Questo protocollo descrive un metodo per misurare la pressione e il volume ventricolare sinistro utilizzando la tecnica della conduttanza pressione-volume. Questo metodo consente un monitoraggio continuo in tempo reale degli effetti dei farmaci sul cuore.
Articolo metodologico
Rilevamento in tempo reale degli effetti dell'acido ferulico sul ventricolo sinistro del ratto utilizzando un catetere di conducibilità pressione-volume
In questo articolo
Sommario
Abstract
La diminuzione della funzione cardiaca può avere un impatto negativo su altri organi. La relazione pressione-volume del ventricolo sinistro è considerata un metodo valido per valutare la funzione cardiaca. Il monitoraggio in tempo reale della funzione cardiaca è importante per la valutazione dei farmaci. In condizioni di torace chiuso, il trasduttore miniaturizzato, che è un componente importante del catetere pressione-volume, entra nel ventricolo sinistro del ratto attraverso l'arteria carotide destra. Il dispositivo visualizza i cambiamenti nella funzione cardiaca durante l'esperimento sotto forma di un ciclo pressione-volume. Il volume effettivo del ventricolo viene calcolato alterando la conduttività del sangue iniettando 50 μL di una soluzione di cloruro di sodio al 20% nella vena giugulare sinistra del ratto. Il volume effettivo della cavità ventricolare del ratto viene calcolato misurando la conduttività del sangue in un volume noto utilizzando un catetere di conduttanza pressione-volume. Questo protocollo consente l'osservazione continua degli effetti dei farmaci sul cuore e promuoverà il razionale per l'uso di farmaci etnici speciali nelle malattie cardiovascolari.
Introduzione
Le malattie cardiovascolari hanno il più alto tasso di mortalità al mondo1. Le sue cause includono la stenosi dell'arteria coronaria (ischemia miocardica), l'ostruzione dell'arteria coronaria (infarto miocardico) e il danno da ischemia-riperfusione2. Poiché il cuore è in un ciclo sistolico e diastolico costante, è una delle parti del corpo più esigenti dal punto di vista energetico. Pertanto, quando le arterie coronarie hanno difficoltà a mantenere energia e ossigeno sufficienti, la funzione cardiaca diminuisce inevitabilmente, il che ha un impatto negativo su altri organi 3,4. Il cuore è una centrale elettrica nel sistema circolatorio e la funzione cardiaca deve essere valutata razionalmente.
La valutazione della funzione cardiaca mediante la pressione ventricolare e le relazioni di volume è considerata un metodo completo5. Le variazioni in tempo reale della pressione e del volume ventricolare durante l'intero ciclo cardiaco costituiscono il ciclo pressione-volume. Il loop pressione-volume ventricolare consente un'analisi quantitativa della funzione cardiaca e della capacità di riserva in termini di diverse fasi ed energie del ventricolo. Il ventricolo normale ha un piccolo volume telesistolico con un buon lavoro di battito ed efficienza 5,6,7.
La tecnica del catetere a conduzione pressione-volume è un metodo invasivo per rilevare lo stato del ventricolo sinistro. Può essere utilizzato per ottenere un ciclo continuo pressione-volume in tempo reale8. I cateteri di conducibilità volumetrica a pressione sono strumenti potenti e le procedure di manipolazione del suono sono essenziali per risultati riproducibili e affidabili, tra cui l'analisi in vivo della conducibilità parallela miocardica durante la calibrazione salina e la misurazione in vitro della conducibilità del sangue nella calibrazione delle cuvette3.
L'acido ferulico (FA), un acido fenolico, è ampiamente distribuito in regni vegetali come Avena sativa e Ligusticum chuanxiong hort 9,10. L'acido ferulico ha effetti farmacologici di abbassamento della pressione sanguigna e aritmia. FA è un prodotto naturale bioattivo con molteplici funzioni. La FA può resistere al danno ossidativo, ridurre le risposte infiammatorie, inibire l'aggregazione piastrinica e prevenire la malattia coronarica e l'aterosclerosi11. Tuttavia, la maggior parte degli studi sull'acido ferulico si è concentrata su un aspetto del cuore e raramente sono stati valutati gli effetti dell'acido ferulico nel sistema circolatorio 12,13,14,15. Qui descriviamo un approccio a torace chiuso all'anestesia con isoflurano combinato con ketamina (50 mg/kg) con particolare attenzione alla risposta cardiaca alla soluzione di acido ferulico durante l'iniezione della vena giugulare.
