Le iniezioni intrafemorali semplificate con topi vivi consentono un'analisi continua del midollo osseo

Sommario

Questo protocollo descrive l'iniezione intrafemorale di alcune cellule staminali ematopoietiche o leucemiche, comprese le cellule geneticamente modificate, in modelli murini di xenotrapianto, che consentiranno non solo il trapianto rapido e sicuro di cellule, ma anche analisi seriali del midollo osseo.

Abstract

Nonostante la complessità del trapianto di cellule ematopoietiche nell'uomo, i ricercatori eseguono comunemente iniezioni endovenose o intrafemorali (IF) nei topi. Nei modelli murini, questa tecnica è stata adattata per migliorare l'efficienza della semina delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche trapiantate (HSPC). Questo articolo descrive una dettagliata procedura tecnica passo-passo dell'iniezione di IF e della successiva aspirazione del midollo osseo (BM) nei topi che consente la caratterizzazione seriale delle cellule presenti nel midollo osseo. Questo metodo consente il trapianto di campioni preziosi con un basso numero di cellule che sono particolarmente difficili da attecchire mediante iniezione endovenosa. Questa procedura facilita la creazione di xenotrapianti che sono fondamentali per l'analisi patologica. Sebbene sia più facile accedere al sangue periferico (PB), la composizione cellulare del PB non riflette il midollo osseo, che è la nicchia per le HSPC. Pertanto, le procedure che forniscono l'accesso al compartimento midollare sono essenziali per lo studio dell'emopoiesi. L'iniezione di IF e l'aspirazione seriale del midollo osseo, come descritto qui, consentono il recupero prospettico e la caratterizzazione delle cellule arricchite nel midollo osseo, come le HSPC, senza sacrificare i topi.

Introduzione

Il sistema sanguigno è mantenuto per tutta la vita dalle cellule staminali ematopoietiche (HSC), che risiedono nel midollo osseo (BM)^1,2. Per studiare i cambiamenti dinamici nell'ambiente del midollo osseo, è importante comprendere la biologia dell'emopoiesi normale e maligna ^3,4. Il trapianto di HSC direttamente nel midollo osseo umano produce un attecchimento più elevato rispetto all'infusione di sangue periferico (PB), ma l'elevata complessità procedurale e l'aumento del rischio di infezione precludono a questo metodo di far parte della pratica standard⁵. Nei topi, le procedure che facilitano l'accesso al midollo osseo senza sacrificare gli animali forniscono una risorsa per monitorare in serie l'emopoiesi. La procedura descritta mira a produrre topi con un elevato attecchimento delle cellule trapiantate e consentire il campionamento seriale del midollo osseo di topi vivi. Questo articolo si concentrerà sulla produzione di modelli di xenotrapianto utilizzando topi immunodeficienti trapiantati con cellule umane, che sono più difficili da produrre rispetto ai modelli di allotrapianto topo-topo. Rispetto al trapianto convenzionale di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) attraverso la coda o la vena retroorbitale, i vantaggi di questa procedura sono l'elevato attecchimento cellulare con una bassa quantità di materiale di partenza.

Sebbene l'iniezione cellulare intrafemorale (IF) nella cavità midollare dei topi sia comunemente utilizzata per studiare le HSPC umane in vivo ^6,7,8, una procedura formale passo-passo che illustra/filma questa tecnica non è stata precedentemente pubblicata. Questo protocollo consente un elevato attecchimento da un basso numero di cellule trapiantate e un meccanismo per campionare il midollo osseo in serie. Inoltre, è possibile utilizzare questo metodo per analizzare gli effetti dell'iniezione di farmaci direttamente nella cavità del midollo osseo sul trattamento delle malattie del sangue. La procedura qui descritta aiuta ad ottenere l'accesso al midollo osseo dove risiedono le cellule ematopoietiche senza sacrificare i topi.

