La microdissezione a cattura laser dei tessuti di fibrosi sottomucosa orale consente l'estrazione precisa di cellule dalle regioni istologiche di interesse per l'analisi di dati multi-omici con informazioni morfologiche e spaziali.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Isolamento di cellule con informazioni morfologiche e spaziali da campioni di fibrosi sottomucosa orale mediante microdissezione a cattura laser
In questo articolo
Sommario
Abstract
La fibrosi sottomucosa orale (OSF) è un tipo comune di disturbo potenzialmente maligno nella cavità orale. L'atrofia dell'epitelio e la fibrosi della lamina propria e della sottomucosa si riscontrano spesso sui vetrini istopatologici. È stato proposto che la displasia epiteliale, l'atrofia epiteliale e i fibroblasti senescenti siano associati alla trasformazione maligna della OSF. Tuttavia, a causa dell'eterogeneità delle malattie orali potenzialmente maligne e del carcinoma orale a cellule squamose, è difficile identificare i meccanismi molecolari specifici della trasformazione maligna nella OSF. Qui, presentiamo un metodo per ottenere un piccolo numero di cellule epiteliali o mesenchimali che trasportano dati morfologici e informazioni spaziali mediante microdissezione a cattura laser su vetrini di tessuto fissati in formalina e inclusi in paraffina. Utilizzando un microscopio, possiamo catturare con precisione il tessuto epiteliale displastico o atrofico su microscala (~500 cellule) e il tessuto subepiteliale fibrotico. Le cellule estratte possono essere valutate mediante sequenziamento del genoma o del trascrittoma per acquisire dati genomici e trascrittomici con informazioni morfologiche e spaziali. Questo approccio rimuove l'eterogeneità del sequenziamento di tessuti OSF e l'interferenza causata dalle cellule in aree non lesionate, consentendo un'analisi spazio-omica precisa del tessuto OSF.
Introduzione
La fibrosi sottomucosa orale (OSF) è una malattia cronica e insidiosa che si sviluppa principalmente nella mucosa vestibolare e provoca una limitazione dell'apertura della bocca1. Mentre l'OSF è una malattia multifattoriale, la masticazione della noce di areca o della noce di betel è la causa principale dell'OSF 2,3. A causa di questa abitudine geograficamente specifica, l'OSF è prevalentemente concentrata nelle popolazioni del sud-est e del sud dell'Asia3. Le caratteristiche istologiche comuni dell'OSF includono la deposizione anomala di collagene nel tessuto co....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale della Scuola e dell'Ospedale dell'Università di Pechino. Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti. I campioni di tessuto utilizzati in questo studio sono stati resi anonimi. Lo schema di studio è illustrato nella Figura 1.
1. Preparazione del campione
- Tagliare i tessuti di fibrosi sottomucosa orale fissati in formalina e inclusi in paraffina in sezioni continue di 3 μm e 10 μm di spessore su un microtomo.
- Aprire le sezioni in acqua e poi pescare sugli scivoli. Fissare le sezioni da 3 μM e 10 μ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Eseguendo la microdissezione laser dei tessuti OSF, abbiamo catturato campioni di epitelio displastico, stroma sotto l'epitelio displastico, epitelio atrofico e stroma sotto il tessuto epiteliale atrofico (Figura 1). Attraverso l'estrazione del DNA e il sequenziamento dell'intero genoma a bassa profondità, siamo stati in grado di analizzare le alterazioni del numero di copie (CNA) correlate alla morfologia15. La CNA è una forma comune di instabilità genomica associata.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo protocollo ha riportato una pipeline per catturare campioni di tessuto OSF con informazioni morfologiche e spaziali per ulteriori analisi spazio-omiche attraverso la microdissezione laser. Dai risultati rappresentativi, abbiamo identificato diversi modelli CNA tra vari campioni correlati alla morfologia.
L'OSF, un tipo di OPMD, è una condizione precancerosa comune del carcinoma orale a cellule squamose6. È stato riportato che l'instabilità genomica è associata al.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni di ricerca della National Nature Science Foundation of China (81671006, 81300894), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-038), National clinical key discipline construction project (PKUSSNKP-202102), Innovation Fund for Outstanding Doctoral Candidate of Peking University Health Science Center (BMU2022BSS001).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vetrini per microscopio di adesione | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-ematossilina | YiLi | 20230326 | |
| soluzione di eosina | BASO | BA4098 | |
| Etanolo | PEKING REAGENTE | No.32061 | |
| Harris hematoxylin soluzione colorante | YiLi | 20230326 | |
| Piastra riscaldante | LEICA | HI1220 | |
| Sistema di microdissezione a cattura laser | LEICA | LMD7 | Macchina |
| Microdissezione laser | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Mezzo di montaggio Micromount | LEICA | REF.3801731 | |
| Vetro di copertura del | microscopio CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtomo | LEICA | RM2235 | |
| Provette per PCR | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-vetrini LEICA | No.11505158 | ||
| Soluzione Re-blue | YiLi | 20230326 | |
| Acqua distillata ultrapura | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| REAGENTE PEKING | xilene | No.33535 |
Riferimenti
- Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
- Cai, X., Huang, J. Clinicop....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
