Costruzione di modelli di pelle per numerose applicazioni, dalla monocoltura bidimensionale (2D) alla multicoltura tridimensionale (3D)

Sommario

Qui presentiamo procedure semplici ed economiche per introdurre vari modelli di pelle 3D per la ricerca di routine in un laboratorio di coltura cellulare. I ricercatori possono creare modelli su misura per le loro esigenze senza fare affidamento su modelli disponibili in commercio.

Abstract

A causa della struttura complessa e delle importanti funzioni della pelle, è un interessante modello di ricerca per l'industria cosmetica, farmaceutica e medica. Nell'Unione Europea è stato introdotto un divieto totale di testare i prodotti cosmetici e i loro ingredienti sugli animali. Nel caso della medicina e dei prodotti farmaceutici, anche questa possibilità è costantemente limitata. In conformità con il principio delle 3R, sta diventando sempre più comune testare singoli composti e intere formulazioni su modelli creati artificialmente. I più economici e utilizzati sono i modelli 2D, che consistono in un monostrato cellulare ma non riflettono le reali interazioni tra le cellule del tessuto. Sebbene i modelli 3D disponibili in commercio forniscano una migliore rappresentazione del tessuto, non vengono utilizzati su larga scala. Questo perché sono costosi, i tempi di attesa sono piuttosto lunghi e i modelli disponibili sono spesso limitati solo a quelli tipicamente utilizzati.

Al fine di portare la ricerca condotta a un livello superiore, abbiamo ottimizzato le procedure di varie preparazioni di modelli di pelle 3D. Le procedure descritte sono economiche e semplici da preparare in quanto possono essere applicate in numerosi laboratori e da ricercatori con diverse esperienze nella coltura cellulare.

Introduzione

La pelle è una struttura continua con interazioni multicellulari che rivelano il corretto funzionamento e l'omeostasi di questo organo complesso. È costituito da strati morfologicamente diversi: lo strato interno - derma e lo strato esterno - l'epidermide. Sulla parte superiore dell'epidermide, distinguiamo inoltre lo strato corneo (costituito da cellule morte appiattite - corneociti), che fornisce la massima protezione contro l'ambiente esterno. Alcune delle più importanti funzioni passive e attive della pelle sono la protezione del corpo contro i fattori esterni, la partecipazione ai processi immunologici, la secrezione, il riassorbimento, la termoregolazione e il rilevamento ^1,2,3. Poiché è considerato uno degli organi più grandi del corpo, è impossibile evitare il contatto con vari agenti patogeni, allergeni, sostanze chimiche e radiazioni ultraviolette (UV). Pertanto, è strutturato con molti tipi di cellule con funzioni specifiche. I principali tipi di cellule presenti nell'epidermide sono i cheratinociti (quasi il 90% di tutte le cellule, con funzioni strutturali e immunologiche nelle parti più profonde dell'epidermide, ma che successivamente subiscono il processo di cheratinizzazione per trasformarsi in corneociti nello strato superiore dell'epidermide), i melanociti (solo il 3%-7% della popolazione cellulare epidermica, che producono il pigmento protettivo UV melanina) e le cellule di Langerhans (dal sistema immunitario). Nel caso del derma, le cellule principali sono i fibroblasti (che producono fattori di crescita e proteine), le cellule dendritiche e i mastociti (entrambi tipi di cellule del sistema immunitario)^4,5,6. Inoltre, la pelle è dotata di diverse proteine extracellulari (come il collagene di tipo I e IV, la fibronectina e la laminina; Figura 1) e fibre proteiche (collagene ed elastina), che assicurano la struttura specifica della pelle ma incoraggiano anche il legame cellulare, l'adesione cellulare e altre interazioni⁷.

Figura 1: Schema che mostra la struttura della pelle. La struttura della pelle ha caratterizzato quattro tipi di cellule di base che si verificano nei suoi singoli strati e ha distinto le proteine della matrice extracellulare. Questa figura è stata creata con MS PowerPoint. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La sicurezza dei cosmetici e dei prodotti farmaceutici è una questione molto importante e la tutela della salute dei consumatori e dei pazienti è una priorità⁸. Fino a poco tempo fa, si supponeva che fosse garantita da numerosi test, tra cui studi condotti sugli animali. Purtroppo, questi spesso richiedevano l'uso di metodi drastici, causando dolore e sofferenza negli animali utilizzati per scopi di ricerca (spesso topi, ratti e maiali). Nel 1959 furono introdotti i principi della tecnica sperimentale umanitaria (il principio delle 3R): (1 - Sostituzione) sostituendo gli animali nella ricerca con modelli in vitro, in sillico o ex vivo , (2 - Riduzione) riducendo il numero di animali utilizzati per la ricerca e (3 - Perfezionamento) migliorando il benessere degli animali che sono ancora necessari per la ricerca e allo stesso tempo migliorando i metodi alternativi sviluppati⁹. Inoltre, nell'Unione Europea (UE), i test cosmetici sugli animali sono regolamentati dalla legge. Dall'11 settembre 2004 è entrato in vigore il divieto di prodotti cosmetici testati sugli animali. L'11 marzo 2009, l'UE ha vietato la sperimentazione animale degli ingredienti cosmetici. Non era consentita la vendita di prodotti cosmetici realizzati con ingredienti appena testati sugli animali; Tuttavia, era ancora accettabile testare i prodotti sugli animali per problemi complessi di salute umana, come la tossicità a dosi ripetute, la tossicità riproduttiva e la tossicocinetica. A partire dall'11 marzo 2013, nell'UE è illegale vendere cosmetici in cui il prodotto finito o i suoi ingredienti sono stati testati sugli animali¹⁰. Pertanto, attualmente, in cosmetologia, la ricerca si svolge a tre livelli: in vitro (cellule), ex vivo (tessuti reali) e in vivo (volontari)¹¹. Nel caso dei prodotti farmaceutici, permane la necessità di effettuare test sugli animali; tuttavia, è significativamente ridotto e rigorosamente controllato¹².

Come metodi alternativi alla sperimentazione animale e per la valutazione iniziale dell'efficacia di un nuovo principio attivo, vengono utilizzate le colture di cellule cutanee in vitro . L'isolamento di diversi tipi di cellule cutanee e la loro coltivazione in condizioni di laboratorio sterili consente di valutare la sicurezza e la tossicità delle sostanze attive. Le linee cellulari della pelle sono anche modelli ampiamente riconosciuti per la ricerca in quanto le cellule sono vendute da aziende certificate e i risultati possono essere comparabili in diversi laboratori. Questi test vengono solitamente eseguiti su semplici modelli 2D di monocolture di cellule della pelle umana. Alcuni dei modelli più avanzati sono le loro co-colture (come i cheratinociti con fibroblasti e i cheratinociti con i melanociti), così come i modelli tridimensionali, comprese le colture prive di scaffold (sfere) e gli equivalenti cutanei basati su scaffold dell'epidermide, del derma o anche i sostituti a tutto spessore della pelle¹³. Vale la pena ricordare che, a parte l'ultimo tipo (equivalenti cutanei), il resto non è disponibile in commercio e, se necessario, uno scienziato deve prepararli da solo.

Anche se molti di questi modelli sono stati mantenuti e sono regolarmente venduti al giorno d'oggi (Tabella 1), sono costantemente necessari ulteriori modelli per convalidare la maggior parte dei risultati. Pertanto, i modelli di nuova concezione dovrebbero ricreare meglio le interazioni reali che avvengono nel corpo umano. Quando una miscela di cellule di diverso tipo viene utilizzata per formare tali modelli, è possibile ottenere la riproduzione dell'aspetto multicellulare del tessuto in vivo . Di conseguenza, si sviluppa una coltura organotipica (Figura 2).

	Nome		Descrizione
Pelle normale	EpiSkin		Epidermide umana ricostruita - Cheratinociti su una membrana di collagene
	SkinEthic RHE		Epidermide umana ricostruita - Cheratinociti su membrana in policarbonato
	SkinEthic RHE-LC		Modello epidermico umano Cellule di Langerhans - Cheratinociti e cellule di Langerhans su una membrana in policarbonato
	SkinEthic RHPE		Epidermide Pigmentata Umana Ricostruita - Cheratinociti e Melanociti su membrana in policarbonato
	T-Pelle		Modello di pelle umana a tutto spessore ricostruita - Cheratinociti su uno strato di fibroblasti, che sono stati cresciuti su una membrana in policarbonato
	Modello Phenion FT Skin		Cheratinociti e fibroblasti in idrogel
Pelle con una malattia	Modello di pelle di melanoma FT		Cheratinociti e fibroblasti normali di derivazione umana con linea cellulare di melanoma maligno umano A375
	Modello di tessuto tissutale per psoriasi		Cheratinociti e fibroblasti umani normali

Tabella 1: Gli equivalenti cutanei commerciali più popolari per vari studi.