Questo protocollo è simile alla tecnica utilizzata per le aspirazioni di midollo osseo⁹. La differenza fondamentale è che questo documento e il protocollo video di accompagnamento descrivono in dettaglio una procedura sicura per l'iniezione di cellule nel midollo, mentre i documenti precedenti trapiantavano cellule attraverso la vena e quindi eseguivano l'aspirazione BM seriale. Questo protocollo consente l'attecchimento con successo con un numero ridotto di una linea cellulare (Figura 1), HSPC normali derivate dal sangue del cordone ombelicale (CB) (CD34⁺) (Figura 2) e HSC (CD34⁺CD38-CD45RA-CD90⁺) (Figura 3), HSPC normali derivate dal midollo spinale (CD34⁺CD38^-) (Figura 4), cellule staminali leucemiche derivate da pazienti (CD34⁺CD38^-) (Figura 5), HSPC normali derivate da CB modificate geneticamente CRISPR/Cas9 (CD34⁺) (Figura 6) e la leucemia mieloide acuta (AML)-iPSC (Figura 7). Soprattutto per le normali HSC derivate dal sangue del cordone ombelicale, siamo riusciti a fare l'attecchimento con solo 10 cellule. Questo metodo è particolarmente utile per gli esperimenti eseguiti con popolazioni cellulari rare o difficili da generare, come la leucemia mieloide acuta umana primaria non modificata o geneticamente modificata o le cellule CB. Inoltre, questa procedura descrive un metodo efficiente per l'analisi seriale delle cellule trapiantate, che può essere immediatamente utilizzato negli esperimenti a valle. Per evitare di sprecare campioni preziosi e garantire l'iniezione di IF, abbiamo anche brevemente descritto qui^{le 10} pratiche della procedura basata su Akaluc per aiutare a consolidare questa tecnica.

Protocollo

NOD maschio o femmina di sei-dieci settimane. I topi Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) sono stati utilizzati in questo protocollo, ma può essere applicato a tutti i tipi di topi. L'irradiazione dipende dal contenuto sperimentale e dal tipo di topi, l'irradiazione o meno dei topi dipende dagli obiettivi della ricerca. Tutte le procedure sugli animali qui descritte sono state condotte in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dal pannello amministrativo della Stanford University sulla cura degli animali da laboratorio (APLAC #22264). Tutte le normali popolazioni di cellule del sangue sono state selezionate fresche. I campioni di LMA umana sono stati ottenuti da pazienti dello Stanford Medical Center con il consenso informato, secondo i protocolli approvati dall'Institutional Review Board (IRB) (Stanford IRB, 33818).

1. Iniezione intrafemorale di linee cellulari, cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) o cellule staminali leucemiche (LSC)

NOTA: Per analizzare facilmente le cellule iniettate con un dispositivo di imaging, è stata generata una linea cellulare K562 Akaluc/tdTomato-positiva e AkaLumine-HCl/Akaluc è stato utilizzato come substrato¹⁰. Se l'apparecchiatura di imaging non è disponibile, le cellule possono essere marcate con un colorante fluorescente mediante lentivirus o PiggyBac e analizzate mediante citometria a flusso. Indipendentemente dai dettagli della preparazione cellulare, avere un modo per dimostrare che le cellule somministrate nel midollo osseo sono entrate in modo affidabile nel midollo osseo è importante per migliorare questa tecnica (Figura 1).

