nei tessuti non fissati.

Abstract

Abbiamo ottimizzato un protocollo per inoculare guaine fogliari di mais con funghi patogeni fogliari emibiotrofi e necrotrofi. Il metodo è modificato da quello originariamente applicato alle guaine delle foglie di riso e consente l'osservazione microscopica diretta della crescita e dello sviluppo dei funghi nelle cellule vegetali viventi. Le guaine fogliari raccolte da piantine di mais con due colletti fogliari completamente emersi vengono inoculate con gocce da 20 μL di 5 x 10⁵ spore/mL di sospensioni di spore fungine e incubate in camere di umidità a 23 °C sotto luce fluorescente continua. Dopo 24-72 ore, il tessuto in eccesso viene rimosso con una lama di rasoio per lasciare un singolo strato di cellule epidermiche, un campione otticamente trasparente che può essere visualizzato direttamente senza la necessità di fissazione chimica o pulizia. Le cellule vegetali e fungine rimangono in vita per tutta la durata dell'esperimento e le interazioni possono essere visualizzate in tempo reale. Le guaine possono essere colorate o sottoposte a plasmolisi per studiare la citologia dello sviluppo e la vitalità delle cellule ospiti e patogene durante l'infezione e la colonizzazione. I ceppi fungini trasformati per esprimere proteine fluorescenti possono essere inoculati o co-inoculati sulle guaine per una maggiore risoluzione e per facilitare la valutazione di interazioni competitive o sinergiche. I ceppi fungini che esprimono proteine di fusione fluorescenti possono essere utilizzati per tracciare e quantificare la produzione e il targeting di queste singole proteine nelle piante. I tessuti della guaina inoculati possono essere estratti per caratterizzare acidi nucleici, proteine o metaboliti. L'uso di questi saggi di guaina ha notevolmente fatto progredire gli studi dettagliati dei meccanismi di patogenicità fungina nel mais e anche degli effettori proteici fungini e dei metaboliti secondari che contribuiscono alla patogenicità.

Introduzione

Le analisi spaziali e temporali a livello cellulare sono fondamentali per comprendere la fisiologia e la citologia delle interazioni fungo-pianta. I tessuti fogliari che sono stati fissati chimicamente ^1,2,3 o eliminati e colorati⁴, così come le membrane artificiali ⁵^, sono stati utilizzati in passato per studiare la citologia dello sviluppo dei patogeni fogliari e le interazioni pianta-fungo. Tuttavia, lo studio degli eventi di infezione nei tessuti viventi dell'ospite in tempo reale senza fissazione o chiarificazione è impegna....