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Articolo metodologico

Interazione tra batteriofago T4 ed E. coli nell'intestino murino: un modello prototipico per lo studio delle dinamiche ospite-batteriofago in vivo

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DOI:

10.3791/65906

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26 gennaio 2024

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1Department of Microbiology and Immunology, Life Sciences Institute, University of British Columbia, 2Department of Biology, San Diego State University, 3School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 4Humans and the Microbiome Program, Canadian Institute for Advanced Research

In questo articolo

Sommario

I batteriofagi (fagi), virus che infettano i batteri, sono parte integrante del microbioma intestinale. Sebbene questi abitanti simbiotici guidino la fitness batterica e le dinamiche di popolazione, si sa poco su come influiscono sull'omeostasi intestinale e sulle malattie. Questo protocollo studia i fagi T4 isolati all'interno di un modello murino, adattabile ad altre coppie fago-batterio.

Abstract

I batteriofagi (fagi) sono virus che infettano i batteri con specificità a livello di specie e ceppo e sono le entità biologiche più abbondanti in tutti gli ecosistemi conosciuti. All'interno delle comunità batteriche, come quelle che si trovano nel microbiota intestinale, i fagi sono implicati nella regolazione delle dinamiche di popolazione del microbiota e nel guidare l'evoluzione batterica. Nell'ultimo decennio c'è stato un rinnovato interesse per la ricerca sui fagi, in parte a causa delle capacità di uccisione dei fagi litici specifici per l'ospite, che offrono uno strumento promettente per contrastare la crescente minaccia dei batteri resistenti agli antimicrobici. Inoltre, recenti studi che dimostrano che i fagi aderiscono al muco intestinale suggeriscono che potrebbero avere un ruolo protettivo nel prevenire l'invasione batterica nell'epitelio sottostante. È importante sottolineare che, come i microbiomi batterici, i fageomi interrotti sono stati associati a esiti peggiori in malattie come le malattie infiammatorie intestinali. Studi precedenti hanno dimostrato che i fagi possono modulare il microbioma degli animali e degli esseri umani attraverso trapianti di filtrato fecale, a beneficio della salute dell'ospite. Con questa recente ondata di ricerca arriva la necessità di stabilire e standardizzare protocolli per lo studio dei fagi nel contesto del microbioma intestinale. Questo protocollo fornisce una serie di procedure per studiare i fagi T4 isolati e il loro ospite batterico, Escherichia coli, nel contesto del tratto gastrointestinale murino. I metodi qui descritti delineano come partire da un lisato fagico, somministrarlo ai topi e valutare gli effetti sui livelli di ospite batterico e fagico. Questo protocollo può essere modificato e applicato ad altre coppie fago-batterio e fornisce un punto di partenza per lo studio delle dinamiche ospite-fago in vivo.

Introduzione

I batteriofagi, o fagi, sono virus che infettano e uccidono i batteri con specificità a livello di specie e ceppo1. I fagi svolgono un ruolo importante all'interno di comunità batteriche complesse come il microbiota intestinale, dove sono stati implicati nella regolazione delle dinamiche di popolazione e nel guidare la fitness batterica2. Nel corso dell'ultimo decennio, c'è stato un rinnovato interesse per la ricerca sui fagi a causa dell'aumento dei patogeni resistenti agli antimicrobici3 e del potenziale della terapia fagica come strategia di trattamento alternativa. Negli ultimi anni, i cocktail di fagi litici sono stati utilizzati per via endovenosa con un certo successo nelle infezioni settiche batteriche gravi e resistenti agli antibiotici nell'uomo 3,4. La terapia fagica orale è stata anche proposta come potenziale alternativa agli antibiotici per il trattamento delle infezioni intestinali e delle infiammazioni. Inoltre, i fagi sono stati implicati nel successo dei trapianti di filtrato fecale (FFT), che sono preparati del microbiota fecale che sono stati filtrati per rimuovere i batteri, nel trattamento dell'infezione ricorrente da Clostridioides difficile (rCDI)5,6, dei disturbi infiammatori intestinali (IBD)7,8 e dell'enterocolite necrotizzante nei suini prematuri9. Alla luce di questi risultati, è importante considerare le interazioni sia tra i fagi e il microbiota intestinale, sia tra i fagi e l'ospite mammifero, poiché l'aggiunta di nuovi fagi in una comunità preesistente può avere effetti indiretti sulla comunità nel suo complesso, e non solo sui suoi batteri bersaglio 2,10.

Lo studio delle interazioni dei fagi con i loro batteri bersaglio in vitro si è dimostrato utile per comprendere i meccanismi e gli impatti delle interazioni tra fagi e batteri nell'intestino. In questo contesto, è stato dimostrato che i fagi T4 specifici per Escherichia coli dell'ordine Caudovirales richiedono domini simili alle immunoglobuline (Ig) situati all'interno di proteine del capside esterno (Hoc) altamente antigeniche sulla superficie del virione per aderire al muco intestinale11. Inoltre, i saggi transwell hanno dimostrato che i fagi T4 sono in grado di interagire con colture cellulari epiteliali e di traslocare attraverso gli strati cellulari mediante macropinocitosi12,13. Questi risultati supportano l'ipotesi che i fagi possano interagire con il loro ospite metazoico, anche se non sono in grado di infettare le cellule eucariotiche. Questi modelli, sebbene utili, mancano dell'intera gamma di interazioni complesse che si verificano in un ecosistema intestinale che sono necessarie per un'esplorazione completa dell'interazione tripartita tra fagi, batteri e l'ospite metazoo.