1. Preparare sospensioni cellulari (fino a 3 × 10-6 cellule del sangue) con 20 μL di tampone di selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) (soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) + 2% di siero fetale bovino (FBS) + 2 mM EDTA) o terreno di scongelamento (IMDM + 20% FBS + Pen/Strep) in provette da PCR o 1,5 mL e tenere in ghiaccio prima dell'iniezione.
   NOTA: Evitare di formare bolle d'aria mentre si sospendono le celle con l'ago. Le bolle devono essere rimosse il più possibile prima dell'iniezione, poiché l'iniezione di bolle d'aria può causare la morte improvvisa dei topi.
2. Condizione Topi adulti di 6-10 settimane con 200 cGy (225 kV, 13,3 mA, totale 2 Gy [Modalità di controllo della dose]) fino a 48 ore prima dell'iniezione delle cellule.
3. In primo luogo, anestetizzare i topi con inalazione di isoflurano in una camera di induzione e mantenere al 2% l'isoflurano in ossigeno al 100% a una velocità di flusso di 1-2 L/min attraverso un cono nasale per raggiungere uno stato stazionario di anestesia. Controllare la profondità dell'anestesia con un riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi e una respirazione lenta e costante e mantenere questo stato durante la procedura di isoflurano.
   NOTA: Monitorare la profondità dell'anestesia ogni 3-5 minuti durante la procedura per assicurarsi che non vi siano cambiamenti nella frequenza cardiaca e respiratoria con manipolazione chirurgica e/o pizzicamento dell'orecchio, dei piedi e della coda. Il colore delle mucose e della pelle può essere utilizzato come indicatore di ossigenazione, poiché saranno rosati se i topi sono in buone condizioni. Prestare attenzione quando vengono posizionate tende opache sul mouse, poiché non è sempre possibile vedere cosa sta succedendo con il mouse.
4. Prima della procedura, somministrare ai topi 10 mg/kg di carprofene per via sottocutanea per ridurre al minimo il dolore e riscaldare 0,5-1,0 ml di soluzione fisiologica allo 0,9% per la terapia di supporto.
5. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi del topo per evitare l'essiccazione della cornea.
6. Tenere il mouse su un termoforo o su un'altra superficie controllata termostaticamente per evitare l'ipotermia durante la procedura.
   NOTA: Dopo la procedura, viene utilizzato un termoforo regolabile in temperatura. La temperatura corporea del mouse è in genere di 37-39 °C e il pad dovrebbe idealmente essere leggermente inferiore a questo. In pratica, la temperatura è spesso impostata a 32-36 °C.
7. Disinfettare l'intera gamba contenente il femore da iniettare con tre serie di scrub alternati (alternati con uno scrub allo iodio povidone o clorexidina e spugne di garza imbevute di etanolo al 70%).
   NOTA: 1) Se l'operatore è mancino, il femore sinistro del topo potrebbe essere più facile da iniettare rispetto al femore destro. 2) In questo studio, la pelliccia non è stata rimossa per le iniezioni per evitare inutili danni alla pelle e il sito di ingresso dell'ago può essere facilmente individuato senza tagliare la pelliccia. Tuttavia, nei topi con pelo scuro, potrebbe essere difficile individuare il sito di puntura, nel qual caso prendi in considerazione la possibilità di tagliare il pelo in quanto è facile e veloce iniziare l'iniezione.
8. Pizzica delicatamente il femore con il pollice e l'indice per stabilizzare la gamba. Spingi la tibia con l'anulare o il quinto dito per mantenere la tibia piegata dal femore. Il posizionamento è importante per la riuscita dell'iniezione (Figura supplementare S1-S5).
   NOTA: Utilizzare una pinza per pizzicare l'osso per evitare lesioni alle dita; Tuttavia, potrebbe essere difficile sentire l'asta del femore e aggiungerà tempo alla procedura.
9. Inserire un ago sterile vuoto da 27 G (1/2 pollice) con una siringa attaccata appena sotto il tendine rotuleo in modo che l'ago sia alloggiato saldamente tra i due condili del femore. Usa il bordo dell'ago e becca leggermente il tendine rotuleo sopra il femore un paio di volte per trovare il punto migliore per inserire l'ago (Figura supplementare S1-S5).
   NOTA: Prima di eseguire questa procedura è necessaria una conoscenza dell'anatomia dell'area del ginocchio del topo. I principianti dovrebbero prendersi il tempo necessario per comprendere l'anatomia dell'area e praticare la procedura su un topo soppresso prima di provarla su un topo vivo.
10. Ruotare l'ago verso l'esterno e verso l'alto per assicurarsi che sia parallelo all'asta del femore.
    NOTA: Questa manovra fornisce un percorso affidabile verso la cavità midollare, facilita il recupero del contenuto del midollo dall'asta femorale e riduce al minimo il disagio per l'animale a causa della procedura.