Figura 2: Complessità di diversi modelli in vitro . La relazione tra la complessità di diversi modelli in vitro per ricreare un organismo e le interazioni reali che avvengono direttamente nel corpo umano. La figura è stata modificata dal set "Microbiologia e coltura cellulare" di Servier Medical Art di Servier (https://smart.servier.com/). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Uno dei limiti più importanti degli equivalenti commerciali è la disponibilità di modelli di ricerca molto generici con pochi tipi di cellule (tipicamente 1-2, raramente 3). Tuttavia, ci sono molte più cellule presenti nella pelle e la loro interazione tra loro può garantire una migliore o peggiore tolleranza ai vari ingredienti¹⁴. La mancanza di alcuni componenti immunitari può diminuire il suo valore in diversi tipi di ricerca, inclusa l'immunoterapia. Questo è un problema serio in quanto il melanoma è un tumore della pelle pericoloso per la vita a causa dell'insorgenza precoce di metastasi e della frequente resistenza al trattamento applicato¹⁵. Per migliorare il modello di pelle artificiale, i ricercatori cercano di stabilire una co-coltura di cellule immunitarie con linee cellulari e organoidi¹⁶ e questo è considerato un grande miglioramento dei modelli studiati. Ad esempio, i mastociti partecipano a molti processi fisiologici (guarigione delle ferite, rimodellamento dei tessuti) e patologici (infiammazione, angiogenesi e progressione tumorale) della pelle¹⁷. Pertanto, la loro presenza nel modello può modificare significativamente la risposta del modello al composto studiato. Infine, mancano ancora molte informazioni relative alla pelle, che possono essere scoperte solo eseguendo ricerche di base. Questo è il motivo per cui la creazione e il perfezionamento di diversi modelli di pelle artificiale (Tabella 2) è un'impresa così importante. Questo articolo presenta diverse procedure per creare modelli di pelle avanzati, tra cui sfere e equivalenti di pelle.

Modello di pelle in vitro	Tentativo di ricreare le interazioni che si verificano nel tessuto	Esempi delle celle utilizzate
Colture cellulari 2D o 3D	Epidermide	Cheratinociti
		Melanociti
		Cheratinociti + Melanociti
	Derma	Fibroblasti
		Mastociti
		Fibroblasti + Mastociti
	Pelle	Cheratinociti + Fibroblasti
		Cheratinociti + Mastociti
		Melanociti + Fibroblasti
		Melanociti + Mastociti
		Cheratinociti + Fibroblasti + Melanociti
		Cheratinociti + Fibroblasti + Mastociti

Tabella 2: Esempi di miscela di tipi cellulari per ricreare il tessuto cutaneo in coltura 2D e 3D.

Protocollo

Lo studio è stato condotto secondo le linee guida della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico dell'Università di Medicina di Varsavia (KB/7/2022). Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti coinvolti nello studio.

NOTA: Le procedure descritte della preparazione avanzata del modello cutaneo possono essere eseguite con l'uso di cellule cutanee primarie e linee cellulari disponibili in commercio o con le cellule primarie isolate dai pazienti. Le celle commerciali vengono fornite con i documenti pertinenti e il loro utilizzo nella ricerca per la maggior parte dei paesi non richiede alcuna approvazione aggiuntiva. Tuttavia, per alcuni paesi, è obbligatorio, quindi deve essere verificato con i regolamenti del Comitato Etico Locale. Se le cellule primarie isolate dai pazienti devono essere utilizzate nella ricerca, in primo luogo, lo studio deve essere approvato dal Comitato Etico Locale e deve essere condotto secondo le loro rigide linee guida. Inoltre, il consenso informato scritto deve essere raccolto da tutti i donatori di tessuto cutaneo. L'isolamento delle cellule primarie della pelle non è stato l'argomento di questo articolo, ma procedure di isolamento esemplari possono essere trovate in Kosten et al. (cheratinociti)¹⁸, Ścieżyńska et al. (melanociti)¹⁹, Kröger et al. (fibroblasti e mastociti)²⁰. La maggior parte delle normali cellule cutanee e linee cellulari hanno un livello di sicurezza di classe BSL1; Non causano alcuna minaccia. Tuttavia, l'attrezzatura di laboratorio utilizzata deve soddisfare gli standard per la coltura di cellule animali e umane in condizioni controllate.

1. Coltura cellulare della pelle

NOTA: Le colture cellulari cutanee devono essere effettuate in fiasche dedicate a cellule aderenti o in sospensione (a seconda del tipo di cellula) a 37 °C e con un contenuto di anidride carbonica del 5% in un incubatore. Le attività legate alla loro coltivazione e all'uso per la ricerca richiedono condizioni sterili e devono essere eseguite in camera laminare dopo l'esposizione ai raggi ultravioletti C (UVC) per 15-30 minuti. L'ottenimento di sospensioni cellulari, che vengono poi utilizzate per creare i modelli bidimensionali e tridimensionali, richiede l'attuazione di procedure a seconda del tipo di cellula (per le cellule aderenti come cheratinociti, fibroblasti e melanociti - fase 1.1, per le cellule non aderenti dei mastociti - fase 1.2) (Figura 3). Per le diverse dimensioni dei palloni di coltura, i volumi di tutti i reagenti (come il terreno, la soluzione salina tamponata con fosfato o la soluzione di tripsina) utilizzati nei metodi descritti sono elencati nella Tabella 3. I parametri che dipendono dal tipo di cellule (ad esempio, concentrazione e composizione dei reagenti, metodo di centrifugazione, ecc.) sono ordinati nella Tabella 4. Le densità delle celle utilizzate per la semina sono mostrate nella Tabella 5. Tutte queste tabelle sono incluse alla fine di questa sezione.

Figura 3: Coltivazione di cellule aderenti e non aderenti. La procedura generale passo dopo passo per la coltura di cellule aderenti e non aderenti (i numeri corrispondono alle descrizioni delle fasi 1.1 e 1.2). La figura è stata creata con MS PowerPoint. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Ottenimento di una sospensione di cellule aderenti
   1. Rimuovere il terreno dal matraccio di coltura.
   2. Lavare delicatamente le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, Tabella 3).
   3. Aggiungere la soluzione di tripsina nell'acido etilendiamminico tetraacetico (soluzione di tripsina-EDTA, Tabella 3). Incubare il matraccio a 37 °C e controllare il distacco delle cellule dalla superficie al microscopio ottico.
   4. Sospendere le cellule staccate in almeno una quantità doppia di terreno di coltura a pieno sviluppo o neutralizzatore di tripsina per disattivare la tripsina (2:1) (per i volumi, fare riferimento alla Tabella 3 e per i reagenti, fare riferimento alla Tabella 4). Trasferire quantitativamente il contenuto del matraccio nella provetta da 15 mL.
   5. Prelevare un piccolo volume (20 μL) di sospensione cellulare in una provetta da 1,5 mL e contare le cellule con un emocitometro manuale o automatico.
   6. Centrifugare la provetta (parametri nella Tabella 4), rimuovere la maggior parte del surnatante e risospendere il pellet di cella nella piccola quantità di liquido rimanente. Quindi, aggiungere una quantità sufficiente di terreno fresco per ottenere il volume di pre-centrifugazione (volume nella tabella 3) se la densità cellulare è appropriata per la semina o ricalcolare il volume richiesto del nuovo terreno.
      NOTA: Alcune cellule, come i melanociti, sono molto sensibili alla centrifugazione, quindi evitano la necessità di centrifugarle nuovamente in breve tempo.
   7. Preparare la sospensione cellulare della densità richiesta (cellule/mL, densità cellulare nella Tabella 5) per l'esperimento (mono o multicolture 2D/3D di cellule cutanee).
      NOTA: Se le cellule devono essere ulteriormente coltivate, rimettere 5.000-8.000 cellule/mL in un nuovo pallone e aggiungere terreno fresco (volume nella Tabella 3).
2. Ottenimento di una sospensione di cellule non aderenti
   1. Rimuovere il terreno con la sospensione cellulare dal pallone di coltura e trasferirlo quantitativamente nella provetta da 15 mL.
   2. Prelevare un piccolo volume (20 μl) della sospensione cellulare in una nuova provetta da 1,5 mL. Contare le cellule con un emocitometro manuale o automatico.
   3. Centrifugare la provetta (parametri nella Tabella 4), rimuovere la maggior parte del surnatante e risospendere le cellule in una piccola quantità del liquido rimanente. Quindi, aggiungere un terreno fresco per ottenere il volume di pre-centrifugazione (come indicato nella Tabella 3) se la densità cellulare è appropriata per la semina o ricalcolare il volume richiesto del nuovo terreno.
   4. Preparare la sospensione cellulare della densità richiesta (cellule per mL, come suggerito nella Tabella 5) per l'esperimento (mono o multicolture 2D/3D di cellule cutanee).
      NOTA: Se le cellule devono essere ulteriormente coltivate, rimettere 5.000-8.000 cellule/mL in un nuovo pallone e aggiungere un terreno fresco.