Descriveremo la procedura completa per l'utilizzo dello strumento in condizioni di torace chiuso, compresa la preparazione della soluzione, la preparazione del trasduttore, la preparazione pre-sperimentale del ratto, l'inserimento del catetere nell'arteria carotide destra e l'analisi dei dati. La durata dell'esperimento è solitamente inferiore alle 4 ore ed è determinata dai diversi protocolli sperimentali. In un singolo esperimento, possiamo ottenere informazioni cardiache dettagliate come la pressione ventricolare sinistra, il volume e la frequenza cardiaca.
Protocollo
Il protocollo sugli animali è stato esaminato e approvato dal Comitato etico sperimentale per il benessere degli animali dell'Università di medicina tradizionale cinese di Chengdu (Record n. 2023-04). Per il presente studio sono stati utilizzati ratti maschi di Sprague Dawley (SD) (280 ± 20 g, 8-10 settimane di età). I ratti erano tenuti in una camera per animali ed erano liberi di bere e mangiare.
1. Preparazione della soluzione
- Preparare una soluzione di NaCl allo 0,9% da utilizzare per mantenere l'area di lavoro adeguatamente umida.
- Per preparare una soluzione ipertonica di NaCl al 20%, sciogliere 2 g di NaCl in 10 mL di acqua bidistillata (ddH2O). Per determinare la conducibilità parallela del miocardio, è necessario alterare la conducibilità del liquido intraventricolare.
- Preparare una soluzione detergente in polvere all'1% di enzima attivo. Al termine dell'esperimento, utilizzare questo metodo per immergere il catetere elettrico pressione-volume nella soluzione per 1-2 ore.
- Preparare la soluzione di FA sciogliendo 10 mg di acido ferulico in 20 mL di ddH2O. Filtrare la soluzione attraverso una membrana da 0,22 μm. Iniettare nel ratto 1 ml/kg di soluzione di acido ferulico.
2. Preparazione del sensore
- Immergere il sensore pressione-volume in una soluzione di NaCl allo 0,9% a 37 °C per circa 30-60 minuti prima dell'inizio dell'esperimento, il che facilita la stabilità dei dati sperimentali.
- Collegare l'apparato sperimentale. Il sistema per la misurazione dei circuiti pressione-volume è costituito da un catetere pressione-volume, due unità di controllo, un'unità di registrazione e un software di esecuzione del computer. Il modulo del loop pressione-volume nel software fornirà una procedura sperimentale di riferimento.
- Premere il pulsante Start e il software registrerà automaticamente i dati di monitoraggio dal sensore pressione-volume.
- Utilizzare il software Miro-Tip Pressure Volume (MPVS) per calibrare la pressione e la conducibilità.
3. Preparazione pre-sperimentale del ratto
- Somministrare ketamina (50 mg/kg) e fentanil (0,25 mg/kg) ai ratti tramite iniezione intramuscolare5.
- Pizzicare le dita dei ratti per verificare la profondità dell'anestetico in assenza di riflessi. L'emozione influenza lo stato fisiologico dei ratti e il dolore provoca alterazioni della funzione cardiaca16. Usa rasoi per piccoli animali e creme depilatorie per rimuovere i peli nei siti chirurgici. Usa iodoforo e alcol al 75% per pulire la pelle per mantenere la sterilità.
- Immobilizzare i ratti completamente anestetizzati su una piastra riscaldante isotermica con la parte posteriore a contatto con la piastra riscaldante.
- Inserire una sonda di temperatura rivestita di vaselina nel retto del ratto. Mantenere la temperatura corporea del ratto a 37 °C ± 0,5 regolando la piastra riscaldante.
NOTA: È necessario mantenere le vie aeree libere durante l'esperimento.
4. Inserimento del catetere nell'arteria carotide destra
- Incidere la pelle sul lato destro della linea mediana del collo dei ratti, longitudinalmente. Fai un'incisione di 4 cm e separa il muscolo e il tessuto connettivo con una pinza. È visibile l'arteria carotide situata sul lato destro della trachea. L'arteria carotide destra del ratto è di colore rosso scuro, fortemente pulsante, e ha un nervo vago bianco parallelo ad essa.
- Separare l'arteria carotide da altri tessuti e nervi usando una pinza. Posizionare tre linee chirurgiche 5-0 sotto l'arteria carotide pulita. Far gocciolare una soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,9% sull'area chirurgica per mantenere l'inumidimento dell'arteria carotide.
- Taglia la pelle sopra la clavicola sinistra e stacca il tessuto intorno alla vena giugulare. Quindi, posizionare un filo chirurgico 5-0 sotto la vena giugulare sinistra.
