Qui, descriviamo un metodo per l'isolamento intestinale da larve di pesce zebra a 5 giorni dopo la fecondazione, per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula.
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Articolo metodologico
Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il tratto gastrointestinale (GI) svolge una serie di funzioni essenziali per la vita. I difetti congeniti che ne influenzano lo sviluppo possono portare a disturbi neuromuscolari enterici, evidenziando l'importanza di comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale. In questo studio, presentiamo un metodo per l'isolamento intestinale da larve di zebrafish a 5 giorni dopo la fecondazione per ottenere cellule vive e vitali che possono essere utilizzate per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq). Questo protocollo si basa sulla dissezione manuale dell'intestino del pesce zebra, seguita dalla dissociazione enzimatica con la papaina. Successivamente, le cellule vengono sottoposte a selezione cellulare attivata dalla fluorescenza e le cellule vitali vengono raccolte per scRNA-seq. Con questo metodo, siamo stati in grado di identificare con successo diversi tipi di cellule intestinali, tra cui cellule epiteliali, stromali, del sangue, muscolari e immunitarie, nonché neuroni enterici e glia. Pertanto, lo consideriamo una risorsa preziosa per studiare la composizione del tratto gastrointestinale in salute e malattia, utilizzando il pesce zebra.
Introduzione
Il tratto gastrointestinale (GI) è un sistema complesso che svolge un ruolo fondamentale nella salute e nel benessere generale. È responsabile della digestione e dell'assorbimento dei nutrienti, nonché dell'eliminazione dei prodotti di scarto 1,2. Il tratto gastrointestinale è composto da più tipi di cellule, tra cui cellule epiteliali, cellule muscolari lisce, cellule immunitarie e sistema nervoso enterico (ENS), che comunicano strettamente tra loro per regolare e mantenere la corretta funzione intestinale 3,4,5. I d....
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Protocollo
Tutti gli allevamenti e gli esperimenti di zebrafish sono stati condotti secondo le linee guida istituzionali dell'Erasmus MC e la legislazione sul benessere degli animali. L'uso di larve di pesce zebra a 5 giorni dalla fecondazione rientra nella categoria degli esperimenti che non richiedono un'approvazione etica formale, come delineato dalle normative olandesi.
1. Ottenimento di 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) wildtype e larve di tg (phox2bb: GFP)
- Avviare l'allevamento di zebrafish wildtype e raccogliere 50 uova in terreno E3 tamponato con HEPES (di seguito denominato E3) in una capsula di Petri da ....
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Risultati
Con questo protocollo, abbiamo ottenuto con successo l'isolamento e la dissociazione di interi intestini da 5 larve dpf. Utilizzando la papaina come enzima di dissociazione, abbiamo migliorato significativamente la vitalità cellulare, consentendo la cattura di 46.139 eventi che coinvolgono singole cellule vitali (6,4% di tutte le cellule) su 244 intestini isolati (Figura 2A). Le larve intere di tipo selvatico sono state utilizzate come controllo per garantire che il processo di selezione fos.......
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Discussione
Qui, presentiamo un metodo per l'isolamento e la dissociazione dell'intestino di 5 larve di pesce zebra dpf utilizzando FACS. Con questo metodo, diversi tipi di cellule intestinali sono stati raccolti e analizzati con successo da scRNA-seq, utilizzando la piattaforma 10x Genomics Chromium. Abbiamo selezionato la linea di zebrafish tg(phox2bb:GFP), in quanto volevamo un'indicazione che anche le cellule ENS vitali sarebbero state isolate (Figura 2D). Tuttavia, è importante notare che .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Amici di Sophia (SSWO WAR-63).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10x Tripsina (0,5%)-EDTA (0,2%)Sigma | 59418C | ||
| Provetta a fondo tondo da 5 mL con tappo per filtro cellulare | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5mL (provette FACS) tappo a scatto | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Microscopio di dissezione | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III selezionatrice | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS con CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Perni per insetti Strumenti per la | scienza fine | 26000-25 | |
| L-Cisteina | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaina | Supelco | A5040-250G | |
| Papaina | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Tripan blu | Sigma | Gatto#T8154 |
Riferimenti
- Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
- Sitrin, M. The Gastrointestinal System. , (2014).
- Fu....
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Ristampe e permessi