    

	25 palloni di coltura da25 cm	2 fiasche di coltura da 75 cm
Terreno di coltura [mL]	4–5	8–12
PBS [mL]	5	10
Tripsina-EDTA [mL]	0.5–1	1–2
Mezzo di neutralizzazione [mL]	1–2	2–4

Tabella 3: Volumi dei reagenti utilizzati durante la coltivazione e la preparazione delle sospensioni cellulari.

Monocoltura di cellule cutanee	Tripsina	Disattivatore della tripsina	Centrifugazione	Tipo medio per monocoltura 2D
Cheratinociti	0.25%	con neutralizzatore di tripsina	300 x g, 5 min, RT	Terreno di crescita dei cheratinociti 2
Fibroblasti	0.25%	con mezzo	300 x g, 5 min, RT	DMEM, 10% FBS
Melanociti	0.025%	con neutralizzatore di tripsina	300 x g, 3 min, RT	Medium 254, integratore per la crescita dei melanociti umani senza PMA-2
Mastociti	non richiesto	non richiesto	300 x g, 3 min, RT	IMDM, 10% FBS, 1% aminoacidi non essenziali, 226 μM α-monotioglicerolo

Tabella 4: La tripsinizzazione, i parametri di centrifugazione e il tipo di terreno dipendono dal tipo di cella.

Tipo di modello		Densità cellulare [cellule/mL]
2D	Monostrato	Fibroblasti	2 x 105
		Mastociti
		Cheratinociti
		Melanociti
3D	Sfera (metodo a goccia sospesa)	Fibroblasti	5 x 105
		Mastociti
		Cheratinociti
		Melanociti
		Mix di cellule
	Sfera (metodo di limitazione dell'adesione cellulare)	Fibroblasti	2 x 105
		Mastociti
		Cheratinociti
		Melanociti
		Mix di cellule
	Equivalente	Fibroblasti	1 x 105
		Mastociti	1 x 104
		Cheratinociti	8 x 105
		Melanociti	5 x 104

Tabella 5: Densità di semina cellulare per diversi tipi di modelli di pelle.

2. Preparazione delle sfere cellulari della pelle

NOTA: Per creare sfere, l'uso del metodo della goccia sospesa è descritto nel passaggio 2.1 (Figura 4), mentre l'approccio incentrato sulla limitazione dell'adesione cellulare è mostrato nel passaggio 2.2 (Figura 5). Tuttavia, poiché le sfere sono molto piccole e possono essere instabili, le attività svolte con questi metodi richiedono pazienza, delicatezza e azioni lente.

1. Il metodo della goccia sospesa
   1. Utilizzare una densità cellulare appropriata per ottenere la dimensione della sfera desiderata (densità cellulare consigliata 5 x 10⁵ cellule/mL, Tabella 5).
   2. Pipettare 20 μl della sospensione cellulare sul coperchio di una piastra di Petri o di una piastra a più pozzetti (Figura 4A).
   3. Coprire il piatto/piatto con la parte inferiore e capovolgerlo delicatamente (si creeranno automaticamente gocce pendenti sui coperchi, Figura 4B).
   4. Riempire la capsula/i pozzetti di Petri della piastra con una soluzione sterile di acqua/PBS per evitare l'evaporazione del terreno dalle goccioline.
   5. Incubare le goccioline per 48-72 h a 37 °C.
      NOTA: La gravità tira le cellule verso il basso e la mancanza di superficie accessibile impedisce l'adesione delle cellule al vaso e favorisce l'aggregazione cellulare. Tuttavia, alcuni tipi di cellule possono richiedere un'incubazione più lunga.
   6. Prima di eseguire il passaggio successivo, riempire i pozzetti della nuova piastra (o utilizzare la vecchia piastra con acqua/PBS rimossa dai pozzetti) con il terreno di crescita completo (100 μL).
      NOTA: Prima del passaggio successivo, prelevare puntali da 200 μl, rimuovere 1/5 di ciascuna estremità del puntale e sterilizzare prima dell'uso.
   7. Trasferire le sfere cellulari nei pozzetti della piastra a più pozzetti utilizzando puntali per pipette sterili con un'estremità tagliata. Prelevare puntali da 200 μl, rimuovere 1/5 di ciascuna estremità del puntale e sterilizzarli prima dell'uso (Figura 4C).
      NOTA: Questo passaggio può essere difficile, poiché il flusso di liquido durante il capovolgimento del piatto/piatto può danneggiare le sfere.
   8. Incubare le sfere trasferite per 1 giorno nella piastra a più pozzetti a 37 °C prima di eseguire ulteriori esperimenti (ad esempio, aggiunta di composti, saggi di citotossicità, introduzione di sfere agli equivalenti) (Figura 4D).
2. Il metodo per limitare l'adesione cellulare
   1. Prima della semina cellulare, coprire i pozzetti della piastra con fondo a U con una soluzione tensioattiva (ad es. Pluronic F-127, polietilenglicole, alcool polivinilico)²¹. Preparare e aggiungere 100 μl di soluzione di tensioattivo all'1% in PBS in ciascun pozzetto. Incubare la piastra con la soluzione per 24 ore a 37 °C (Figura 5A-C). Conservare la piastra più a lungo, se necessario, ma mantenere il livello del fluido aggiungendo altro tampone PBS.
   2. Preparare la sospensione cellulare nella densità cellulare desiderata in 50 μl per pozzetto (densità cellulare consigliata durante la semina di 2 x 10⁵/mL, Tabella 5).
   3. Rimuovere la soluzione di tensioattivo dai pozzetti prima di seminare le cellule per evitare la rottura della membrana cellulare mediante lisi (Figura 5D).
   4. Aggiungere la soluzione cellulare alla piastra e incubare per 24 ore a 37 °C per ottenere aggregati cellulari (Figura 5E). Dopo circa 1-3 giorni, si formeranno delle sfere (Figura 5F) e saranno pronte per l'uso per ulteriori esperimenti.

Figura 4: Il metodo della goccia sospesa. (A) pipettare la sospensione cellulare sul coperchio e coprire il coperchio con la parte inferiore della capsula; (B) ruotando il piatto per creare le gocce pendenti; (C) aggiunta di acqua/PBS nella parte inferiore della capsula (limitando l'evaporazione del liquido); (D) incubazione delle piastre con gocce pendenti per creare sfere cellulari; (E) raccolta di goccioline con sfere formate e stabilizzazione di sfere trasferite in piastre multipozzetto. La figura è stata creata con Biorender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Preparazione passo-passo delle sfere con il metodo di adesione cellulare limitante. (A) Pozzetto con fondo a U; (B,C) limitazione dell'adesione cellulare mediante soluzione tensioattiva; (D) rimozione della soluzione dai pozzi; (E) cellule di semina; (F) aggregazione di cellule e formazione di una sfera. La figura è stata creata con Biorender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Preparazione di equivalenti cutanei a tutto spessore

NOTA: Lo sviluppo degli equivalenti cutanei a tutto spessore (epidermide e derma) può essere suddiviso in tre fasi (Figura 6): la preparazione dello strato di derma artificiale con la presenza di cellule dermiche tipiche (come fibroblasti e mastociti, Figura 6A), semina delle cellule incluse nell'epidermide artificiale (principalmente cheratinociti e melanociti, Figura 6B) e crescita verticale dei cheratinociti con un possibile processo di cheratinizzazione (formazione dello strato corneo, Figura 6C). La preparazione degli equivalenti cutanei a tutto spessore è descritta al punto 3.1 (3.1.1-3.1.10). Se è necessario un equivalente cutaneo meno avanzato (ad esempio, solo il tipo di epidermide), il tipo di cellula selezionato (come i cheratinociti) può essere seminato direttamente sulle membrane di collagene o policarbonato disponibili in commercio e anche coltivato con la possibilità di indurre il processo di cheratinizzazione (passare direttamente ai passaggi 3.1.9-3.1.10).