- Utilizzare clip arteriose per sospendere il flusso sanguigno prossimalmente, utilizzando microforbici per tagliare una sezione nel vaso in cui il flusso sanguigno si è fermato. È normale che una piccola quantità di sangue compaia nella sezione trasversale della ferita. Se il sangue esce dal vaso in modo rapido e intermittente, sollevare la linea chirurgica prossimale e applicare nuovamente la pinza arteriosa.
- Inserire il catetere dalla sezione trasversale lungo l'arteria carotide in profondità nel ventricolo sinistro. Assicurarsi che il valore più basso della pressione sistolica dopo essere entrati nel ventricolo sinistro sia vicino a 0 mmHg.
- Per ottenere un ragionevole rapporto pressione-volume, regolare leggermente il catetere pressione-volume nella camera ventricolare. Per evitare una massiccia perdita di sangue e il cambiamento di posizione del catetere a causa del battito cardiaco, legare l'estremità prossimale della linea chirurgica.
NOTA: La temperatura corporea, il livello di anestesia, il segnale di pressione e il segnale di conduttanza del ratto devono rimanere stabili durante questo processo. Le vie respiratorie del ratto devono essere tenute aperte.
5. Iniezione di farmaci e calibrazione della conducibilità
- Mantenere la posizione del catetere volume di pressione nella camera ventricolare, dopo che i dati si sono stabilizzati, legare la linea chirurgica distale alla vena giugulare legata e iniettare lentamente fino a 1 ml/kg di soluzione di acido ferulico. Osservare per 5-10 min.
- Iniettare 50 μL di soluzione di NaCl al 20% dalla vena giugulare sinistra per rimuovere la conduttanza parallela generata dal miocardio. L'intervallo di volume della conduttanza parallela era di circa 130-280 μL5. Ripeti l'operazione 3 volte a intervalli di 2 minuti.
- Dopo il test della pressione ventricolare e del volume nei ratti, prelevare il sangue dall'aorta addominale del ratto utilizzando un ago per la raccolta del sangue. Mettere il sangue raccolto in una provetta di raccolta di eparina di sodio e capovolgere su e giù 2 volte per evitare la coagulazione del sangue. Sopprimere i ratti sperimentali iniettando 120 mg/kg di pentobarbital sodico attraverso la vena giugulare sinistra.
- Eseguire la conversione della conduttanza misurata in volume sanguigno effettivo utilizzando provette di calibrazione del volume di ratto. Posizionare il sangue miscelato con eparina di sodio, in sequenza, negli orifizi del tubo di calibrazione e il catetere rileva i valori di conduttanza del sangue nei diversi orifizi e li registra nel modulo di monitoraggio pressione-volume.
6. Analisi dei dati
- Aggiungendo il valore di conducibilità misurato di un volume di sangue noto nella posizione specificata, il software traccia automaticamente la curva ed estrapola la conducibilità del sangue. Utilizzare almeno tre serie di valori di conducibilità ematica per dedurre la conducibilità ematica del ratto in esame. La conducibilità del sangue è individualizzata. Per ogni ratto sottoposto al test, eseguire questa procedura individualmente.
- Calibrazione ipertonica: Sommando i dati ottenuti da tre iniezioni di soluzione salina ipertonica in una posizione specificata, il software calcola le medie di conduttanza parallela e calibra automaticamente i dati sperimentali.
- Utilizzare regioni con valori stabili di pressione sanguigna e conduttanza per analizzare la funzione ventricolare sinistra dei ratti.
- Fare clic su Analizza e il software calcolerà automaticamente una serie di parametri in base all'area selezionata, tra cui EF (frazioni di eiezione ventricolare sinistra), SW (lavoro di ictus) e CO (gittata cardiaca), ecc.
Risultati
Ogni test (n = 3) si basava sull'ingresso di un catetere di conducibilità pressione-volume nel ventricolo sinistro. Ci sono cambiamenti significativi del segnale, come un marcato aumento dell'intervallo di pressione, quando il catetere entra nel ventricolo sinistro dall'arteria carotide (Figura 1). L'analisi grafica della relazione pressione-volume viene completata tracciando il volume (μL) sull'asse Y e la pressione (mmHg) sull'asse X. La pressione ventricolare sinistra del ratto era compresa tra 10 e 105 mmHg e i valori di conduttanza del volume erano compresi tra 65 e 115 μL.
Il ciclo cardiaco completo è formato dal circuito pressione-volume in senso antiorario (Figura 2). Cambiamenti significativi nella funzione cardiaca sono stati osservati nei ratti dopo la somministrazione di acido ferulico (Figura 3). La pressione ventricolare sinistra del ratto era compresa tra 0 e 85 mmHg e i valori di conduttanza del volume erano compresi tra 30 e 100 μL.
