Gli studi strutturali e biochimici dei trasportatori di membrana umani richiedono quantità di milligrammi di proteine stabili, intatte e omogenee. Qui descriviamo metodi scalabili per lo screening, l'espressione e la purificazione di trasportatori di soluti umani utilizzando geni ottimizzati per i codoni.
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Articolo metodologico
Espressione e purificazione ad alto rendimento di vettori di soluti umani per studi strutturali e biochimici
In questo articolo
Sommario
Abstract
I trasportatori di soluti (SLC) sono trasportatori di membrana che importano ed esportano una serie di substrati endogeni ed esogeni, tra cui ioni, nutrienti, metaboliti, neurotrasmettitori e prodotti farmaceutici. Nonostante sia emerso come interessanti bersagli terapeutici e marcatori di malattia, questo gruppo di proteine è ancora relativamente poco drogato dai farmaci attuali. I progetti di scoperta di farmaci per questi trasportatori sono ostacolati da limitate conoscenze strutturali, funzionali e fisiologiche, in ultima analisi a causa delle difficoltà nell'espressione e nella purificazione di questa classe di proteine incorporate nella membrana. Qui, dimostriamo i metodi per ottenere quantità di milligrammi ad alta purezza di proteine trasportatrici SLC umane utilizzando sequenze geniche ottimizzate per il codone. In combinazione con un'esplorazione sistematica della progettazione dei costrutti e dell'espressione ad alto rendimento, questi protocolli garantiscono la conservazione dell'integrità strutturale e dell'attività biochimica delle proteine bersaglio. Evidenziamo anche i passaggi critici nell'espressione delle cellule eucariotiche, nella purificazione dell'affinità e nella cromatografia ad esclusione dimensionale di queste proteine. In definitiva, questo flusso di lavoro produce preparazioni proteiche pure, funzionalmente attive e stabili adatte per la determinazione della struttura ad alta risoluzione, studi di trasporto, saggi di coinvolgimento di piccole molecole e screening in vitro ad alto rendimento.
Introduzione
Le proteine di membrana sono state a lungo bersagli sia per i ricercatori che per le industrie farmaceutiche. Di questi, i trasportatori di soluti (SLC) sono una famiglia di oltre 400 geni trasportatori secondari codificati all'interno del genoma umano1. Questi trasportatori sono coinvolti nell'importazione e nell'esportazione di numerose molecole, tra cui ioni2, neurotrasmettitori3, lipidi 4,5,6,7, amminoacidi 8, nutrienti 9,10,11 e prodotti farmaceutici
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Protocollo
NOTA: Tutti i geni RESOLUTE SLC ottimizzati per codone sono stati depositati in AddGene43, i cui link sono disponibili nell'elenco dei reagenti pubblici RESOLUTE44. Questi geni sono stati clonati nel plasmide pDONR221 e consentono la clonazione diretta dei geni nel vettore di destinazione utilizzando la clonazione di ricombinazione45. Per massimizzare il parallelismo, le cellule batteriche, di insetto e di mammifero vengono coltivate in formato blocco rispettivamente per la produzione di bacmid (sezione 3), l'amplificazione del baculovirus (sezione 5) e i test di espressione (sezione 6). Per quest....
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Risultati
I geni SLC possono essere clonati da plasmidi resolute pDONR in vettori BacMam per l'espressione nei mammiferi
I protocolli descritti per il clonaggio, l'espressione e la purificazione si sono dimostrati efficaci per molti trasportatori SLC attraverso più ripiegamenti proteici. Tuttavia, le procedure includono diversi punti di controllo per il monitoraggio dei progressi, consentendo l'ottimizzazione per tenere conto delle differenze di espressione, ripiegamento delle proteine, stabilità dipendente dai.......