I modelli murini sono uno strumento importante per lo studio dei fagi all'interno di ambienti complessi. Un'applicazione auspicabile della somministrazione di fagi è come strategia alternativa per il trattamento di infezioni resistenti agli antimicrobici o patobionti associati a malattie infiammatorie croniche, tra cui l'IBD. Tuttavia, la letteratura emergente suggerisce che il comportamento dei fagi in vitro non rappresenta pienamente le funzioni in vivo. Buttimer et al.14 hanno dimostrato che un cocktail di fagi era in grado di esaurire i batteri bersaglio in un consorzio di microbiota umano semplificato in vitro, ma non poteva essere replicato in vivo in topi gnotobiotici colonizzati con lo stesso consorzio batterio-fago. Inoltre, in un microbioma murino convenzionale, il fago T7 ha portato a una deplezione selettiva dei suoi batteri intestinali bersaglio, sebbene sia stato osservato un graduale recupero nel tempo, indicativo di resistenza evoluta15. Altri studi hanno dimostrato la coesistenza di fagi somministrati per via orale e dei loro ceppi batterici bersaglio in vivo 2,16. Infatti, al di là della coesistenza fagi/batteri, la somministrazione di fagi ha portato a cambiamenti diffusi nella composizione e nella funzione complessiva della comunità del microbiota 2,16. Ciò è rilevante in contesti patologici poiché diversi studi hanno trovato associazioni tra l'aumento dell'abbondanza relativa di Caudovirales e IBD 7,8,17 che erano indipendenti dai cambiamenti nell'abbondanza batterica7. Non è noto se questo sia un fattore trainante o una conseguenza della patogenesi della malattia.

L'obiettivo storico dell'indagine sui fagi è stato la relazione tra un fago e il suo batterio bersaglio. Tuttavia, è anche importante considerare le potenziali interazioni tra il fago e la mucosa, l'epitelio e il sistema immunitario dell'ospite metazoico. Tutte queste interazioni svolgono un ruolo importante nella risposta globale all'infezione fagica intestinale. Per dimostrarlo, i fagi sono stati studiati utilizzando topi privi di germi (GF) per chiarire il loro impatto sul sistema immunitario senza interferenze da parte del microbiota8. In questo sistema, gli acidi nucleici fagici sono stati rilevati dai recettori Toll-like (TLR) situati all'interno degli endosomi delle cellule immunitarie fagocitiche (macrofagi e cellule dendritiche). Ciò ha attivato la segnalazione a valle e stimolato la produzione dipendente dalle cellule T di interferone (IFN)-γ8 o IFNdi tipo I 18. Inoltre, Fluckiger et al.19 hanno implicato le cellule T CD8+ della memoria nel riconoscimento degli antigeni codificati dai fagi (profagi), che hanno portato alla cross-reattività delle cellule T con gli antigeni tumorali, con conseguente riduzione del carico tumorale. Infine, la produzione di anticorpi fagico-specifici è stata documentata in studi sui topi in cui i fagi sono stati somministrati a modelli animali in modo continuo attraverso l'acqua potabile 8,20 o mediante somministrazione orale ripetuta per diversi mesi20, dimostrando la capacità delle proteine fagiche di promuovere le risposte immunitarie umorali. Sebbene queste modalità di inoculazione dei fagi consentano un innesco ottimale e continuo del sistema immunitario, potrebbero non rappresentare le interazioni naturali tra i fagi e l'ambiente intestinale, né la cinetica della terapia fagica applicata per via orale. Finora, un numero limitato di studi ha esaminato le interazioni del fago con una singola specie batterica in modelli murini monocolonizzati21. Tuttavia, i topi monocolonizzati si sono dimostrati fondamentali nel decifrare gli effetti microbo-specifici delle singole specie sul tratto gastrointestinale (GI) e sullo sviluppo immunitario 22,23,24 e possono ancora rivelarsi utili nella comprensione delle interazioni tripartite tra i fagi, i loro batteri bersaglio e l'ospite metazoico.

Entusiasmantemente, c'è ancora molto da imparare sulle interazioni tra fagi intestinali e batteri commensali intestinali, nonché sulle interazioni che si verificano tra l'ospite metazoico e i fagi che risiedono al suo interno. Questo protocollo fornisce una serie di procedure per studiare il fago T4 isolato e la sua controparte batterica, E. coli (K-12, BW25113), utilizzando un modello murino gnotobiotico. Queste procedure standardizzate forniscono anche una base per l'ottimizzazione di altre diadi fagi/batteri adattando i parametri di crescita alle coppie di interesse. I metodi qui descritti delineano: (1) Preparazione di lisati fagici e veicoli T4 per il gavage orale di topi; (2) Somministrazione orale di fago T4 a topi gnotobiotici monocolonizzati da E. coli ; (3) Monitoraggio dei livelli di fagi T4 nelle feci e nei tessuti di topo nel tempo.