Figura 6: Preparazione passo dopo passo di equivalenti cutanei a tutto spessore in inserti. (A) preparazione dello strato pseudo-dermico con cellule dermiche, (B) semina di cellule epidermiche, (C) ulteriore coltura di equivalente in terreno, (D) coltura di interfaccia aria-liquido favorisce la formazione di epitelio stratificato. La figura è stata creata con Biorender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione di equivalenti cutanei a tutto spessore in una piastra a 24 pozzetti
   1. Posizionare i tubi con acqua, PBS (10x), 1 M NaOH e soluzione di collagene di tipo I sul ghiaccio.
   2. Determinare un numero corretto di cellule dermiche (ad esempio, fibroblasti e mastociti; in un rapporto di 10:1) da seminare nell'idrogel. Trasferire un numero adeguato di cellule dermiche in una provetta da 1,5 mL (500 μL di fibroblasti e 500 μL di mastociti, in base alle densità cellulari nella Tabella 5) e centrifugare le cellule (300 x g, 3 min, RT).
   3. Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente le cellule nella miscela di 695 μL di acqua/100 μL di PBS (10x)/ 5 μL di NaOH.
      NOTA: Se 1 mL della soluzione totale non è sufficiente, utilizzare la Tabella 6 per ricalcolare i volumi di ciascun reagente.
   4. Aggiungere 200 μl di soluzione di collagene alla miscela e miscelarla delicatamente mediante pipettaggio.
      NOTA: Fate attenzione, in quanto la consistenza del composto risulterà densa.
   5. Aggiungere 200 μl della miscela preparata all'inserto in una piastra a 24 pozzetti. Per un modello senza strato corneo, aggiungere 500 μl a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti.
   6. Incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) e poi trasferirla nell'incubatore per 30 minuti.
      NOTA: Controllare se l'idrogel si è polimerizzato prima di qualsiasi altra azione.
   7. Prima della semina delle cellule sulla superficie dell'idrogel, sciacquarlo con un tampone PBS (500 μL/pozzetto).
   8. Determinare il numero corretto di cellule epidermiche (ad esempio, cheratinociti e melanociti, in un rapporto di 15:1) da seminare sopra l'idrogel. Preparare la miscela cellulare in 500 μL di terreno DMEM integrato con il 10% di FBS (aggiungere 250 μL di cheratinociti e 250 μL di melanociti, le densità cellulari sono menzionate nella Tabella 4) e aggiungerla delicatamente ai pozzetti.
      NOTA: In alcuni casi, è meglio seminare prima i melanociti e lasciarli diffondere bene sull'idrogel e, dopo altre 24 ore, rimuovere il terreno e seminare i cheratinociti. In tal caso, aggiungere 250 μl di sospensione cellulare e 250 μl di terreno.
   9. Incubare le piastre a 37 °C per 2-5 giorni, a seconda della velocità di crescita cellulare, con scambio medio (con una concentrazione decrescente di FBS dal 10% fino all'1%) ogni 48 ore e monitoraggio cellulare eseguito al microscopio ottico.
   10. Se il processo di cheratinizzazione deve essere indotto dopo aver ottenuto un monostrato di cheratinociti sopra l'idrogel, utilizzare il terreno privo di FBS integrato con ioni calcio e acido L-ascorbico per altre 2-7 settimane (nella concentrazione di 1,5 μM di CaCl₂ e 50 μg/mL di acido L-ascorbico).
       NOTA: Il tempo di incubazione dipende dai cheratinociti utilizzati e dalla loro velocità di differenziazione.

Reagente	L'equazione per calcolare il volume di un reagente		Esempi di calcolo
			(per un volume finale = Vtotale di 1 mL)
soluzione di collagene di tipo I			(Ccollagene = 10 mg/mL)
			0,2 mL = 200 μL
PBS (10x)			0,1 mL = 100 μL
1 M NaOH			0,005 mL = 5 μL
sterile H2O			0,695 mL = 695 μL

Tabella 6: Calcolo dei volumi di reagenti necessari per la preparazione di idrogel di collagene di tipo I da 2 mg/mL.

4. Identificazione dei tipi di cellule in un modello 3D di pelle mediante metodi di colorazione cellulare

NOTA: Per confermare che il modello di pelle sviluppato è costituito dalle cellule previste, è bene eseguire la colorazione cellulare. Si tratta di un passaggio cruciale prima che qualsiasi esperimento target possa essere eseguito su un dato modello²². Nel caso di modelli 3D di pelle, è necessario incorporare un dato modello in paraffina e preparare vetrini microscopici con il tessuto artificiale tagliato su un microtomo (passaggio 4.1) prima della colorazione cellulare (Figura 7).

Figura 7: Passaggi di base di un modello 3D di pelle incorporato, colorazione cellulare e osservazioni microscopiche. La figura è stata creata con Biorender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Incorporamento di modelli di pelle 3D
   1. Lavare l'equivalente cutaneo con PBS per 5 minuti a RT due volte e fissarlo utilizzando una soluzione di paraformaldeide al 3,7% in PBS (30 min, RT). Ripetere la fase di lavaggio con PBS.
   2. Prima dell'inclusione, disidratare l'equivalente cutaneo incubando in concentrazioni crescenti di soluzioni di etanolo: 50% (15 min), 70% (15 min), 96% (2x, 30 min) e 99,8% (2x, 30 min).
   3. Mettere l'equivalente pelle fissa e disidratata nello stampo riempito di paraffina.
      NOTA: Posizionare l'equivalente con un orientamento appropriato.
   4. Coprite lo stampo con la cassetta e aggiungete altra paraffina. Lasciarlo solidificare per un massimo di 30 minuti a RT.
   5. Congelare l'equivalente cutaneo incorporato in paraffina per almeno 1 ora a -80 °C.
   6. Accendere il microtomo, inserire l'equivalente cutaneo incorporato in paraffina e tagliare fette da 5 μm. Posizionare le fette di tessuto artificiale tagliate sui vetrini microscopici e asciugarle per almeno 8 ore a 37 °C.
   7. Immergere i vetrini nello xilene (2 volte, 10 minuti) e quindi reidratare i vetrini con le concentrazioni decrescenti di etanolo 99,8% (5 minuti), 96% (5 minuti), 70% (5 minuti) e 50% (5 minuti).
   8. Rimuovere i vetrini dalla soluzione di etanolo e sciacquarli due volte con acqua (5 min).
      NOTA: La colorazione cellulare tradizionale viene eseguita applicando coloranti specifici (ematossilina, eosina²³) o utilizzando anticorpi che mirano selettivamente ai biomarcatori (tra cui il collagene 1A2 per i fibroblasti, la citocheratina 14 per i cheratinociti, la melan-A o la tirosinasi per i melanociti²⁴). Una colorazione di routine con ematossilina ed eosina può essere effettuata seguendo i protocolli preparati da diverse aziende (passaggio 4.2). D'altra parte, se è necessaria la colorazione immunofluorescente o immunoistochimica, la procedura è diversa e significativamente più lunga (passaggi 4.3 e 4.4). Per evitare reazioni aspecifiche, utilizzare gli anticorpi primari prodotti in specie diverse e successivamente gli anticorpi secondari dedicati.
2. Colorazione con ematossilina ed eosina di modelli 3D di pelle
   1. Colorare il vetrino microscopico in soluzione di ematossilina per 3 minuti a RT.
   2. Lavare i vetrini in una soluzione alcolica acidificata per 1 minuto.
      NOTA: Preparare la soluzione alcolica acidificata mescolando 2 mL di acido cloridrico al 35%-38% con 98 mL di alcol etilico al 99,8%.
   3. Successivamente, lavare il vetrino in una soluzione di bicarbonato di sodio allo 0,1% per ottenere un colore blu-viola visibile e delicato.
      NOTA: Per ottenere una soluzione di bicarbonato di sodio allo 0,1%, sciogliere 100 mg di bicarbonato di sodio in 100 ml di acqua ultrapura.
   4. Lavare i vetrini con etanolo al 95% per 1 minuto.
   5. Colorare il vetrino microscopico in soluzione di eosina per 1 minuto a RT.
   6. Lavare i vetrini con etanolo al 95% per 1 minuto ed etanolo al 99,8% per 2 minuti.
   7. Lavare due volte i vetrini con xilene per 2 minuti ciascuno.
   8. Montare in balsamo e mettere un vetrino coprioggetti nella parte superiore del vetrino. I campioni sono pronti per le osservazioni microscopiche.
3. Colorazione immunofluorescente di modelli cutanei 3D
   1. Sciacquare il vetrino con PBS (5 min).
   2. Preparare la soluzione bloccante (albumina sierica bovina al 3% [BSA] o latte scremato in un tampone PBS con l'aggiunta di Triton X-100 allo 0,1% e Tween 20 allo 0,1%) e incubare il vetrino per 1 ora a RT.
   3. Lavare i vetrini due volte con un tampone PBS (5 min).
   4. Diluire l'anticorpo primario nel tampone PBS (secondo le raccomandazioni del produttore, Tabella 7) e incubare i vetrini per 1-2 ore a RT o per una notte a 4 °C.
   5. Lavare i vetrini due volte con un tampone PBS (5 min).
   6. Diluire l'anticorpo secondario nel tampone PBS (secondo le raccomandazioni del produttore, Tabella 7) e incubare i vetrini per 1 ora a RT.
   7. Lavare i vetrini due volte con PBS (5 min).
   8. Preparare la soluzione colorante per la colorazione dei nuclei (ad es. Hoechst 33342 o DAPI, Tabella 7) e incubare i vetrini per un massimo di 15 minuti a RT.
   9. Lavare i vetrini con PBS (5 min).
   10. Montare in balsamo, coprire la sezione con un vetrino coprioggetti e visualizzare gli effetti della colorazione cellulare utilizzando un microscopio a fluorescenza.
4. Colorazione immunoistochimica di modelli cutanei 3D
   1. Eseguire i passaggi 4.3.1-4.3.5.
   2. Inoltre, eseguire una fase di lavaggio con un tampone appropriato per l'enzima con cui è coniugato l'anticorpo secondario.
   3. Diluire l'anticorpo secondario in un tampone appropriato per l'enzima coniugato (secondo le raccomandazioni del produttore) e incubare i vetrini per 1 ora a RT.
   4. Lavare i vetrini due volte con PBS (5 min).
   5. Preparare la soluzione di un substrato adeguato per l'enzima utilizzato e incubare i vetrini secondo le raccomandazioni del produttore.
   6. Lavare i vetrini con un tampone (5 min) e montarli in balsamo.
   7. Visualizza gli effetti della colorazione cellulare utilizzando la microscopia a campo chiaro.