11. Girare l'ago in cerchio mentre avanza lentamente nella cavità del midollo femorale. Inserire l'ago fino a quando non si verifica una notevole riduzione della resistenza. Confermare il corretto posizionamento dell'ago muovendo delicatamente la siringa lateralmente. Se è possibile toccare il bordo dell'ago con le dita che escono dall'osso, tornare al passaggio 1.9 e trovare un altro angolo e un altro punto per forare l'ago.
    1. Assicurarsi che l'angolo di ingresso dell'ago sia perpendicolare all'estremità dell'osso.
       NOTA: In teoria, l'ago deve essere iniettato parallelamente al femore e deve essere ad un angolo di 90° rispetto alle estremità ossee. Se c'è resistenza dalla superficie interna, l'ago è stato posizionato correttamente nella cavità femorale. Per assicurarti che l'ago sia parallelo all'osso, posiziona una luce sul lato dell'osso e osserva l'ombra dell'osso parallela all'asta dell'ago. La diminuzione della resistenza all'ingresso nella cavità del midollo osseo dipende dall'età del topo: più giovane è il topo, più è facile riconoscere la diminuzione della resistenza.
12. Creare una pressione negativa tirando delicatamente indietro lo stantuffo dell'ago mentre si sposta l'ago avanti e indietro all'interno della cavità BM. Se l'ago si trova nella cavità del midollo osseo, nella siringa uscirà del sangue/midollo.
    1. Se il sangue/midollo non viene visto, passare a un nuovo ago e cercare di trovare lo stesso percorso.
       NOTA: Il motivo per passare a un nuovo ago è che una volta che l'osso ostruisce l'ago, diventa difficile controllare il riflusso del sangue/midollo. Ridurre al minimo il numero di vie di iniezione nella cavità del midollo osseo è fondamentale, poiché le cellule iniettate nel midollo osseo hanno il potenziale per fuoriuscire dal femore attraverso i precedenti punti di ingresso. Se sono necessarie più vie di iniezione, il rischio di perdite può essere ridotto iniettando le cellule gradualmente piuttosto che in un bolo rapido.
13. Rimuovere lentamente l'ago e inserire la siringa contenente le cellule attraverso lo stesso percorso. Provare a inserire l'ago fino a quando non si ferma (sul bordo della cavità del midollo osseo) e tirare leggermente indietro (1-2 mm) da lì per iniettare facilmente le cellule. Prima di premere lo stantuffo e rilasciare le cellule, aspirare leggermente e controllare la presenza di sangue/midollo per garantire il corretto posizionamento dell'ago. Controllare prima il riflusso del sangue/midollo e poi spingere lentamente la siringa per iniettare le cellule.
    NOTE: È molto importante ricordare la via e l'angolo della prima iniezione quando si passa a un nuovo ago. Se non si riesce a trovare lo stesso percorso, riprovare con l'ago originale utilizzato per effettuare il primo percorso. A questo punto può essere utilizzato un nuovo ago, ma se viene utilizzato l'ago originale, l'osso inceppato deve essere espulso una volta prima dell'uso. Non utilizzare l'ago con le cellule per trovare una nuova via per l'iniezione; In caso contrario, pezzi di osso incastrati nell'ago possono impedire la dispersione cellulare. Sebbene la cavità del midollo osseo sia molto piccola, il volume di iniezione dovrebbe essere inferiore a 30 μL, considerando la cavità morta.
    1. Assicurarsi che la velocità di iniezione sia lenta per evitare che l'aria nella siringa penetri nel midollo osseo e per evitare la fuoriuscita di cellule dal sito di puntura. Se si avverte resistenza mentre si spinge la siringa, muovere l'ago su e giù per trovare un'area meno resistente nella cavità.
14. Una volta che le cellule sono state iniettate con successo nel femore, rimuovere l'ago e la siringa dal topo mantenendo la pressione sulla siringa.
    NOTA: Riprovare con l'altro femore se l'iniezione non può essere completata. La procedura è molto stressante per il topo, anche sotto anestesia. Monitorare sempre i segni vitali (cuore e frequenza respiratoria) del mouse e cercare di terminare la procedura il prima possibile.
15. Rimuovere il mouse dal cono del naso e posizionarlo su un tovagliolo di carta pulito per evitare l'aspirazione della biancheria da letto. Durante il recupero, tenere il mouse su un termoforo o su un'altra superficie controllata termostaticamente. Monitorare tutti i mouse per verificare il recupero dall'anestesia prima di rimetterli sul supporto per mouse.
    NOTA: Non dovrebbero esserci complicazioni o angoscia dopo l'aspirazione se eseguita correttamente. La procedura sarà completata quando i topi anestetizzati si saranno ripresi e saranno in grado di deambulare e raggiungere cibo e acqua.
16. Osservare i topi per segni di angoscia o infezione dopo la procedura nelle successive 24 ore. I segni di angoscia o infezione includono sanguinamento costante, anemia e letargia. Se uno di questi segni si nota dopo la procedura, sopprimere l'animale (o gli animali) mediante inalazione di CO₂ o lussazione cervicale secondo il protocollo di manipolazione degli animali.