Per i risultati rappresentativi qui presentati, i lisati fagici T4 purificati sono stati propagati da stock di banche fagiche mantenute dal Rohwer Lab. Il metodo Phage-on-Tap per la propagazione del fago T4 è stato adattato25, come indicato in questo protocollo. Il metodo produce titoli fagici ad alto titolo, a basso contenuto di endotossine entro tre giorni. Utilizzando questo approccio, sono stati raccolti di routine 10 ml di ≥10 10 unità formanti placca (pfu)/mL di fago T4 con < 0,5 unità di endotossine (EU)/mL. I livelli raccomandati di endotossine per la somministrazione orale o endovenosa nei topi sono rispettivamente ≤ 20 EU/mL e ≤ 5 EU/kg/h (o 0,1 EU somministrati in 1 ora per un topo di 20 g), il che lo rende un metodo adatto di preparazione dei fagi per l'inoculazione in vivo . Tutti gli stock fagici sono stati conservati a 4 °C in tampone fagico salino di magnesio (SM) (ricetta fornita al punto 1.1.5.1). E. coli è stato coltivato in terreni LB. Per varie coppie fagi-batteri, diversi terreni di coltura e condizioni di crescita possono essere adattati da questo protocollo. I fagi possono anche essere reperiti dall'ambiente, come le acque reflue, l'acqua marina, il suolo e il contenuto intestinale e possono essere isolati e purificati secondo Sambrook e Russell26 prima della preparazione utilizzando le condizioni di crescita e propagazione appropriate per ciascuna coppia fago-ospite di interesse25. In alternativa, i fagi possono essere ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali) o da banche di fagi.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida stabilite dai protocolli approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'UBC e dal Comitato per la sicurezza biologica (A23-0113, B19-0038). I topi sono stati ospitati presso l'Università della British Columbia in condizioni prive di agenti patogeni presso il Center for Disease Modelling. I topi C57BL/6 sono stati allevati all'interno della struttura in un isolatore sterile a film flessibile, dotato di dieta sterile per topi, acqua, lettiera e materiale per il nido. I topi sono stati mantenuti su un ciclo giorno/notte di 12 ore. I topi sperimentali, sia maschi che femmine, sono stati abbinati all'età di ciascun esperimento, di età compresa tra 6 e 12 settimane e del peso di 15-30 g per tutti gli esperimenti.