Tipo di cellula/organoide cellulare rilevato	Agente colorante			Diluizione / Concentrazione
Mastociti	Avidin-sulforhodamina 101			1 μg/mL
Fibroblasti	Anticorpo Col1A2 prodotto nel coniglio			1:50
	Anticorpo secondario anti-coniglio di capra coniugato con FITC			1:250
Cheratinociti	Anticorpo della citocheratina 14 prodotto nel topo			1:50
	Anticorpo secondario anti-topo di capra coniugato con FITC			1:250
Melanociti	Anticorpo Melan-A prodotto nel topo			1:50
	Anticorpo secondario anti-topo di capra coniugato con FITC			1:250
Nuclei	Hoechst 33342			1 μg/mL
	DAPI			1 μg/mL

Tabella 7: Concentrazioni e diluizioni dei reagenti utilizzati per la colorazione cellulare.

Risultati

Prima di iniziare a creare modelli di pelle in laboratorio, è necessario prendere una decisione sul tipo di cellule da utilizzare (primarie/linea cellulare) e la selezione di un terreno appropriato per queste cellule. La maggior parte delle banche cellulari raccomanda e può fornire terreni per tutti i tipi di coltura cellulare. Nel caso di un modello multicoltura, è necessario selezionare un terreno che si adatti a tutti i tipi di cellule presenti nella coltura. Alcuni terreni cellulari tipici utilizzati sia per la coltura di cellule cutanee primarie che per le linee cellulari cutanee più comuni sono stati raccolti nella Tabella 8, 18,19,20,25,26,27. I terreni tipici utilizzati per le colture cellulari primarie sono piuttosto costosi e la loro composizione è complessa. D'altra parte, le linee cellulari sono solitamente soddisfatte con terreni con una composizione semplice. Alcuni tipi di cellule (principalmente fibroblasti e mastociti) possono produrre e secernere fattori che stimolano la crescita di altre cellule (come cheratinociti e melanociti)^28,29. Se è prevista la loro presenza in un modello, non è necessaria un'ulteriore integrazione del mezzo.

Tipo di cella	Nome cella		Medio				Riferimento
Cheratinociti	Linea cel HaCaT		DMEM, 10% FBS, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina				Secondo il venditore
	cheratinociti epidermici umani normali primari (NHEK)		Terreno di crescita dei cheratinociti 2 (terreno basale + mix di integratori)				Secondo il venditore
	cheratinociti epidermici umani primari; Normale, Adulto (HEKa)		Terreno basale a cellule dermiche, 0,4% estratto ipofisario bovino, 0,5 ng/mL di fattore di crescita trasformante rh-alfa, 6 mM di L-glutammina, 100 ng/mL di idrocortisone emiuccinato, 5 mg/mL di insulina rh, 1 mM di adrenalina, 5 mg/mL di Apo-transferrina, 100 U/mL di penicillina (se necessario), 100 μg/mL di streptomicina (se necessario)				Secondo il venditore
	cheratinociti primari		DMEM/F-12 (3:1), 1% Ultroser G, 1 μM di idrocortisone, 1 μM di isoproterenolo, 0,1 μM di insulina, 1 ng/mL di fattore di crescita dei cheratinociti, 1% di penicillina-streptomicina				18
Melanociti	melanociti primari		Medium 254, integratore per la crescita dei melanociti umani senza PMA-2, soluzione antibiotica all'1%				19
	melanociti primari		RPMI-1640, 10% FBS, 14,7 μg/mL di soluzione di rosso fenolo, 1% L-glutammina, 1% penicillina/streptomicina				27
	Linea cellulare HEMa-LP		Terreno 254, 5 μg/mL di insulina rh, 50 μg/mL di acido ascorbico, 6 mM di L-glutammina, 1 μM di epinefrina, 1,5 mM di cloruro di calcio, 100 U/mL di penicillina (se necessario), 100 μg/mL di streptomicina (se necessario)				Secondo il venditore
	Melanociti epidermici umani normali primari (NHEM)		Melanocyte Growth Medium (terreno basale + mix di integratori)				Secondo il venditore
Fibroblasti	Fibroblasti primari del tenone umano (HTF)		EMEM, 5% FBS, 5 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti rh-basici, 5 μg/mL di insulina rh, 50 μg/mL di acido ascorbico, 7 mM di L-glutammina, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina, 0,25 μg/mL di amfotericina B				28
	HTF primari e		DMEM, 10% FBS, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina, 0,25 μg/mL di amfotericina B				20.28
	fibroblasti dermici umani primari
	Linea cellulare HFF-1		DMEM, 15% FBS, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina				Secondo il venditore
	Linea cellulare BJ		EMEM, 10% FBS, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina				Secondo il venditore
Mastociti	mastociti cutanei umani primari (hsMC)		IMDM, 10% FBS, 1% aminoacidi non essenziali, 226 μM di α-monotioglicerolo, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina				20
	Linea cellulare LAD2		StemPro-34, 2,5% Integratore nutritivo StemPro-34, 2 mM di L-glutammina, 100 ng/mL di fattore di cellule staminali rh, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina				29
	Linee cellulari HMC-1.1 e 1.2		IMDM, 10% FBS, 2 mM L-glutammina, 25 mM HEPES, 100 U/mL penicillina, 100 μg/mL streptomicina				29

Tabella 8: Una panoramica dei terreni più utilizzati per la coltura di cellule cutanee primarie e linee cellulari.
Leggenda: Terreno essenziale minimo di Dulbecco (DMEM), Terreno essenziale minimo di Eagle (EMEM), Siero bovino fetale (FBS), Miscela di nutrienti F-12 di Ham's (F12), Terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM), Umano ricombinante (rh), Roswell Park Memorial Institute (RPMI).

In questo articolo, sono stati creati modelli di pelle con le cellule primarie di cheratinociti, melanociti, fibroblasti e mastociti. Sono leggermente più esigenti delle linee cellulari e i terreni raccomandati per la loro coltura, che sono stati utilizzati per la coltura di singole cellule, sono: il terreno di crescita dei cheratinociti 2 (per i cheratinociti), il 254 (per i melanociti), il DMEM (per i fibroblasti) e il mezzo IMDM (per i mastociti). Su questi mezzi, le cellule presentano la loro morfologia tipica assegnata al loro tipo (le immagini rappresentative sono mostrate nella Figura 8). Nel caso di multicolture di due o più tipi di cellule, era importante scegliere un terreno in cui tutti i tipi di cellule coltivate potessero crescere. Dopo alcuni test, è stato selezionato un terreno DMEM con il 10% di FBS e una miscela antibiotica all'1% per preparare i modelli 3D più avanzati di sfere ed equivalenti.

Figura 8: Le cellule della pelle presentano una morfologia diversa osservata durante la monocoltura 2D. Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le sfere (comunemente chiamate sferoidi) sono uno dei modelli 3D più semplici sviluppati dai ricercatori di ingegneria cellulare e tissutale, sebbene le sfere create dalle cellule della pelle non siano così popolari. All'interno di questo modello, è possibile la creazione di sfere sia mono che multiculturali. In^{letteratura sono} stati descritti diversi metodi per la preparazione di sfere (ad esempio, con una goccia sospesa, limitando l'adesione cellulare, la levitazione magnetica, la rotazione, la microfluidica, ecc.). A causa della facilità di preparazione, del basso costo, dei materiali prontamente disponibili e delle attrezzature, i primi due metodi sono raccomandati per i principianti del modello cellulare tridimensionale (3D) e i protocolli per le loro prestazioni possono essere trovati sopra (passaggi 2.1 e 2.2). Secondo la letteratura ^31,32, i parametri più importanti in questi metodi sono il numero di cellule, il volume della sospensione cellulare e il tempo di incubazione.