2. Aspirazione di cellule del midollo osseo dal femore per l'analisi FACS

NOTA: La procedura per aspirare le cellule BM dai topi è molto simile ai metodi descritti nella sezione 1 e può essere appresa da alcune pubblicazioni precedenti ^9,11,12. Di seguito è riportata una panoramica di alcune differenze tra i protocolli di iniezione e aspirazione del midollo osseo.

1. Preparare 500 μl di PBS + 10 mM di EDTA (terreno di sospensione cellulare: CSM) per campione per sospendere l'aspirazione del midollo osseo.
2. Inumidire una siringa da 0,5 ml da 27 G con CSM prima di aspirare il BM. Riempire la siringa con 200-500 μL di CSM ed espellerla immediatamente. Ripetere questa procedura 2-3 volte.
3. Aspirare delicatamente il midollo osseo ritirando lo stantuffo della siringa ottenendo 20-50 μl di midollo osseo di topo. Quindi, rimuovere completamente l'ago dal femore e sospendere il campione aspirato in CSM (500 μl in una provetta da 1,5 mL) per la successiva fase di colorazione. Rimuovi il mouse dal cono del naso e posizionalo su un tovagliolo di carta pulito per evitare l'aspirazione della biancheria da letto durante il recupero. Monitorare tutti i mouse per verificare il recupero dall'anestesia prima di rimetterli sul supporto per mouse.
   NOTA: L'aspirazione/campionamento del midollo osseo può essere ripetuta, ma la procedura ripetuta lo stesso giorno deve essere eseguita sul femore opposto per evitare traumi ripetuti alla stessa gamba. Sebbene ci siano poche informazioni sulla frequenza dell'aspirazione del midollo osseo, riteniamo che l'aspirazione del midollo osseo femorale venga generalmente ripetuta ogni 4 settimane e possa essere eseguita almeno 3-4 volte in totale senza problemi (ad esempio, infezione) in base alla nostra esperienza. Tuttavia, va tenuto presente che il midollo osseo sul lato controlaterale del midollo osseo trapiantato ha generalmente un attecchimento cellulare inferiore.
4. Le cellule in pellet del midollo osseo vengono aspirate con una centrifuga di 5 minuti a 300 × g, 4 °C.
5. Aspirare il surnatante, aggiungere 0,5-1 mL di tampone di lisi ACK (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA) a ciascuna provetta e agitare per risospendere le cellule. Mettere sul ghiaccio per 5-10 minuti.
6. Filtrare ogni tubo attraverso una rete di nylon in un nuovo tubo.
7. Sciacquare la provetta con 1 mL di tampone FACS e aggiungerlo attraverso la rete di nylon in una nuova provetta.
8. Celle a pellet con centrifuga di 5 minuti a 300 × g, 4 °C.
9. Aspirare il surnatante e aggiungere la soluzione colorante contenente gli anticorpi desiderati¹³. Mettere sul ghiaccio per 20 min.
10. Lavare le cellule e analizzarle secondo la configurazione sperimentale.
    1. Lavare le cellule con tampone FACS (PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) e colorarle con anticorpi per 30 minuti su ghiaccio in un volume totale di 50 μL. Lavare e colorare le cellule con ioduro di propidio (PI) a una concentrazione finale di 1 μg/mL immediatamente prima dell'analisi o della cernita. Eseguire analisi post-ordinamento per verificare la purezza delle popolazioni cellulari selezionate.
       NOTA: Tutti gli anticorpi utilizzati per la citometria a flusso sono descritti in dettaglio nella Tabella dei materiali.
    2. Utilizzare le seguenti strategie di gating FACS (Figura 2-7) per analizzare le cellule innestate dal midollo osseo di topo.
       1. Distinguere le popolazioni di cellule in base alle loro proprietà di dispersione diretta (dimensione) e laterale (granularità).
       2. Esegui la discriminazione del doppietto tracciando FSC-H vs FSC-W, seguendo SSC-H vs SSC-W.
       3. Escludi le celle morte.
       4. Distinguere le popolazioni di cellule in base al CD45 umano e al CD45 di topo. Queste combinazioni di colorazione degli anticorpi consentono di rilevare i CD3, CD19 e CD33 umani e all'interno della frazione CD45 umana.
          NOTA: Prima di colorare i campioni, ricordarsi di utilizzare blocchi Fc di topo e umani per evitare il legame di anticorpi non specifici. Di solito si colora con i blocchi Fc (topo + uomo) per 10 minuti sul ghiaccio e poi si aggiungono gli anticorpi senza lavare le cellule. Fare riferimento alle istruzioni di ciascuna azienda su come utilizzare gli anticorpi del blocco Fc.