1. Preparazione di lisati fagici e veicoli per il gavage orale nei topi

  1. Purificazione dei fagi e generazione di scorte
    NOTA: In questo studio, i fagi T4 vengono coltivati e titolati placcando su un prato di batteri utilizzando il metodo dello strato singolo di agar, descritto di seguito. Il metodo del doppio strato di agar è stato descritto in precedenza25,27e può anche essere usato con un'efficacia simile. Per questo protocollo è stato scelto il metodo a strato singolo di agar in quanto fornisce una migliore visibilità della placca28.
    1. Coltiva E. coli in 5 mL di terreno sterile LB in provette sterili di polistirene o vetro (con tappi). Incubare le provette a 37 °C con agitazione a 200 giri/min per tutta la notte, fino al raggiungimento della fase stazionaria.
    2. Preparare l'agar morbido in un flacone di vetro sterilizzando in autoclave LB con agar allo 0,5% e raffreddando a 50 °C o meno (pur rimanendo un liquido) prima dell'integrazione. Preparare una quantità sufficiente di agar morbido per 15 ml per piastra.
    3. Integrare l'agar molle con MgSO4 e CaCl2 fino a una concentrazione finale di 1 mM per ciascuno. Aggiungere 100 μL di coltura notturna di E. coli per ogni 3 mL di agar molle. Mescolare delicatamente utilizzando una barra magnetica per omogeneizzare gli integratori e la coltura nell'agar morbido.
      NOTA: La coerenza nel volume e nella densità di E. coli che viene aggiunto alla preparazione di agar morbido è fondamentale (descritta nella sezione dei risultati rappresentativi).
    4. Aggiungere 15 ml di agar molle + E. coli per piastra di Petri (15 cm di diametro) utilizzando una pipetta sierologica. Lasciare che le piastre si solidifichino a temperatura ambiente per l'uso in giornata.
      NOTA: I piatti si solidificheranno in circa 20 minuti con i coperchi aperti. L'agar rimarrà morbido ma non si sposterà quando le piastre vengono capovolte.
    5. Preparare 8-10 diluizioni seriali del fago T4 sorgente in fattori di 10 diluendo in tampone SM. Versare 5 μL di ciascuna diluizione su piastre. Lasciare asciugare le macchie, capovolgere e incubare le piastre a 37 °C per una notte.
      1. Per preparare il tampone fagico di magnesio salino (SM), in 1 L di H2O deionizzato, sciogliere 100 mM di NaCl, 8 mM di MgSO4·7H2O e 50 mM di Tris-HCl (pH 7,4). Autoclavare e conservare a temperatura ambiente.
        NOTA: Il giorno successivo, E. coli dovrebbe essere cresciuto in un prato in tutto il morbido agar LB. Le placche, o le aree di crescita ripulite visibili nel prato di E. coli , appariranno dove si è verificata l'uccisione dei fagi degli ospiti infetti di E. coli . Ogni placca rappresenta un'unità formatrice di placche (pfu).
    6. Prelevare una singola placca dalla piastra di agar morbida spingendo un puntale di pipetta sterile al centro della placca, creando un tappo di agar all'estremità del puntale. Risospendere il tappo della placca in 1 mL di tampone SM in una provetta per microcentrifuga da 1,7 mL. Agitare il tubo alla massima velocità per 1 minuto per mescolare.
    7. Centrifugare la provetta a 4000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per rimuovere eventuali detriti dal lisato. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga.
    8. Per propagare il fago isolato, ripetere i passaggi 1.1.1-1.1.3. Aggiungere 100 μL del fago isolato a un'aliquota di 15 mL di agar molle contenente E. coli in una provetta conica. Capovolgere il tubo tre volte per mescolare e versare l'agar in una capsula di Petri.
    9. Lasciare asciugare le piastre prima di capovolgerle e incubarle per una notte a 37 °C. Preparare una piastra di controllo del prato senza fagi per confermare la vitalità di E. coli .
      NOTA: Dopo l'incubazione notturna, la piastra di controllo dovrebbe avere un prato di E.coli mentre la piastra contenente fagi dovrebbe essere completamente lisata.
    10. Per estrarre il fago dalla piastra, aggiungere 5 mL di tampone SM sulla superficie della piastra eliminata dai fagi e agitare a 70 giri/min su un bilanciere per 15 minuti a temperatura ambiente.
    11. Raccogliere il tampone dalla piastra in una provetta da centrifuga conica da 50 mL e centrifugare a 4000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettare eventuali detriti dalla piastra di agar.
    12. Raccogliere il lisato di fago T4 in una nuova provetta e conservare a 4 °C fino alla titolazione e alla propagazione.
      NOTA: I fagi T4 sono stabili per oltre 10 anni25; Tuttavia, la stabilità dipenderà dal tipo di fago e dalle condizioni di conservazione. Anche il titolo fagico varia con il tempo di conservazione. I fagi sono sensibili al congelamento. Pertanto, la crioconservazione è consigliata in azoto liquido ed evitare cicli di gelo-disgelo in quanto ciò potrebbe danneggiare i fagi, riducendo il titolo fagico25.
    13. Titolare il lisato di fago T4 per determinare la concentrazione in pfu/mL, come descritto in precedenza 25,29,30. Uno stock di fagi T4 ad alto titolo conterrà 108 pfu/mL o più.
  2. Preparazione di lisati fagici sperimentali
    1. Coltura di E. coli in 5 mL di terreno LB in provette sterili di polistirene o vetro (con tappi). Incubare le provette per una notte a 37 °C con agitazione a 200 giri/min, fino al raggiungimento della fase stazionaria.
    2. Subcoltura la coltura notturna di E. coli 1:50 in terreni da 100 mL LB in un pallone conico di vetro. Incubare a 37 °C con agitazione a 200 giri/min fino a quando i batteri non hanno raggiunto la fase esponenziale medio-precoce (circa 1,5 ore).
      NOTA: È possibile eseguire una curva di crescita iniziale per determinare la densità ottica nell'intervallo di 600 nm (OD600) in cui la coltura batterica è in fase esponenziale. La coltura in un tubo conico di vetro è suggerita poiché prove recenti hanno scoperto che i fagi sono in grado di aderire a materie plastiche come il polipropilene31.