Le sfere possono essere create con un numero diverso di cellule, ma la densità cellulare per la semina dovrebbe essere ottimizzata per ogni tipo di cellula separatamente e per le co-colture cellulari. Il processo di ottimizzazione condotto per le monocolture di cheratinociti e fibroblasti ha rivelato che la semina di 1 x 10⁴ cellule per pozzetto ha fornito i migliori risultati per entrambi i tipi di cellule. Le sfere presentate in Figura 9 sono state preparate utilizzando il metodo di limitazione dell'adesione cellulare nelle piastre del fondo a U (passaggio 2.2). Si consiglia di preparare almeno 4 pozzetti con ripetizioni tecniche (l'ottimale è 6 pozzetti). Le sfere costituite da 1 x 10⁴ celle erano più facili da manipolare poiché erano visibili nei pozzetti. Di conseguenza, è stato anche possibile rimuovere il vecchio terreno dai pozzetti durante i saggi senza drenare le sfere. Dopo le operazioni descritte, le forme delle sfere erano per lo più invariate e ripetibili. La stabilità delle sfere più grandi era bassa durante il processo. Vale anche la pena ricordare che diversi tipi di cellule possono formare sfere di colori diversi (ad esempio, i cheratinociti formano sfere più scure, mentre le sfere di fibroblasti sono significativamente più chiare).

Figura 9: Creazione di sfere. Sfere create da diversi tipi e numeri di cellule della pelle con l'uso del metodo di adesione cellulare limitante. Barre di scala (pannello superiore): 200 μm. Barre di scala (pannello inferiore): 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Come accennato nel metodo della goccia sospesa (passaggio 2.1), a un certo punto le sfere richiedono il trasferimento dal coperchio al pozzo. Questo processo può essere potenzialmente dannoso per le sfere. Pertanto, per questa fase, è essenziale un'elevata precisione di lavoro. Le sfere create tendono a perdere la forma corretta se non vengono maneggiate con cura (Figura 10). La prima immagine (Figura 10A) presenta una buona sfera uniformemente arrotondata su tutti i lati. Nella seconda e nella terza immagine (Figura 10B, C) è stata osservata una leggera perdita di forma da parte della sfera, ma l'aggregato cellulare rimane arrotondato. Le ultime tre immagini (Figura 10D-F) mostrano diverse fasi del danno alla sfera. L'acquisizione di esperienza è necessaria per ottenere la ripetibilità delle forme e delle strutture delle sfere create. Con i primi tentativi di sviluppare le sfere, si consiglia di utilizzare il metodo di limitazione dell'adesione cellulare per i ricercatori inesperti (passaggio 2.2) in quanto fornisce risultati più comparabili con l'influenza limitata dell'attività del ricercatore.

Figura 10: Possibili difficoltà nel trasferimento della sfera dal coperchio al pozzetto - il metodo della goccia sospesa. (A) una sfera buona, (B,C) sfere leggermente danneggiate, (D-F) sfere molto danneggiate. Le immagini sono state scattate 24 ore dopo il trasferimento. Barre della scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli equivalenti sono modelli 3D di pelle artificiale molto più avanzati rispetto alle sfere. Durante il processo di costruzione di un modello di pelle, è necessario considerare vari aspetti, tra cui il numero di strati nel modello (solo epidermide, solo derma, derma con epidermide e strato corneo), i tipi di cellule utilizzate, i materiali applicati, la dimensione preferibile dell'equivalente, il tipo di ricerca in cui verrà ulteriormente utilizzato, ^ecc.14. Gli equivalenti cutanei possono essere disposti in inserti speciali inseriti nelle piastre multipozzetto standard della dimensione desiderata (96, 48, 24 pozzetti, ecc.). Anche se gli inserti sono più facili da trasferire da un pozzo all'altro e durante lo scambio del fluido, l'equivalente non può essere danneggiato; Sono piuttosto costosi. Se il modello non richiede la presenza dello strato corneo, una soluzione più economica è quella di preparare l'equivalente in un pozzetto della piastra multipozzetto.

Lo strato di derma artificiale è tipicamente costruito come un modello basato su scaffold utilizzando idrogel naturali (gelatina, collagene, fibrina, acido ialuronico, chitosano-alginato, ecc.) o sintetici (polietilenglicole diacrilato e acido polilattico)³³. Per essere simile al derma cutaneo vero e proprio, questo strato deve contenere principalmente acqua con alcuni componenti della matrice extracellulare (ECM) (tra cui collagene o fibronectina), che mediano il legame cellulare, le interazioni cellula-cellula e altre azioni cellulari³⁴. In questa ricerca, il collagene di tipo I è stato selezionato in quanto è facile da preparare sotto forma di idrogel e la sua struttura flessibile garantisce la facilità di ulteriori potenziali attività di ricerca (ad esempio, il trasferimento dell'equivalente da un piatto all'altro). La soluzione di collagene di tipo I ottenuta dalla coda di ratto viene normalmente preparata mediante dissoluzione in polvere in acido acetico 20 mM. Per ottenere la fase di polimerizzazione del collagene, è necessario fornire condizioni di pH appropriate che vanno da 6,5 a 7,5. Ciò può essere garantito dall'aggiunta di una quantità rigorosa di idrossido di sodio. Per semplicità, alcune aziende hanno introdotto calcoli specifici, che possono aiutare a determinare i volumi esatti necessari per preparare tali idrogel (Tabella 6). Sebbene in letteratura si possano riscontrare diverse concentrazioni di collagene negli idrogel (ad esempio, 0,5-2 mg/mL³⁵; 5-30 mg/mL³⁶; basso e alto contenuto di collagene³⁷), nel modello descritto, la soluzione da 2 mg/mL è stata utilizzata poiché l'idrogel aveva ancora una struttura flessibile, ma era abbastanza compatto da poter essere spostato dal pozzetto se necessario.

Per preparare una pelle a tutto spessore abbastanza realistica, le cellule equivalenti dovrebbero essere seminate nella proporzione il più vicino possibile a questa presente nel nostro corpo. Nel caso dell'epidermide, a seconda della sede corporea, la relazione tra un melanocita e un pool di cheratinociti associati è un rapporto di circa 1:36, che viene definito come Unità di Melanina Epidermica (EMU)³⁸. Pertanto, la proporzione applicata nell'epidermide artificiale era di 1 melanocita per 15 cheratinociti (Tabella 5). Per creare uno strato di derma artificiale, è stato utilizzato l'idrogel di collagene di tipo 1 in cui sono stati incorporati fibroblasti e mastociti nella proporzione di 1 mastocita per 10 fibroblasti. Ogni strato dell'equivalente costruito può essere monitorato in tempo reale al microscopio ottico invertito modificando la profondità del campione osservato (immagini esemplificative sono mostrate in Figura 11).

Figura 11: Osservazione in tempo reale di diverse cellule in particolari strati dell'equivalente cutaneo a tutto spessore creato (A) pseudo-derma e (B) pseudo-epidermide) come visualizzato dalla microscopia a campo chiaro. Barre della scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Osservazioni più accurate con la conferma di ottenere la struttura prevista del modello possono essere effettuate eseguendo la colorazione dell'equivalente. L'equivalente fisso deve essere prima incorporato nella paraffina e successivamente tagliato su un microtomo. I vetrini con tessuto artificiale sottile possono essere successivamente colorati con diversi coloranti, tra cui ematossilina ed eosina (colorazione di base eseguita nei laboratori medici). Grazie a tale azione, è possibile distinguere il derma artificiale e l'epidermide negli equivalenti, nonché identificare le singole cellule della pelle (Figura 12). Nella Figura 12 non solo sono mostrati i tipi cellulari specifici, ma è anche possibile vedere i cheratinociti in diverse fasi del processo di divisione cellulare (telofase e metafase). Nel caso dei mastociti, all'interno della cellula sono ben riconoscibili granuli specifici. Queste immagini confermano inizialmente che l'equivalente cutaneo creato è vivo (le cellule stanno crescendo in esso) e sono in grado di funzionare normalmente nel modello sviluppato. Tuttavia, con l'epidermide 3D e i modelli a tutto spessore della pelle, è particolarmente importante verificare la qualità e la funzionalità del costrutto ottenuto. Per verificare la permeabilità dello strato corneo, è necessario applicare le misurazioni della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) o la colorazione Lucifer-Yellow^39,40. Inoltre, in una pelle artificiale adeguatamente composta, dovrebbero essere presenti marcatori specifici tra cui marcatori di differenziazione (ad es. Filaggrin, Involucrina, Loricrina, Cheratina 10, Cheratina 5, classi lipidiche comprendenti ceramidi), marcatori di giunzione dermo-epidermica (ad es. collagene di tipo IV, laminina V, Alpha6Beta4-integrina, antigene BP)⁴¹, marcatori a giunzione stretta negli strati epidermici (ad es. claudina-1, occludina, zonula occludens protein (ZO)-1)⁴² così come i marcatori di proliferazione dello strato basale (Ki67)⁴¹.

