Questo articolo descrive un protocollo per l'estrazione del DNA delle diatomee utilizzando un kit di estrazione del DNA comune modificato.
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Articolo metodologico
Estrazione del DNA di diatomee da campioni d'acqua e tessuti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il test delle diatomee è un mezzo ausiliario essenziale nella pratica forense per determinare se il cadavere è annegato in acqua e per dedurre il luogo dell'annegamento. Il test delle diatomee è anche un importante contenuto di ricerca nel campo dell'ambiente e del plancton. La tecnologia di analisi della biologia molecolare delle diatomee, che si concentra sul DNA delle diatomee come oggetto di ricerca primario, è un nuovo metodo di test delle diatomee. L'estrazione del DNA delle diatomee è alla base dei test molecolari delle diatomee. Attualmente, i kit comunemente usati per l'estrazione del DNA delle diatomee sono costosi, il che aumenta il costo della ricerca correlata. Il nostro laboratorio ha migliorato il kit generale di estrazione rapida del DNA genomico del sangue intero e ha ottenuto un effetto soddisfacente di estrazione del DNA delle diatomee, fornendo così una soluzione alternativa economica e conveniente per l'estrazione del DNA basata su perle di vetro per la ricerca correlata. Il DNA di diatomee estratto utilizzando questo protocollo potrebbe soddisfare molte applicazioni a valle, come la PCR e il sequenziamento.
Introduzione
Nella pratica forense, determinare se un cadavere trovato in acqua annegava o è stato gettato in acqua dopo la morte è essenziale per la corretta risoluzione del caso1. È anche una delle questioni difficili che devono essere risolte con urgenza nella pratica forense2. Le diatomee sono abbondanti nell'ambiente naturale (soprattutto nell'acqua)3,4. Nel processo di annegamento, a causa dell'ipossia e della risposta allo stress, le persone avranno intensi movimenti respiratori e inaleranno una grande quantità di liquido di annegamento. Pertanto, le diatomee nell'acqu....
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Protocollo
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Medicina di Hainan. I campioni di tessuto utilizzati in questo studio non sono considerati studi che coinvolgono soggetti umani. Questi campioni sono stati ottenuti ai fini della diagnosi patologica forense e il resto è stato utilizzato per l'estrazione del DNA delle diatomee in questo esperimento. I ricercatori non sono in grado di identificare prontamente gli individui per ottenere il consenso informato dalle parti interessate.
NOTA: Per garantire l'applicabilità generale del metodo di ricerca riportato in questo esperimento, questo esperimento ha sostanzialmente seguit....
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Risultati
Poiché la soluzione di DNA estratta con il metodo di estrazione del DNA attualmente utilizzato contiene tutti i componenti del DNA provenienti da diverse fonti nel campione, il DNA ottenuto con questo protocollo non ha fatto eccezione. Quindi, la soluzione del DNA non era solo una soluzione del DNA genomico delle diatomee. I primer in grado di amplificare in modo specifico i frammenti di rDNA della diatomea 18S sono stati selezionati consultando la letteratura 22,23,24.
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Discussione
Le cellule di diatomee sono protette da pareti cellulari silicee dure17 e questa struttura deve essere distrutta per estrarre il DNA delle diatomee. I kit ordinari non distruggono facilmente il guscio siliceo delle diatomee; quindi è difficile estrarre con successo il DNA21 delle diatomee. Il nostro laboratorio ha migliorato il kit di estrazione del DNA sanguigno più comunemente usato, aggiungendo perle di vetro di diversi diametri e diversi rapporti di massa nel processo d.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) e dall'Academician Innovation Platform Scientific Research Project della provincia di Hainan (YSPTZX202134).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tampone legante | BioTeke | B010006022 | cellule a lisi rapida |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 Scala del DNA | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Misura la posizione delle bande elettroforetiche |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | primer per parole |
| D978 | Taihe Biotecnologia | TW21109197 | primer inverso |
| Tampone di eluizione | BioTeke | B010006022 | Un tampone di eluizione a basso contenuto di sale lava via il DNA |
| Perla di vetro | Yingxu Chemical Machinery (Shanghai) | 70181000 | Perle di vetro speciali per la dispersione e la macinazione |
| Colonna di adsorbimento per importazione | BioTeke | B2008006022 | Colonna di adsorbimento con membrana in matrice di silice |
| Tampone per la rimozione degli inibitori | BioTeke | B010006022 | Rimozione degli inibitori nell'estrazione del DNA |
| Isopropanolo | BioTeke | B010006022 | Precipitare o isolare il DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | azione oscillatoria |
| Proteinasi K | BioTeke | B010006022 | Inattivazione di nucleasi intracellulari e altre proteine |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | quantificazione della fluorescenza in tempo reale PCR |
| Speed Micro-centrifuga | Scilogex | centrifuga 9013001121 | |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | imaging su gel |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | normale |
| tampone di lavaggio | PCR BioTeke | B010006022 | Rimuovere le impurità come i metaboliti cellulari |
Riferimenti
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin....
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Ristampe e permessi