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Discussione
Lo sviluppo di terapie mirate a SLC è rimasto ostacolato a causa dell'assenza di una caratterizzazione sistematica della funzione del trasportatore. Ciò ha portato a un numero sproporzionato di farmaci che hanno come bersaglio questa classe proteica rispetto ai GPCR e ai canali ionici63, nonostante i loro numerosi ruoli nei processi normali e fisiopatologici. RESOLUTE è un consorzio internazionale che mira a sviluppare tecniche e strumenti di ricerca all'avanguardia per accelerare e migliorare l'a.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato svolto nell'ambito del progetto RESOLUTE. RESOLUTE ha ricevuto finanziamenti dall'impresa comune Iniziativa in materia di medicinali innovativi 2 nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 777372. L'impresa comune riceve il sostegno del programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea e dell'EFPIA. Questo articolo riflette solo il punto di vista degli autori e né l'IMI né l'Unione europea e l'EFPIA sono responsabili per qualsiasi uso che possa essere fatto delle informazioni in esso contenute. Il plasmide pHTBV è stato gentilmente fornito dal Prof. Frederick Boyce (Harvard).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Proteasi 3C | Prodotto internamente | ||
| Concentratori centrifughi cut-off da 50 o 100 kDa | Sartorius | VS0242 | |
| 5-Cicloesil-1-pentil-β-D-maltoside | Anatrace | C325 | CYMAL-5 |
| Kit di purificazione del bacmide a 96 pozzetti | Millipore | LSKP09604 | Montage Plasmide Miniprep |
| Blocco a 96 pozzetti (2 mL) | Greiner Bio-One | 780271 | |
| Guarnizioni adesive in plastica | Qiagen | 19570 | Tape Pads |
| Colonna cromatografica ad esclusione dimensionale | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL |
| Benzonase DNAse | Prodotto internamente | ||
| BisTris | Sigma Aldrich | B9754 | |
| Cholesteryl Hemisuccinate Tris sale | Anatrace | CH210 | CHS |
| Resina di affinità per metalli al cobalto | Takara Bio | 635653 | TALON Resina di affinità per metalli |
| D(+)-Biotina | Sigma Aldrich | 851209 | |
| Colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale con destallo-agarosio | Cytiva | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 |
| GL Digitonin | Apollo Scientific | BID3301 | |
| Dounce tessuto macinatore (40 mL) | DWK Life Sciences | 357546 | |
| cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA | Sigma Aldrich | 4693132001 | cOmplete, senza EDTA Cocktail di inibitori della proteasi |
| Fetale Siero bovino fetale | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fos-Choline-12 | Anatrace | F308S | FS-12 |
| Glicerolo | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Glico-diosgenina | Anatrace | GDN101 | GDN |
| Colonne di flusso a gravità | Cole-Parmer | WZ-06479-25 | |
| HEK293 medio | Thermo Fisher | 12338018 | FreeStyle 293 medio |
| HEPES | Apollo Scientific | BI8181 | |
| Colonna UHPLC in silice neutra | idrofila Sepax | 231300-4615 | Unix-C SEC-300 4,6 x 150 |
| Imidazole | Sigma Aldrich | 56750 | |
| Reagente per trasfezione di insetti | Sigma Aldrich | 71259 | Reagente |
| Lauryl Maltosio, Neopentyl Glycol | Anatrace | NG310 | LMNG |
| , Cloruro di magnesio esaidrato | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Agitatore di microespressione | Glas-Col | 107A DPMINC24CE | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| n-decil-beta;-D-maltoside | anatrace | D322 | DM |
| n-dodecil-b-D-maltopiranoside | anatrace | D310 | DDM |
| n-dodecil-n,n-dimetilammina-n-ossido | anatrace | D360 | LDAO |
| n-nonil-β-D-glucopiranoside | anatrace | N324S | NG |
| n-ottil-d17-β- D-glucopiranoside | Anatrace | O311D | OGNG |
| Octaethylene Glycol Monododecyl Ether Anatrace | O330 | C12E8 | |
| Octyl Glucose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG311 | OGNG |
| Phosphate Salin tamponato | Sigma Aldrich | D8537 | DPBS |
| Poliossietilene(10)dodecil etere | Anatrace | AP1210 | C12E10 |
| Poliossietilene(9)dodecil etere Anatrace | APO129 | C12E9 | |
| Guarnizione porosa per piastre di coltura tissutale | VWR | 60941-084 | Film di rayon per colture biologiche |
| Proteinasi K | New England Biolabs | P8107S | |
| Miscela di enzimi di ricombinazione | Thermo Fisher | 11791020 | Gateway LR Clonase II |
| Terreni di coltura per insetti privi di siero | Gibco | 10902088 | Sf-900 II terreni senza siero |
| Butirrato di sodio | Sigma Aldrich | 303410 | |
| Sonda sonicatrice a 24 teste | Sonics | 630-0579 | |
| Unità di alimentazione del sonicatore | Sonics | VCX 750 | |
| Resina Strep-Tactin | IBA Life Sciences | 2-5030-025 | Strep-TactinXT 4Flow resina ad alta capacità |
| Saccarosio | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Saccarosio Monododecanoato | Anatrace | S350 | DDS |
| Cellule HEK293 adattate alla sospensione | Thermo Fisher | A14527 | Expi293F |
| Reagente di trasfezione | Sigma Aldrich | 70967 | Reagente di trasfezione GeneJuice |
Riferimenti
- Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
- Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science
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Ristampe e permessi