    3. Aggiungere 100 μL del ceppo fagico T4 ad alto titolo della fase 1.1 nella sottocoltura di E. coli e incubare a 37 °C agitando per 3 ore o fino a quando il nuovo lisato non è più torbido. Raccogliere il lisato fagico T4 in provette coniche da 50 mL e procedere direttamente alle fasi di pulizia o, se necessario, conservare a 4 °C fino al giorno successivo.
      NOTA: Una dimensione maggiore del phage burst (che indica un numero medio più elevato di virioni rilasciati per ciclo di replicazione) richiede un periodo di incubazione più lungo per la sottocoltura batterica nella fase 1.2.2. Ciò fornisce una maggiore densità batterica prima del picco con le scorte di fagi.
    4. Centrifugare i lisati a 4000 x g per 20 minuti a temperatura ambiente per pellettare eventuali batteri e detriti cellulari rimanenti. Sterilizzare con filtro il surnatante risultante utilizzando un filtro in nylon da 0,22 μm e trasferire il filtrato in nuove provette da centrifuga coniche da 50 mL.
    5. Aggiungere 0,1 volumi di cloroformio a ciascun volume di lisato fagico T4 filtrato per uccidere eventuali batteri rimanenti e prevenire la crescita batterica. Vorticare brevemente per mescolare e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
      NOTA: I fagi con involucro lipidico sono sensibili al cloroformio, che può ridurre il titolo fagico25. Salta questo passaggio se necessario.
      ATTENZIONE: Il cloroformio è un solvente organico tossico pericoloso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la pelle. Utilizzare una cappa aspirante e dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati quando si lavora con il cloroformio. Utilizzare il vetro invece delle pipette sierologiche in polistirolo quando si lavora con il cloroformio, poiché non è compatibile con la maggior parte delle materie plastiche. Il cloroformio può essere posto in provette da centrifuga coniche in polipropilene per i passaggi 1.2.5-1.2.6, ma non deve essere conservato a lungo termine in provette di plastica.
    6. Centrifugare il lisato a 4000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per separare il cloroformio dal lisato. Utilizzare una pipetta sierologica per trasferire con cautela lo strato superiore di lisato in una nuova provetta conica da 50 mL senza disturbare lo strato di cloroformio sottostante. Gettare i rifiuti di cloroformio nell'apposito contenitore per rifiuti liquidi pericolosi. Conservare i lisati a 4 °C fino al giorno successivo alla concentrazione e allo scambio del tampone.
    7. Concentrare i lisati fagici in un dispositivo filtrante centrifugo da 100 kDa (vedere Tabella dei materiali) aggiungendo 13 mL di lisato fagico al serbatoio superiore del dispositivo e centrifugando a 4000 x g per 5 minuti, o fino a quando la maggior parte del lisato non è passata attraverso il filtro nel serbatoio inferiore.
      NOTA: Cercare di avere circa 2 ml di lisato alla fine del tempo di centrifuga. Man mano che la concentrazione di fagi aumenta nel filtro con l'aggiunta di lisato, è probabile che i tempi di rotazione aumentino. I dispositivi di filtraggio centrifugo sono dotati di un fermo fisico per evitare che si asciughino32. Non lasciare che la membrana del filtro si asciughi se si prevede un uso continuato (ad esempio, rimuovendo tutto il liquido dal serbatoio superiore). I tempi di centrifuga possono variare in base al tipo di fago e al titolo.
    8. Utilizzando una pipetta P200 o P1000, pipettare delicatamente i restanti ~2 mL di lisato su e giù all'interno del serbatoio superiore per sbloccare la membrana del filtro dopo ogni centrifuga. Scartare il filtrato dal serbatoio inferiore in un contenitore di scarto, lasciando il fago concentrato nel serbatoio superiore.
    9. Ripetere i passaggi 1.2.7-1.2.8 fino a quando l'intero volume di lisato fagico non è stato fatto passare attraverso il dispositivo filtrante, con ~2 mL di fago concentrato trattenuto nel serbatoio superiore dopo ogni centrifuga.
    10. Sbloccare la membrana del filtro dopo l'ultima centrifuga pipettando il lisato rimanente (~2 mL) nel serbatoio superiore su e giù. Lavare il fago (scambio tampone) aggiungendo 12 mL di tampone SM al serbatoio superiore e centrifugare a 4000 x g per 10 minuti o fino a quando la maggior parte del tampone non è passata attraverso il filtro.
    11. Gettare il filtrato e ripetere la fase di lavaggio (fase 1.2.10). Risospendere i restanti 2 mL di lisato nel tampone SM a un volume finale di 10 mL (o meno), per la conservazione a lungo termine. Trasferire il lisato in una provetta da centrifuga conica da 50 mL e conservare a 4 °C fino alla rimozione dell'endotossina.
      NOTA: È facoltativo titolare il fago in questa fase per garantire che il lisato fagico sia stato concentrato (> 108 ufu/mL) e per determinare la perdita di fagi durante il processo di rimozione dell'endotossina.
    12. Rimuovere le endotossine contaminanti dal lisato fagico T4 aggiungendo 0,4 volumi di 1-ottanolo (vedere Tabella dei materiali) al volume totale del lisato
      NOTA: Le endotossine vengono rimosse in quanto altamente immunostimolatorie, e quindi la loro presenza può portare all'induzione di una risposta immunitaria innata fago-indipendente25.
      ATTENZIONE: L'1-ottanolo è un composto aromatico, organico, infiammabile con un forte odore ed è irritante per gli occhi. Indossare DPI appropriati quando si lavora con l'1-ottanolo. Eseguire tutti i lavori in una cappa aspirante per evitare l'inalazione di vapore. Utilizzare una pellicola sigillante per evitare la fuoriuscita dei tubi quando si lavora all'esterno della cappa aspirante.
    13. Sigillare il coperchio della provetta da centrifuga conica con pellicola sigillante per evitare perdite. Agitare a 120 giri/min su piattaforma o agitatore a dondolo a temperatura ambiente per 1 h, seguito da incubazione a 4 °C per 1,5 h, senza agitare.
    14. Centrifugare a 4000 x g per 10 minuti per separare il lisato eliminato dalle endotossine dall'1-ottanolo. Lo strato di 1-ottanolo galleggerà sopra il lisato. Utilizzare una pipetta P1000 per rimuovere con cura la maggior quantità possibile di 1-ottanolo e gettarla nell'apposito contenitore per rifiuti liquidi pericolosi/infiammabili.
