Qui descriviamo un test interno di attività del fattore tissutale del tessuto delle vescicole extracellulari. I saggi basati sull'attività e i saggi basati sull'antigene sono stati utilizzati per misurare il fattore tissutale nelle vescicole extracellulari da campioni di plasma umano. I test basati sull'attività hanno una sensibilità e una specificità più elevate rispetto ai test basati sull'antigene.
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Articolo metodologico
Saggio di attività del fattore tissutale delle vescicole extracellulari
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il fattore tissutale (TF) è un recettore transmembrana per il fattore (F) VII e FVIIa. Il complesso TF/FVIIa avvia la cascata della coagulazione attivando sia FIX che FX. Il TF viene rilasciato dalle cellule nella circolazione sotto forma di vescicole extracellulari (EV). Il livello di vescicole extracellulari TF-positive (+) è aumentato in varie malattie, tra cui il cancro, le infezioni batteriche e virali e la cirrosi, ed è associato a trombosi, coagulazione intravascolare disseminata, gravità della malattia e mortalità. Esistono due modi per misurare le vescicole extracellulari TF+ nel plasma: saggi basati sull'antigene e sull'attività. I dati indicano che i test basati sull'attività hanno una sensibilità e una specificità più elevate rispetto ai test basati sull'antigene. Questo documento descrive il nostro saggio interno dell'attività EVTF basato su un saggio di generazione FXa a due stadi. FVIIa, FX e calcio vengono aggiunti ai campioni contenenti EV TF+ per generare FXa in presenza e assenza di anticorpi anti-TF per distinguere la generazione FXa TF-dipendente dalla generazione FXa TF-indipendente. Per determinare il livello di FXa viene utilizzato un substrato cromogenico scisso da FXa, mentre per la determinazione della concentrazione di TF viene utilizzata una curva standard generata con un TF ricombinante relipidato. Questo test di attività EVTF interno ha una sensibilità e una specificità più elevate rispetto a un test di attività TF commerciale.
Introduzione
La coagulazione del sangue inizia con il legame del fattore (F) VII/VIIa al fattore tissutale (TF)1. Il complesso TF/FVIIa attiva sia FIX che FX per attivare la coagulazione del sangue1. Esistono due forme di TF full-length, legate alla membrana: crittografato e attivo. Inoltre, esiste una forma alternativa di TF (asTF). La sfingomielina e la fosfatidilcolina nel lembo esterno della membrana cellulare mantengono il TF in uno stato crittografato 2,3,4. Quando le cellule sono attivate o danneggiate, la scramblasi fosfolipidica tra....
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Protocollo
La ricerca è stata approvata dall'Institutional Review Board dell'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill (numero di protocollo: 14-2108).
1. Prelievo di sangue da donatori
- Prelevare il sangue intero con una venopuntura pulita nella vena antecubitale con un ago da 21 G. Scartare i primi 3 ml di sangue perché questa porzione di sangue può contenere TF da cellule perivascolari.
- Prelevare 2,7 o 1,8 mL (a seconda delle dimensioni delle provette) di sangue in un vacutainer contenente citrato di sodio al 3,2% (0,109 mol/L). Non riempire eccessivamente o troppo poco i tubi. Capovolgere delicatamente le....
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Risultati
Un risultato positivo fornisce un valore di controllo positivo di ≥0,5 pg/mL e un valore di controllo negativo di <0,5 pg/mL. È meglio trovare un risponditore LPS elevato con >1,0 pg/mL di attività EVTF per un controllo positivo. Il risultato rappresentativo mostra l'attività EVTF delle vescicole extracellulari isolate dal plasma del sangue intero di 11 donatori sani, con e senza attivazione di LPS (Figura 4). Sei donatori su undici (donatori 2, 4, 5, 8, 10, 11) hanno risposto con LPS .......
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Discussione
Qui viene presentato il protocollo del nostro test interno di attività EVTF. Il protocollo prevede tre passaggi critici. Quando si ricostituisce il pellet EV, è importante pipettare su e giù nella posizione del pellet EV anche se non è visibile. La ricostituzione incompleta del pellet EV comporterà un falso negativo o una sottostima dei valori di attività EVTF dei campioni. In secondo luogo, l'utilizzo di HBSA-Ca(+) è fondamentale nella fase 6.5 del protocollo perché la generazione di FXa non può essere generata senza ca.......
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Dichiarazioni
Non ci sono interessi concorrenti da divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH NHLBI R35HL155657 (NM) e dalla cattedra John C. Parker (NM). Vorremmo ringraziare la signora Sierra J. Archibald per i suoi utili commenti
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta da 1,5 mL per centrifughe da 20.000 x g | qualsiasi azienda | N/A | Utilizziamo quella di Fisher Scientific (numero di catalogo: 05-408-129). |
| 1,5 mL per ultracentrifuga | qualsiasi azienda | N/A | Usiamo quella di Beckman Coulter (Numero di catalogo: 357448) |
| Provetta da 15 mL | di qualsiasi azienda | N/A | Usiamo quella di VWR (Numero di catalogo: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. Set per la raccolta del sangue BD Vacutainer Safety-Lok con 12 pollici. tubo e adattatore luer | BD | 367281 | |
| piastra a 96 pozzetti | qualsiasi azienda | N/A | Utilizziamo quello di Globe Scientific (numero di catalogo: 120338). |
| BD Vacutainer Citrato Provette | BD | 363083 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Cloruro di calcio | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuga per provette da 1,5 mL | qualsiasi azienda | N/A | Usiamo la Centrifuga 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuga per provette da 15 mL | qualsiasi azienda | N/A | Utilizziamo la Centrifuga 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucosio | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico sale tetrasodico diidrato | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Laboratorio di ricerca enzimatica | FVIIa umano | HFVIIa | La soluzione deve essere diluita con HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | La soluzione deve essere diluita con HBSA-Ca(+). |
| Fattore inibitorio del tessuto umano anti-umano di topo IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolisaccaride da Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | Ci sono diversi lipopolisaccaridi da diversi E. coli. Diversi lipopolisaccaridi hanno un potenziale diverso per attivare i monociti. |
| Topo IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Laboratorio di ricerca enzimatica | 085-27 | |
| Lettore di piastre | qualsiasi azienda | N/A | Usiamo lo SpectraMax i3x di Molecular Devices |
| Fattore tissutale rilipidizzante rilipidizzato, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| cloruro di sodio... | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuga | Beckman Coltro | Optima TLX | |
| Rotore per ultracentrifuga | Beckman Coulter | TLA-55 |
Riferimenti
- Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
- Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H.
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Ristampe e permessi