Figura 12: Morfologia e funzionamento delle cellule della pelle. Cenni sulla morfologia e sul funzionamento delle cellule cutanee (osservazione delle divisioni cellulari) nell'equivalente cutaneo a tutto spessore colorato con ematossilina ed eosina. Barre di scala: 100 μm (pannello superiore), 50 μm (pannello centrale, a sinistra), 100 μm (pannello centrale, a destra), 50 μm (pannello inferiore). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il modo più frequentemente utilizzato per confermare la presenza di un biomarcatore è l'esecuzione di colorazioni specifiche, come l'immunoistochimica o l'immunofluorescenza. Diversi anticorpi e coloranti fluorescenti possono essere applicati per la visualizzazione microscopica di particolari cellule nei modelli. Il risultato della colorazione esemplare delle cellule in coltura può essere visto nella Figura 13. Per osservare i cheratinociti, è stato utilizzato un anticorpo contro la citocheratina 14. Nel caso dei melanociti, si trattava di un anticorpo specifico per il melano-A. L'anticorpo collagene 1A2 è stato utilizzato per colorare i fibroblasti e la sulforhodamina fluorescente 101 coniugata con avidina ha rilevato l'eparina presente nei mastociti.

Figura 13: Risultati della colorazione cellulare fluorescente. (A) Citocheratina 14 nei cheratinociti. Barra della scala: 50 μm. (B) Melan-A nei melanociti. Barra graduata: 50 μm. (C) Collagene 1A2 nei fibroblasti. Barra graduata: 100 μm. (D) Eparina nei mastociti. Barra della scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo articolo presenta la metodologia che può essere applicata per preparare i propri modelli avanzati di pelle artificiale. È una buona soluzione ogni volta che la ricerca pianificata necessita di modelli di ricerca rigorosamente definiti che possono rivelarsi non disponibili sul mercato o molto costosi. Come accennato in precedenza, sul mercato sono disponibili diversi equivalenti per la pelle in commercio (ad esempio, EpiSkin, EpiDerm FT). Tuttavia, il loro costo (100-400 euro al pezzo) e i tempi di consegna (alcuni giorni-settimane) possono incoraggiare il ricercatore a tentare di preparare un modello di questo tipo da solo. Le procedure proposte sono facili da eseguire anche per gli scienziati inesperti e, allo stesso tempo, consentono di ottenere modelli di pelle molto avanzati. Vale la pena sottolineare che la decisione sulla composizione cellulare di un determinato modello dipende completamente dal ricercatore. Oltre al modello creato, può essere ulteriormente sviluppato e migliorato, il che apre prospettive di ricerca completamente nuove. Nel caso di modelli commerciali, è necessario acquistare un equivalente diverso.

Sebbene le colture cellulari 3D possano essere avanzate con più tipi di cellule, facili da maneggiare e accessibili, sono ancora solo modelli artificiali che non possono ricreare completamente la complessità e la funzionalità del tessuto (ad esempio, funzioni immunologiche, vascolarizzazione). Questo è il motivo per cui, nella maggior parte degli studi, sono necessari diversi modelli per confermare i risultati ottenuti. Alcuni vantaggi e svantaggi di questi modelli sono stati raccolti nella Tabella 9, così come i loro limiti. D'altra parte, i modelli commerciali garantiscono elevati standard qualitativi con riproducibilità degli esperimenti e comparabilità dei dati tra i laboratori. Per attuare l'utilizzo di un nuovo composto per la ricerca, sarà sicuramente necessario acquistare l'equivalente commerciale appropriato. Ma nella fase preparatoria, un modello 3D autocostruito della pelle (sfera di tipo multicellulare o equivalente) può aiutare a ridurre il numero di esperimenti necessari da eseguire su un equivalente commerciale. L'obiettivo della produzione e dell'utilizzo dei modelli descritti non è quello di aggirare la necessità di applicare modelli di ricerca certificati, ma di facilitare la ricerca e ridurre le spese correlate.

Coppia di modelli a confronto	Vantaggi			Difetto
Coltura cellulare vs. animali	Riduzione al minimo della sofferenza degli animali			Informazioni limitate sull'influenza di un fattore testato su tutto il corpo
	Elevata standardizzazione degli esperimenti - migliore riproducibilità dei risultati			Un singolo modello non è sufficiente per riflettere i processi che avvengono nel corpo
	Nessun effetto collaterale per l'intero organismo			-
	Migliore controllo sulle condizioni dell'esperimento			-
	Possibilità di automatizzazione (es. bioprinting)			-
	Costi inferiori			-
	Le piccole dimensioni del campione necessario			-
	Quantità limitata di rifiuti prodotti			-
Culture 3D e 2D e 2D	Riflette meglio l'intero organismo			Cultura che richiede tempo
	Possibilità di creare un tessuto funzionale			Costi più elevati
	Possibilità di creare un modello su misura per le esigenze della ricerca svolta			La formazione spontanea di una struttura 3D è quasi impossibile
	-			Mancanza di test standardizzati per quantificare gli effetti dei vari composti
	-			Accesso limitato alle diverse culture 3D disponibili sul mercato
Linea cellulare vs. cellule primarie	Modelli certificati e omologati			È disponibile solo un numero limitato di linee cellulari
	Elevata standardizzazione degli esperimenti - migliore riproducibilità dei risultati			Possibilità limitata di ottenere diversi tipi di cellule dallo stesso donatore
	Maggiore durata			Può possedere proprietà modificate dalle cellule native
	Tasso di proliferazione piuttosto rapido			Funzionalità delle cellule frequentemente disturbata
	Meno sensibile a diverse attività (ad es. congelamento, centrifugazione)			-

Tabella 9: Confronto dell'uso di diversi modelli nella ricerca - vantaggi e svantaggi

Diversi articoli descrivono come preparare modelli di pelle 3D (a parte gli articoli di revisione che riassumono i modelli disponibili in commercio 14,43,44, di solito si concentrano su una singola metodologia per ottenere sfere ⁴⁵ o equivalenti⁴⁶).

In questo articolo sono state descritte due metodologie per la formazione di sfere con cellule cutanee. Il metodo della caduta sospesa è ampiamente utilizzato, ma in alcuni casi la sua ripetibilità e stabilità possono essere insufficienti. La maggior parte delle fasi richiede azioni specifiche, come il lavoro ad alta velocità dovuto all'evaporazione dell'acqua dalle goccioline durante il trasferimento. Si raccomandano anche movimenti delicati, poiché la mancanza di tale abilità può causare danni all'aggregato cellulare^31,32. Pertanto, un metodo più semplice per la preparazione delle sfere si concentra sulla limitazione dell'adesione cellulare. L'assenza di una buona superficie per l'adesione cellulare favorisce maggiori interazioni tra le cellule. Di conseguenza, vengono generati aggregati cellulari. La sua ripetibilità è molto più elevata in quanto non è necessario il trasferimento della sfera. Con questi metodi, il numero ottimale di cellule della pelle per creare una sfera è stato stabilito a 1 x 10⁴ cellule/sfera.

Successivamente, sono state mostrate le procedure che descrivono la preparazione degli equivalenti cutanei. Il loro aspetto e la loro funzionalità nella ricerca possono dipendere fortemente dagli elementi con cui sono costruiti, tra cui cellule (Tabella 2), scaffold e mezzi. Gli scaffold 3D utilizzati per la preparazione della pelle artificiale possono essere suddivisi in idrogel sintetici e quelli formati da fonti naturali. A seconda del materiale utilizzato e delle sue proprietà per comporre l'idrogel, può verificarsi la necessità di integrare ulteriormente il mezzo. Gli idrogel sintetici richiedono l'incorporazione di molecole bioattive (proteine, enzimi e fattori di crescita) nella rete di idrogel sintetici per mediare specifiche funzioni cellulari⁴⁷. I principali approcci presentati in letteratura per ottenere un rilascio controllato di fattori di crescita agli idrogel includono il carico diretto, l'interazione elettrostatica, il legame covalente e l'uso di vettori⁴⁸. Gli idrogel formati da fonti naturali come le proteine ECM e i polimeri possono generare percorsi fluidi in tutta l'impalcatura 3D, accelerando la distribuzione dei nutrienti; Pertanto, non è necessaria un'ulteriore integrazione del mezzo. Le indagini hanno dimostrato che piccole molecole (come citochine e fattori di crescita) e macromolecole (inclusi glicosaminoglicani e proteoglicani) possono essere trasportate attraverso la MEC per diffusione⁴⁷. Tuttavia, la diffusione molecolare di ossigeno, nutrienti e altre molecole bioattive può essere ostacolata dalle proprietà dell'idrogel ECM stesso. Una minore diffusione era correlata con il maggiore spessore dell'idrogel ma anche con un'altissima concentrazione di collagene³⁷. In questo studio, per creare l'equivalente cutaneo, è stata utilizzata una bassa concentrazione di collagene pari a 2 mg/mL, il che suggerisce che la diffusione molecolare attraverso l'idrogel dovrebbe essere buona e rapida. Pertanto, in questa fase non è stata fornita alcuna integrazione aggiuntiva al terreno né all'idrogel stesso. Per imitare il derma, i mastociti e i fibroblasti (1:10) sono stati incorporati nell'idrogel di collagene. Successivamente, i melanociti e i cheratinociti (1:15) sono stati seminati sull'idrogel e l'intero equivalente è stato coltivato nel terreno. Vale la pena ricordare che il terreno di base è composto da diversi aminoacidi, acidi inorganici e vitamine, ed è inoltre integrato con siero (costituito da multipli: fattori di crescita e di attaccamento per cellule, lipidi, ormoni, nutrienti e fonti di energia, trasportatori, proteine di legame e trasferimento, ecc.). Per ottenere la corretta struttura dell'epidermide, è necessario aggiungere diversi integratori al terreno in un determinato momento. Lo stimolatore più importante per avviare la differenziazione epidermica è il calcio, poiché attiva la segnalazione intracellulare. L'acido ascorbico stimola una via di segnalazione simile a quella mediata dal calcio, ma il suo effetto è anche accompagnato da un maggiore trasporto dell'ascorbato e dalla prevenzione della deplezione idrofila degli antiossidanti⁴¹. Inoltre, la differenziazione delle cellule è stata migliorata quando altri componenti sono stati aggiunti al terreno (come caffeina, idrocortisone, triiodotironina, adenina e tossina del colera)^41,44. È importante che i modelli preparati siano sempre controllati per verificare la presenza di un determinato tipo di cellula nello strato appropriato. La presenza di tutti e quattro i tipi di cellule della pelle è stata confermata nella struttura dell'equivalente creato mediante colorazione H&E.