    15. Utilizzare un ago da 18 G e una siringa da 10 mL per raccogliere il lisato fagico sotto il restante strato di 1-ottanolo, facendo attenzione a non raccogliere lo strato di 1-ottanolo. Conservare il lisato a 4 °C fino a velocità di aspirazione.
    16. Trasferire aliquote da 1 mL di lisato fagico T4 in provette sterili da microcentrifuga da 1,5 mL. Velocità di aspirazione con coperchi aperti a 4000 x g a temperatura ambiente per far evaporare l'1-ottanolo residuo dal lisato. Accelerare il vuoto per 3 ore o fino a quando il volume del lisato fagico non è stato ridotto del 30%25. Conservare a 4 °C fino alla titolazione.
    17. Titolare il lisato fagico per determinare la concentrazione in pfu/mL. Diluire il lisato fagico T4 risultante nel tampone SM alla concentrazione desiderata e rititolare per confermare.
    18. Quantificare le endotossine presenti nel lisato fagico T4 utilizzando un kit di quantificazione delle endotossine cromogeniche secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali). Confrontare i livelli di endotossine nel lisato fagico finale con un campione di pre-rimozione delle endotossine, controlli del veicolo, tampone e acqua potabile di topo.
      NOTA: Il kit di quantificazione delle endotossine cromogeniche è inattivato dall'1-ottanolo25. Eseguire passaggi di vuoto di velocità per rimuovere l'1-ottanolo (passaggio 1.2.16) prima di quantificare le endotossine. Il contenuto di endotossine per l'acqua distillata è stimato a 20 EU/mL25; Tuttavia, il contenuto di endotossine nell'acqua potabile dei topi può variare da una struttura all'altra. Se i livelli di endotossine nel lisato fagico superano la quantità presente nell'acqua potabile, considerare la possibilità di ripetere i passaggi di rimozione dell'endotossina (1.2.12-1.2.16).
    19. Conservare i lisati fagici T4 concentrati e eliminati dalle endotossine in tampone SM a 4 °C.
  3. Preparazione di lisato batterico privo di fagi per i comandi dei veicoli
    NOTA: Un lisato batterico privo di fagi può essere preparato come veicolo per controllare eventuali effetti dovuti a contaminanti batterici (ad esempio, endotossine) generati nella produzione di lisato fagico nella fase 1.2, che potrebbero influire sui risultati sperimentali una volta inoculati nei topi.
    1. Da una coltura notturna di E. coli, subcoltura di E. coli 1:50 in 100 mL di terreno LB. Senza aggiunta di fagi, continuare a coltivare i batteri agitando a 37 °C per 3 ore o facendo corrispondere il tempo di incubazione per il lisato fagico prodotto nella fase 1.2.
    2. Trasferire la coltura di E. coli in provette coniche da 50 mL e lisare le cellule utilizzando una sonda sonicatrice (vedere la tabella dei materiali) su ghiaccio a 30 kHz per impulsi di 30 s (3x) per lisare manualmente le cellule batteriche.
    3. Seguire il resto del protocollo come al passaggio 1.2, a partire dal passaggio 1.2.4, comprese tutte le fasi di pulizia, lavaggio e rimozione delle endotossine.
      NOTA: Durante la concentrazione utilizzando il dispositivo di filtraggio centrifugo, il lisato del veicolo scorrerà attraverso il filtro più rapidamente del lisato fagico, a causa dell'assenza di fagi. Pertanto, ridurre i tempi di centrifugazione da 5 minuti a 2-5 minuti per garantire che la membrana dell'ultrafiltro non si asciughi durante la centrifugazione prolungata.
    4. Titolare il lisato del veicolo per confermare che non contiene fagi.
    5. Utilizzare un kit di quantificazione delle endotossine cromogeniche secondo le istruzioni del produttore per misurare i livelli di endotossine nel lisato del veicolo. Diluire il lisato veicolo nel tampone SM in modo che corrisponda ai livelli di endotossine nel lisato fagico.
  4. Controlli sperimentali alternativi: preparazione di lisato fagico termoinattivato
    NOTA: Un'alternativa al lisato batterico privo di fagi è un lisato fagico inattivato dal calore. L'inattivazione del calore dissocia i virioni fagici, mentre le endotossine residue come i lipopolisaccaridi (LPS) sono termostabili 8,33. Questo metodo è stato utilizzato da Gogokhia et al.8 per determinare se i virioni fagici intatti e vitali fossero necessari per l'attivazione immunitaria. I ricercatori sono incoraggiati a testare entrambi i metodi (senza fagi vs. inattivati con calore) e determinare quale controllo è più appropriato per le loro esigenze sperimentali. Qualunque sia la scelta, è importante riconoscere che è improbabile che un controllo tampone sia appropriato a causa della significativa manipolazione necessaria per concentrare e ripulire uno stock di fagi.
    1. Trasferire il volume richiesto di lisato fagico T4 pulito, purificato e diluito dalla fase 1.2 (100 μL per topo) a provette sterili per microcentrifuga dotate di chiusure del coperchio.
    2. Riscaldare i lisati su un blocco termico a 95 °C per 15 min16.
    3. OPZIONALE: Se è necessaria la rimozione degli acidi nucleici fagi/batterici, eseguire il trattamento con DNasi I e RNasi A secondo Jakočiūnė e Moodley34. Brevemente:
      1. Aggiungere 50 μL di tampone DNasi I 10x, 1 μL DNasi I (1 U/μL) e 1 μL RNasi A (10 mg/mL) (vedere la tabella dei materiali) a 450 μL di lisato fagico inattivato dal calore.
      2. Incubare i lisati a 37 °C per 1,5 h in blocco termico, senza agitare.
      3. Inattivare la DNasi I e la RNasi A aggiungendo 20 μL 0,5 M di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)34.
    4. Tenere i lisati a temperatura ambiente per 10 minuti per raffreddare e combinare i lisati se si utilizzano più provette. Conservare a 4 °C fino alla titolazione.
    5. Eseguire un titolo fagico per confermare che non è presente alcun fago T4 vitale nel lisato. Conservare i lisati inattivati dal calore a 4 °C.
    6. Utilizzare un kit di quantificazione delle endotossine cromogeniche secondo le istruzioni del produttore per misurare i livelli di endotossine nel lisato inattivato dal calore. Diluire il lisato inattivato dal calore in tampone SM in base ai livelli di endotossine presenti nel lisato fagico abbinato.