Come mostrato nella Figura 4, i cambiamenti si verificano nel ciclo pressione-volume del ventricolo sinistro quando la soluzione salina ipertonica è stata iniettata nella vena giugulare dei ratti. A causa della misurazione diretta dei segnali di pressione e conducibilità all'interno della cavità ventricolare, l'iniezione di soluzione salina ipertonica attraverso la vena giugulare sinistra può causare un aumento dei valori di conducibilità. L'interferenza del miocardio può essere eliminata effettuando più misurazioni delle variazioni dei valori di conducibilità.
La conduttanza volumetrica della pressione è stata utilizzata per la calibrazione delle cuvette (Figura 5). In questo modo è possibile convertire i valori di conduttanza misurati in valori volumetrici.
Figura 1: Diversi cicli pressione-volume nell'arteria carotide e nel ventricolo creati dai cateteri di conducibilità pressione-volume. (A) Ci sono differenze significative nella pressione e nella conduttività tra le arterie e i ventricoli. (B) L'inserimento di un sensore miniaturizzato nel ventricolo può formare un circuito pressione-volume. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Circuito pressione-volume. Il ciclo pressione-volume comprende quattro fasi: diastole, contrazione isovolumetrica, sistole e rilassamento isovolumetrico. L'area del circuito pressione-volume rappresenta il lavoro generato da una contrazione cardiaca. Sottraendo il volume telesistolico (ESV) dal volume telediastolico (EDV) si ottiene l'uscita ventricolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La funzione ventricolare sinistra è compromessa nei ratti dopo l'iniezione di una soluzione di acido ferulico. (A) Circuito pressione-volume del ventricolo sinistro interessato. (B) La frazione di eiezione (EF) rappresenta la percentuale del volume sistolico in relazione al volume telediastolico del ventricolo: variazione della frazione di eiezione ventricolare sinistra con il conteggio dei battiti cardiaci. (C) Il volume telesistolico del ventricolo sinistro varia con l'aumentare del numero di battiti cardiaci. (D) La costante di tempo della costante di tempo del rapporto pressione-volume end-diastolico del ventricolo sinistro cambia con un aumento della frequenza cardiaca. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Variazioni di pressione e conduttanza nel ventricolo sinistro dei ratti dopo l'iniezione di una soluzione di NaCl al 20% nella vena. (A) Dati analizzati in cui la conduttività è stata alterata. (B) L'anello del volume di pressione si sposta verso destra a causa dell'aumento della conduttività. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: I cateteri di conduttanza pressione-volume sono utilizzati per misurare la conduttanza di un volume noto di cuvette riempite con sangue di ratto. (A) Conducibilità di diversi volumi. (B) Buona correlazione della conducibilità misurata con cateteri di conducibilità pressione-volume. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussione
È fondamentale adottare una strategia di dosaggio razionale per i diversi stati della funzione cardiaca. La tecnica del catetere di conduttanza pressione-volume è il modo più intuitivo per studiare la funzione ventricolare sinistra5. Questo metodo consente di studiare gli effetti dei farmaci sulla funzione cardiaca da una prospettiva completa. Descriviamo in dettaglio le varie fasi dell'esperimento. Ciò fornirà una certa facilità per lo studio della funzione cardiaca.
La tecnica del catetere di conducibilità volumetrica in pressione è il metodo più completo e rigoroso. È possibile ottenere informazioni su un massimo di 30 indicatori in un singolo esperimento, inclusi valori assoluti (pressione e volume) e valori relativi (EF), e persino alcune informazioni sul metabolismo dei farmaci.
La temperatura corporea dei ratti è stata mantenuta a 37 °C ± 0,5 durante la procedura sperimentale completa5. La perdita di sangue dai ratti deve essere ridotta al minimo durante l'esperimento5. Il volume sanguigno del ratto deve essere annotato durante l'esperimento17.
La tecnologia del catetere a conduzione pressione-volume consente il rilevamento in tempo reale dello stato dei ventricoli18. Questa tecnologia può essere molto utile per studiare l'effetto di un singolo farmaco o di una combinazione di farmaci sul cuore. Il catetere di conduttanza misurerà direttamente la pressione e la conduttanza del ventricolo sinistro. Questo è strettamente correlato alla temperatura corporea e al grado di anestesia del ratto in prova. In questo esperimento, dopo l'iniezione della soluzione di acido ferulico, i cambiamenti nella funzione ventricolare sinistra sono stati chiaramente dimostrati dal ciclo pressione-volume, compresa una diminuzione della pressione telesistolica e del volume telesistolico (Figura 2A). La frazione di eiezione ventricolare sinistra dei ratti è risultata significativamente aumentata, con un valore di picco dell'89,87% (Figura 2B). La pressione telesistolica del ventricolo sinistro nei ratti è risultata significativamente ridotta, con un valore minimo di 55,44 μL. Ciò è coerente con l'effetto farmacologico dell'acido ferulico nel ridurre la pressione sanguigna, come riportato in precedenza11.