Risultati

Seguendo questi protocolli 1,14,15,16,17,18,19,20, ogni campione è stato trapiantato ed è stato stabilito il modello murino di xenotrapianto. Lo scopo degli esperimenti qui era quello di mostrare l'iniezione di IF con diversi tipi di cellule umane e dopo l'...

Discussione

I modelli murini di xenotrapianto sono importanti per lo studio dell'emopoiesi umana sia normale che patologica. Il midollo osseo è la fonte dell'emopoiesi³; pertanto, lo studio delle malattie ematologiche richiede l'attecchimento di cellule staminali umane rare nel midollo osseo murino. Finora, sono stati riportati metodi di trapianto come una vena caudale, una vena retroorbitale e l'iniezione di IF, ed è noto che ognuno di questi metodi può attiantarsi le cellul...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringa da 1/2 mL, 27 g	BD	305620	https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620
ACK Lysing Buffer	Qualoty Biological	118-156-101CS	https://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/
Irradiatore biologico	Kimtron	IC-250	https://www.kimtron.com/ic-250
Clorexidina	Nolvasan	NDC 54771-8701-1	https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser
Alcool etilico, proof 190	Gold Shield		https://goldsd.com/line-card/
FACSCanto II	(Becton Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, USA
Siero fetale bovino (FBS)	Citometro	a flusso https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/	FB-01
, AriaII	Beckton Dickinson (BD)		selezione cellulare
IMDM	Gibco	12440053	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053
Isoflurano, USP	Dechra	NDC 17033-094-25	https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) topi	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA	br/> Ceppo #:005557	Maschio o femmina da sei a dieci settimane
Unguento oftalmico, USP	Bausch Lomb	NDC 24208-780-55	https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a 7a202cc5a0673c977/neomycin-and-polymyxin-b-sulfates-gramicidin-ophthalmic-solution.pdf
OstiFen Injection (Caprofen)	VetOne	NDC 13985-748-20	http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b
PBS, pH 7.4	fatto in casa
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Povidone-iodio	Betadine	NDC 67618-155-16	https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/
TokeOni (negli Stati Uniti)	Sigma-Aldrich	808350-5MG	AkaLumine-HCl/Akaluc; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020
Pannello anticorpale per attecchimento (in vivo, midollo osseo di topo)
Antigen			Diluizione
Antigeni: Anti-umano CD45 Fluoroforo: V450 Clone: HI30	BD Biosciences	560367	1:25
Antigeni: Anti-topo CD45.1 Fluoroforo: PE-Cy7 Clone: A20	eBioscience	25-0453-81	1:50
Antigen:Anti-mouse TER-119 Fluorophore: PE-Cy5 Clone: TER-119	eBioscience	15-5921-83	1:100
Antigen:Anti-umano CD3 Fluorophore: APC-Cy7 Clone: SK7	BD Biosciences	341090	1:12.5
Antigen:Anti-umano CD19 Fluorophore: APC Clone: HIB19	BD Biosciences	555415	1:25
antigene:Anti-umano CD33 fluoroforo: PE Clone: WM53	BD Biosciences	555450	1:25
Vivo/Colorazione morta			Conc.
PI	Invitrogen		1 μ g/mL
Perle di compensazione
Controllo negativo	BD Biosciences		Vedere le istruzioni per i dettagli
Ig anti-topo, κ	BD Biosciences Vedere le		istruzioni per i dettagli