2. Somministrazione e monitoraggio del fago T4 in topi monocolonizzati da E. coli

  1. Monocolonizzazione di topi con E. coli
    1. Preparare E. coli per la somministrazione nei topi GF8 coltivando E. coli prelevati da una singola colonia in terreni LB durante la notte.
    2. In condizioni rigorose e sterili35, somministrare 200 μL di coltura di E. coli a topi GF alloggiati in isolatori vinilici sterili o gabbie ermetiche di bioesclusione mediante lavaggio orale. Se si utilizzano batteri aerotolleranti, i topi possono anche essere colonizzati mediante l'applicazione di 200 μL di coltura batterica sul dorso di ciascun topo.
      NOTA: La dose di inoculazione dipenderà dal ceppo, poiché batteri diversi dimostrano una diversa capacità di sopravvivenza a pH36,37. Zucoloto et al.35 raccomandano l'inoculo con 1 x 108 cfu per animale. I risultati rappresentativi mostrati qui sono stati generati da topi inoculati con una coltura notturna (la cfu non è stata determinata). Possono essere eseguiti esperimenti pilota per determinare una dose che si traduce in una colonizzazione affidabile del ceppo murino di interesse. Il volume di batteri da somministrare per via orale può essere influenzato dall'età e dal peso dei topi. Consultare il protocollo etico individuale di laboratorio o istituzionale sugli animali per le dosi massime consentite. Il volume qui suggerito si basa su una tolleranza di gavage del 10% del peso corporeo del topo (ad esempio, 200 μL al massimo per un topo di 20 g). Alcune specie batteriche non tollerano l'acidità dello stomaco e non riescono a colonizzare l'intestino. Prendere in considerazione prima il gavaging con 100 μL di 1 M NaHCO3 per neutralizzare gli acidi dello stomaco2. Se si utilizza un anaerobio rigoroso per colonizzare, il microbo dovrà essere coltivato in condizioni anaerobiche e trasferito alla struttura per animali gnotobiotici in contenitori ermetici preparati individualmente (1 per ogni topo). Eseguire rapidamente ogni sonda gastrica una volta aperto il contenitore per limitare la perdita di vitalità microbica dovuta all'esposizione all'ossigeno.
    3. Monitorare i topi per verificare la presenza di effetti avversi sulla salute.
      NOTA: In caso di effetti negativi sulla salute, fare riferimento agli standard stabiliti dalla struttura di cura degli animali pertinente. I possibili effetti avversi sulla salute includono, ma non sono limitati a: (1) Aspirazione del liquido gastrico: i sintomi includono l'espulsione di bolle attraverso il naso, respirazione/respiro a bocca aperta. (2) Perforazione dell'esofago: i sintomi includono salute rapidamente cagionta, ingobbimento, letargia, che porta alla morte dell'animale entro 24 ore. (3) Infiammazione dell'esofago dovuta a gavage ripetute: i sintomi includono difficoltà a inserire l'ago dell'anagrafe. (4) Diarrea dovuta ad alterazioni del microbioma.
    4. Confermare la colonizzazione batterica nei pellet fecali mediante coltura almeno una volta alla settimana e/o mediante sequenziamento dell'rRNA 16S35.
      NOTA: Se si colonizzano gli allevatori all'interno di un isolatore gnotobiotico per la produzione di topi sperimentali, pianificare con almeno 9 settimane di anticipo la generazione di topi sperimentali di prima generazione di prole (F1) di 6 settimane. In alternativa, i topi adulti GF possono essere monocolonizzati. In questo approccio, si raccomanda di attendere 7 settimane dopo la colonizzazione prima dell'inoculazione dei fagi, poiché questo è il tempo necessario affinché la mucosa intestinale si stabilizzi dopo l'introduzione di un microbiota complesso nei topi GF38.
  2. Inoculazione orale del fago T4 in topi monocolonizzati da E. coli
    1. Diluire i lisati fagici T4 e i controlli del veicolo a una concentrazione predeterminata nel tampone SM. Secondo Hsu et al.2, diluire i lisati fagici per consentire la somministrazione di 2 x 106 pfu per topo2.
      NOTA: È possibile utilizzare una concentrazione più alta o più bassa di fago a seconda della stabilità del fago in vivo. Dosi di 2 x 102, 2 x 104 e 2 x 106 pfu di fago T4 per topo hanno portato a una colonizzazione stabile e a lungo termine nell'intestino che non sembrava essere dose-dipendente (mostrato nella sezione dei risultati rappresentativi). La cinetica fago-batteri dovrebbe quindi essere sperimentata in vivo prima di esperimenti su larga scala.
    2. In condizioni sterili e gnotobiotiche, manipolare ogni topo con 100 μL di NaHCO3 1 M sterilizzato in autoclave per neutralizzare gli acidi dello stomaco. Attendere 10 minuti, quindi eseguire il sonda gastrica con 100 μL di lisato fagico T4 o il controllo del veicolo.
    3. Monitorare i topi per verificare la presenza di effetti avversi sulla salute.

3. Monitoraggio dei livelli di fagi T4 in vivo

NOTA: Una volta che i topi sono stati inoculati con i fagi, la concentrazione sia dei fagi che dei batteri bersaglio può essere misurata in campioni fecali o tissutali. Questo fornisce informazioni sulla cinetica dell'infezione fagica e sulle dinamiche di colonizzazione di entrambi gli organismi.