Alcuni composti naturali presenti negli alimenti e nelle piante medicinali possono contribuire al mantenimento della salute. L'acido ferulico è un composto fenolico ampiamente presente nelle piante, tra cui il Ligusticum chuanxiong e l'Angelica sinensis19, che sono importanti principi attivi in varie medicine tradizionali cinesi. La ricerca attuale ha riportato che l'acido ferulico possiede molteplici attività biologiche, tra cui effetti antinfiammatori, antifibrotici e antiapoptotici11. È necessario studiare l'impatto di questo prodotto naturale facilmente disponibile dall'alimentazione sulla funzione cardiaca nel sistema circolatorio, sebbene la ricerca abbia indicato i suoi effetti positivi sulla struttura morfologica cardiaca12,20.
Il catetere pressione-volume può essere posizionato nella camera ventricolare dell'animale da esperimento per ottenere direttamente la pressione e la conduttanza ventricolare. La calibrazione salina e la calibrazione della cuvetta vengono utilizzate per ottenere volumi ventricolari reali. Questo esperimento consente di ottenere un ciclo continuo pressione-volume, che rifletterà visivamente i cambiamenti nella funzione ventricolare. Esistono due metodi per accedere alla camera ventricolare con il catetere volumetrico a pressione, tra cui la condizione a torace aperto e la condizione a torace chiuso. Nella condizione a torace aperto è più facile controllare la posizione del catetere volume di pressione nella cavità ventricolare. La misurazione della funzione ventricolare in condizioni di torace chiuso non richiede la respirazione assistita dell'animale, è meno dannosa per l'animale e ha un tasso di successo più elevato. Inoltre, il circuito del volume di pressione viene osservato in condizioni di torace chiuso per determinare se il catetere del volume di pressione si trova nella cavità ventricolare. Se questo catetere viene compresso dal miocardio, l'ansa del volume di pressione mostrerà un picco anomalo.
Il cuore è un organo vitale che pompa il sangue in tutto il corpo. È necessario un approccio più razionale alla valutazione della funzione cardiaca, anche prima e dopo i carichi, nonché lo stato del cuore stesso21. I loop pressione-volume vengono utilizzati per descrivere in tempo reale le variazioni della pressione e del volume della camera ventricolare centrale durante l'intero ciclo cardiaco. Questo protocollo descrive un metodo completo per misurare la funzione ventricolare sinistra con sensori miniaturizzati. La modifica del modello del microsensore nel protocollo sperimentale consente la misurazione della funzione cardiaca in diversi animali, come maiali, topi ecc. 4,8,22. L'uso di cateteri di conduttanza pressione-volume consente l'osservazione in tempo reale degli effetti dei farmaci sulla pressione e sul volume ventricolare sinistro, nonché l'impatto complessivo sul sistema circolatorio del soggetto sperimentale. Questa tecnica aiuta a ridurre al minimo i potenziali effetti negativi dei farmaci sul cuore.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Sichuan Provincial Major R&D Project (2022YFS043) e dal Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Youth Foundation Advancement Talent Special Project (QJJJ2022029).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa da 1 ml | Sartorius AG, | Germania-Mantenitore | |
| di temperatura animale | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Dual Bio Amp | Millar, Inc., USA | DA-100 | |
| Detergente in polvere enzimatico | attivo Alconox Inc., USA | 1104 | |
| Acido ferulico | Macklin Biochemical Co., Ltd, Shanghai, Cina | F900027 | |
| Trasduttori per cateteri Mikro-Tip, SPR-838NR | Millar, Inc., USA | SPR-838NR | |
| Millar Miro-Tip Volume di pressione (MPVS) Ultra | Millar, Inc., USA | SPR-869 | |
| Tosatrici elettriche per animali domestici Contea di | Jinyun New Concept Home Supplies Co., Ltd. | - | |
| Power Lab 8 / 35 | Millar, Inc., USA | PL3508 | |
| Cloruro di sodio, NaCl | Reagente chimico Kelong, Chengdu, Cina | KX829463 | |
| Veet crema depilatoria | Shanghai Songqi E-commerce Co., Ltd. |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
