Articolo metodologico

Isolamento ottimizzato dei nuclei da campioni di tumore solido freschi e congelati per il sequenziamento di più omi

DOI:

10.3791/65831

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13 ottobre 2023

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1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Department of Surgery, Stanford University

In questo articolo

Sommario

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Il protocollo fornisce un approccio affidabile e ottimizzato all'isolamento dei nuclei da campioni di tumore solido per il sequenziamento multioma utilizzando la piattaforma 10x Genomics, comprese le raccomandazioni per le condizioni di dissociazione tissutale, la crioconservazione delle sospensioni a singola cellula e la valutazione dei nuclei isolati.

Abstract

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Il sequenziamento multiomico, che fornisce RNA a singola cellula/appaiata e il saggio per la cromatina accessibile alla trasposasi con dati di sequenziamento (sequenziamento ATAC), rappresenta una svolta nella nostra capacità di discernere l'eterogeneità delle cellule tumorali, un obiettivo primario della ricerca traslazionale sul cancro in questo momento. Tuttavia, la qualità dei dati di sequenziamento acquisiti utilizzando questa modalità avanzata dipende in larga misura dalla qualità del materiale in ingresso.

Le condizioni di digestione devono essere ottimizzate per massimizzare la resa cellulare senza sacrificare la qualità. Ciò è particolarmente impegnativo nel contesto di tumori solidi con matrici desmoplastiche dense che devono essere delicatamente scomposte per il rilascio cellulare. Le cellule appena isolate da tessuto tumorale solido sono più fragili di quelle isolate da linee cellulari. Inoltre, poiché i tipi di cellule isolate sono eterogenei, è necessario selezionare le condizioni per supportare la popolazione cellulare totale.

Infine, le condizioni di isolamento nucleare devono essere ottimizzate in base a queste qualità in termini di tempi di lisi e tipi/rapporti di reagenti. In questo articolo, descriviamo la nostra esperienza con l'isolamento nucleare per la piattaforma di sequenziamento multioma 10x Genomics da campioni di tumore solido. Forniamo raccomandazioni per la digestione tissutale, la conservazione di sospensioni unicellulari (se lo si desidera) e l'isolamento e la valutazione nucleare.

Introduzione

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Con l'aumento della nostra conoscenza della biologia dei tumori, è aumentata anche l'importanza di analizzare cellule eterogenee nel microambiente tumorale 1,2. La capacità di acquisire RNA a singola cellula e il saggio per la cromatina accessibile alla trasposasi con dati di sequenziamento (sequenziamento ATAC) dalla stessa cellula in modo accoppiato (sequenziamento multiomico) fornisce un progresso significativo verso questo obiettivo 3,4. Tuttavia, questi esperimenti sono costosi e richiedono molto tempo e la qualità e l'impatto dei dati acquisiti d....

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Protocollo

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I campioni di carcinoma pancreatico umano (adenocarcinoma duttale pancreatico) sono stati acquisiti secondo un protocollo approvato dall'IRB nel nostro laboratorio. È stato ottenuto il consenso informato dei pazienti per la raccolta dei tessuti. Il tessuto è stato trasportato dalla sala operatoria al laboratorio e poi processato come segue.

1. Dissociazione tissutale (digestione)

  1. Preparare il tampone digestato (vedere la tabella dei materiali).
  2. Ottenere il tessuto di interesse il prima possibile dopo l'escissione del tumore e trasportare il campione in tampone di tempra (DMEM F-12 con ~5....

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Risultati

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Per isolare nuclei di alta qualità da campioni di tumori solidi di pazienti per il sequenziamento del multioma (Figura 1), il tessuto tumorale è stato dissociato e una sospensione a singola cellula è stata crioconservata (Figura 2A-D). La sospensione cellulare è stata poi scongelata al momento della cattura pianificata del multioma. La cattura dei nuclei è stata condotta con reagenti tampone di lisi ottimizzati e tempistiche per.......

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Discussione

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Districare le popolazioni cellulari eterogenee presenti nel microambiente tumorale è un'area di interesse attiva nella biologia del cancro. Allo stesso modo, i tessuti complessi esistono in patologie benigne come la guarigione delle ferite e la fibrosi. Il sequenziamento multioma è emerso come un potente strumento che consente l'acquisizione di dati scRNA- e ATAC-seq accoppiati nella stessa cellula. Questo protocollo descrive l'isolamento dei nuclei, che richiede un'ottimizzazione nell'ambito dell'elaborazione di campion.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare la Stanford Functional Genomics Facility (SFGF), in particolare Dhananjay Wagh e John Coller, e 10x Genomics per la loro assistenza nell'ottimizzazione dei nostri esperimenti. Vorremmo anche ringraziare i dottori George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser e Byrne Lee per la loro assistenza nell'acquisizione di campioni di pazienti. Vorremmo ringraziare Art ed Elaine Taylor, la Rantz Foundation, e Warren e Judy Kaplan per il loro generoso sostegno ai nostri sforzi di ricerca. Le fonti di finanziamento includono le sovvenzioni NIH 1F32CA23931201A1 (DSF), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L.), Goldman Sachs Foundation (J.A.N., D.S.F., M.T.L....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
100, 70 e 40 μ m Filtri per celle Falcon   ThermoFisher
10x tampone per nuclei genomici (20x)10x genomica2000153/2000207
Bambanker Wako, Fisher ScientiticNC9582225 
BSAMiltenyi Biotec130-091-376
Cloruro di calcioSigma Aldrich499609
Collagenasi (Collagenasi Tipo IV)ThermoFisher17104019
DigitoninThermo FisherBN2006
DNasi IWorthingtonLS006330
DTTSigma Aldrich646563
Dulbecco' s Modified Eagle Medium F-12Thermo Fisher11320082
Siero fetale bovinoThermo Fisher10438026
Flowmi 40 μ m  Pipetta Tip Cell Strainer Sigma AldrichBAH136800040
HEPESSigma AldrichH3375
Histopaque-1119 Soluzione di separazione cellulare a gradienteSigma Aldrich11191
Medium 199Sigma AldrichM2520
MgCl2Sigma AldrichM1028
Miltenyi GentleMACSTM kit digest
NaClSigma Aldrich59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Contenitore di congelamento  ThermoFisher5100-0001
Nonident P40 SostitutoSigma Aldrich74385
Poloxamer 188SigmaP5556
Inibitore della RNASI Sigma Aldrich3335399001
Tris-HClSigma AldrichT2194
Tween-20Thermo Fisher85113

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jain, S., et al. Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects. J Clin Invest. 133 (5), e147087(2023).
  2. Sahai, E., et al.

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Ristampe e permessi

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Nuclei IsolationSolid Tumor SpecimensMultiome SequencingSingle Cell RNAATAC SequencingTissue DigestionCell Lysis BufferHemocytometer AssessmentPancreatic TumorCryopreservation

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