Il problema più comune riscontrato è la delicatezza e l'intuizione nella gestione dei modelli ottenuti. Alcune difficoltà possono essere legate alla formazione della sfera cellulare e alla preparazione dell'idrogel. Durante la coltura cellulare, possono verificarsi anche molti altri problemi; questi includono infezioni microbiche, basso tasso di proliferazione delle cellule, invecchiamento delle cellule primarie utilizzate nei modelli, tempo massimo di coltivazione dei modelli 2D e 3D ricostruiti da cellule primarie rispetto a linee cellulari, ecc. Nella Tabella 10 sono stati raccolti alcuni consigli pratici su cosa fare quando si incontra uno dei seguenti problemi.

Problemi comuni nelle colture cellulari	Suggerimenti
Infezione microbica	Se si verifica un'infezione microbica in uno dei flaconi/piastre con cellule, è meglio rimuovere la coltura infetta il più rapidamente possibile (non contaminare i flaconi/piastre rimanenti con le cellule). Ricongelare una nuova fiala con le cellule.  Se l'infezione si ripresenta, è bene cercare di allargare gli spettri degli antibiotici applicati e aumentarne la concentrazione.
Basso tasso di proliferazione delle cellule	Alcune celle hanno un lungo tempo di raddoppio. Per stimolare la loro proliferazione, è possibile aggiungere al terreno di base diversi fattori di crescita specifici per le cellule. Anche l'aumento della concentrazione di FBS o L-glutammina nel terreno basale può aiutare a stimolare la crescita delle cellule.
Invecchiamento delle cellule primarie utilizzate nei modelli	Dopo alcuni passaggi, le cellule primarie entrano in senescenza e smettono di dividersi. Per ovviare a questo problema nei modelli, si consiglia di utilizzare le celle fin dal passaggio più precoce possibile per costruire il modello.
Tempo massimo di coltivazione dei modelli 2D e 3D ricostruiti da cellule primarie rispetto alle linee cellulari	Il tempo di coltivazione di un modello dipende fortemente dal tipo di cellule utilizzate. Con le cellule primarie, il tempo di coltivazione sarà più breve a causa della loro breve durata di vita.
Difficoltà nella formazione della sfera cellulare	Alcune cellule possono richiedere un tempo più lungo per la formazione delle sfere. Se dopo qualche giorno le sfere non si sono formate, raccogliere le cellule dal campione e verificarne la vitalità con, ad esempio, la colorazione blu di tripano.
Problemi con la stabilità della sfera	Se le sfere non sono stabili e vengono distrutte durante la manipolazione, prova a creare sfere da un numero inferiore di celle. Assicurati di trasferire sempre delicatamente i piatti in cui crescono le sfere.
Difficoltà con la preparazione dell'idrogel	Controlla se la proporzione degli ingredienti (acqua, PBS [10x], NaOH, collagene di tipo 1) era corretta. La soluzione madre di collagene è solitamente molto densa, quindi assicurati di pipettarla lentamente. Le bolle d'aria disturbano la morfologia dell'idrogel, quindi il pipettaggio inverso del gel può aiutare a risolvere questo problema.

Tabella 10: Risoluzione dei problemi relativi alle colture cellulari

I modelli stabiliti dopo la fabbricazione possono essere utilizzati in molteplici campi, a partire da (1) esperimenti di citotossicità e genotossicità di nuovi composti con attività biologica per l'uso in farmaci e cosmetici⁴⁹, (2) esperimenti con stimolazione di vari fattori⁵⁰, (3) ricerca di base che aumenta le nostre conoscenze sulle cellule della pelle, le loro funzioni biologiche, le interazioni con altre cellule e l'ambiente^{51, 52}, (4) ricerca su entità patologiche selezionate in cui un tipo specifico di cellula può essere introdotto nel modello creato (cellule tumorali, cellule con una mutazione in un dato gene, ^ecc.14,53) e molti altri. È inutile dire che l'applicazione di questi modelli rimane in accordo con il principio delle 3R per un uso più etico degli animali nei test sui prodotti e nella ricerca scientifica e non viola la legge che vieta i test sui prodotti cosmetici sugli animali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra a 24 pozzetti per colture cellulari aderenti	Biologix Europe GmbH	07-6024-35
%– Piastra	HCL Chempur		115752837-60
mm	Nido		705001-Avidin
− Sulforhodamine 101	Sigma Aldrich	A2348-5MG-Microscopio
invertito a campo chiaro	Olympus	CKX41-Cloruro
calcio	Avantor	874870116-Pallone
per coltura cellulare T75 per cellule aderenti	Genoplast		G77080033-Centrifuga
provetta 15 mL	GoogLab Scientific
G66010522-CO2	Heal Force	Galaxy 170R-Col1A2
anticorpo prodotto nel coniglio	Novus	NBP2-92790-Corning
(R) Transwell(R) Policarbonato	Corning	CLS3422-48EA-Citocheratina
14 anticorpo prodotto nel topo	Novus	NBP1-79069-DPX
Mountant per istologia	Sigma Aldrich	06522-100ML	-
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	VWR Chemicals	L0102-500-Eosine
Y	Kolchem-0,5		% soluzione acquatica
Eppendorf provetta 1,5 mL	Sarstedt	72.690.001-Eppendorf
provetta 2 mL	Sarstedt	72.691-Alcol
etilico assoluto 99,8%	Avantor	396480111	diluito in acqua ultrapura al necessario concentrazioni
Siero fetale bovino	Gibco		10270106-Microscopio
invertito fluorescente	Olympus	IX71-capra
coniugato con FITC	Sigma Aldrich	F0257-1mL
Anticorpo secondario anti-coniglio di capra coniugato con FITC	Novus	NB7159-Harris
Hematoxylin	Kolchem-1		mg/mL in etanolo al 95%
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570-Laminar
camera	Heal Force	HFSafe-1200-Melan-A
anticorpo prodotto nel topo	Santa Cruz Biotechnology	sc-20032-Microtome
	Microm	HM355S-NaOH
	Avantor		810981997-Paraffina
pastiglie	Sigma Aldrich	1.07164-Paraformaldeide
	Sigma Aldrich
1581227-Penicillina/Streptomicina soluzione	Sigma Aldrich	P4333-Puntale
per pipetta, 1000 &; L	Sarstedt	70.305-Puntale
per pipetta, 20 &; L	Sarstedt	70.3021-Puntale
per pipette, 200 &; L	Sarstedt	70.303-Pluronic
F-127	BASF		50401036-Pipetta
sierologica 10 mL	GoogLab Scientific		G33270011-Pipetta
sierologica 25 mL	GoogLab Scientific		G33280011-Pipetta
sierologica 5 mL	GoogLab Scientific
G33260011-Bicarbonato di sodio	Sigma Aldrich	S5761-Bicarbonato
di sodio	Chempur	118105307
Tripsina-EDTA 0,25% soluzione, rosso fenolo	Sigma Aldrich		25200072-Tipo
1 collagene	IBIDI	50201-U-bottom
96-pozzetti	piastra Sarstedt	83.3925500-Xilene
	Sigma Aldrich	534056	-