  1. Placcatura a punti del fago T4 per determinare la concentrazione nei pellet fecali
    1. Raccogliere i pellet fecali da ciascun topo in provette sterili pre-pesate per microcentrifuga per misurare i livelli di fagi T4 ed E. coli . Conservare i tubi su ghiaccio fino alla placcatura.
      NOTA: Posizionare i campioni sul ghiaccio nel periodo intermedio tra la raccolta e la placcatura per rallentare la crescita dei batteri aerotolleranti. Per diverse ore, potrebbe esserci ancora una crescita di batteri aerobi o una certa morte di batteri anaerobici a causa dell'esposizione all'ossigeno che potrebbe portare a conteggi batterici distorti. Pertanto, la placcatura di batteri e fagi deve essere eseguita il prima possibile dopo la raccolta del campione. I batteri anaerobici obbligati non tollerano l'esposizione all'ossigeno. Per conservare il campione, raccogliere i campioni in provette sigillate e trasferire le provette in una camera anaerobica il prima possibile dopo la raccolta. Se non viene rilevata alcuna crescita nei campioni fecali, prendere in considerazione alternative come la qPCR dell'rRNA 16S per la quantificazione batterica.
    2. Registrare i pesi finali di ciascuna provetta e calcolare il peso del campione sottraendo il peso iniziale della provetta. Questo verrà utilizzato per normalizzare la concentrazione di fagi T4 ed E. coli al peso del campione (pfu/g o cfu/g, rispettivamente).
    3. Aggiungere 1 mL di tampone SM sterile a ciascuna provetta e vorticare accuratamente alla massima velocità (>1 min) per omogeneizzare i pellet fecali. Se il campione è inferiore a 15 mg, può essere aggiunto un volume minore di tampone SM. Registrare il volume di tampone SM aggiunto a ciascun campione per i calcoli di ufc/g o pfu/g di campione.
    4. Preparare una serie di 8 (o più a seconda della concentrazione di fagi prevista) diluizioni seriali di 20 μL di ciascun campione in tampone SM da 180 μL, in fattori di 10. Vorticare brevemente ogni campione omogeneizzato per mescolarlo prima di aggiungerlo alla prima provetta/pozzetto. Pipettare per miscelare tra un'aggiunta e l'altra e sostituire i puntali tra una diluizione e l'altra per evitare di gonfiare la conta dei fagi o dei batteri tramite il carryover del campione.
      NOTA: Se le fibre e i detriti presenti nel campione ostacolano il pipettaggio, aggiungere ulteriore tampone al liquame fecale per diluire ulteriormente il campione.
    5. Posizionare 5 μL di ciascuna diluizione su piastre di agar morbido LB contenenti E. coli (per i saggi della placca fagica) o piastre di agar LB (agar all'1,5%, per i saggi di colonie batteriche) per determinare la concentrazione di fagi T4 ed E. coli in ciascun campione. Per una maggiore precisione, individuare ogni campione in triplice copia.
      NOTA: Se si preparano diluizioni seriali in una piastra a 96 pozzetti, è possibile utilizzare una pipetta multicanale P20 a 8 canali per pipettare ciascuna colonna di campione diluito in serie sulle piastre. Cambiare i puntali tra una diluizione e l'altra, anche se si passa dal più diluito al più concentrato, poiché il fago può aderire alle pareti del puntale della pipetta e alterare la quantità di fago aggiunto a ciascun nuovo pozzetto31.
    6. Lasciare asciugare ogni punto prima di capovolgere la piastra e metterla nell'incubatrice. Incubare per una notte a 37 °C.
    7. Per ogni campione, selezionare la diluizione alla quale ci sono 3-30 placche numerabili per punto. Contare e annotare il numero di placche presenti nel punto e la diluizione utilizzata.
    8. Calcolare pfu/g di campione dividendo il numero di placche per il volume placcato in ciascun punto per ottenere pfu/μL. Moltiplicare questo valore per il fattore di diluizione e per il volume di tampone SM aggiunto a ciascun campione per ottenere pfu/campione. Infine, dividere per il peso del campione per ottenere30 unità di ufc/g.
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
  2. Campionamento tissutale agli endpoint sperimentali
    1. In ogni momento selezionato, sopprimere i topi secondo il protocollo di etica animale istituzionale approvato e raccogliere il contenuto cecale, il contenuto dell'intestino tenue e crasso e tutti i tessuti di interesse in provette per microcentrifuga sterili e prepesate da 2 ml.
    2. Registrare i pesi finali di ciascuna provetta per calcolare il peso del campione. Conservare i fazzoletti e il contenuto cieco sul ghiaccio fino alla placcatura in giornata.
    3. Aggiungere un tampone SM sterile a ciascuna provetta e registrare i volumi aggiunti.
    4. Per il contenuto cecale e intestinale, prelevare accuratamente i campioni di vortice (>1 min) come indicato al punto 3.1.3.
    5. Per i campioni di tessuto, aggiungere una perlina di metallo sterile a ciascuna provetta. Omogeneizzare i tessuti utilizzando un lizzatore tissutale (vedere Tabella dei materiali) a 20 Hz per 5 minuti o fino a quando i tessuti non sono dissociati e la sospensione è omogenea.
      NOTA: Se i campioni non si omogeneizzano bene, prendere in considerazione l'aumento del volume del tampone SM aggiunto, l'aumento del tempo di omogeneizzazione o l'aumento della frequenza di omogeneizzazione a 30 Hz. Un omogeneizzatore tissutale può anche essere utilizzato per dissociare i tessuti, consentendo il recupero di batteri e fagi39,40. Gli omogeneizzatori funzionano a frequenze più elevate rispetto ai lisatori tissutali, mantenendo l'integrità dei batteri.
    6. Preparare le diluizioni seriali di ciascun campione in fattori pari a 10 ed eseguire la placcatura a punti per determinare le concentrazioni di E. coli e fagi T4 in ciascun campione, come descritto nei passaggi 3.1.4-3.1.841.

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Risultati

Per studiare le interazioni tra la diade fago T4/E. coli nell'intestino murino, sono stati preparati, puliti e purificati i lisati del fago T4 e del veicolo (Figura 1A). I lisati fagici T4 sono stati titolati mediante test a placca e diluiti a 2 x 107 pfu/mL (2 x 106 pfu/topo) in tampone SM. I lisati del veicolo sono stati anche titolati per confermare l'assenza di fagi vitali e diluiti nello stesso volume di tampone SM del lisato fagico T4. I livelli di endoto...

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Discussione

Lo studio dei fagi nel microbioma presenta una sfida significativa rispetto alle loro controparti batteriche. In particolare, i fagi non contengono un marcatore filogenetico conservato comune a tutti i fagi affini alle subunità ribosomiali 16S e 18S che consentono la facilità di sequenziamento e identificazione delle specie procariotiche ed eucariotiche,rispettivamente. Tuttavia, con i progressi negli approcci di sequenziamento di nuova generazione, tra cui l'aumento della lunghezza di lettura, de...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono che la terra su cui hanno eseguito questa ricerca è il territorio tradizionale, ancestrale e non ceduto della nazione xwməθkwəy̓əm (Musqueam). Il terreno su cui si trova è sempre stato un luogo di apprendimento per il popolo Musqueam, che per millenni ha tramandato la sua cultura, la sua storia e le sue tradizioni da una generazione all'altra in questo sito. Incoraggiamo gli altri a conoscere meglio le terre native in cui vivono e lavorano in https://native-land.ca. Gli autori riconoscono il sostegno del Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC) Canadian Graduate Scholarships - Master's (NP), Michael Smith Health Research BC Trainee Award (RT-2023-3174, a MH), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants Program (RGPIN-2019-04591 to C.T., RGPIN-2016-04282 to LCO), Canadian Institute for Advanced Research / Humans and the Microbiome (FL-001253 Appt 3362, a C.T.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (18239, a C.T.), Canadian Institutes for Health Research (PJT-159458 a LCO) e la Fondazione canadese per l'innovazione (34673 a LCO e 38277 a CT). Siamo grati per il supporto tecnico dell'UBC Centre for Disease Modelling e ubcFLOW, che è supportato dall'UBC GREx Biological Resilience Initiative, e ai membri dei laboratori Osborne e Tropini per le discussioni critiche e la valutazione del manoscritto. La Figura 1A e la Figura 2A sono state create utilizzando Biorender.com.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1-ottanolo (99%)ThermofisherCAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Unità filtranti sottovuoto monouso steriliMillipore Sigma
Agarosio (Basso EEO/Multiuso/Grado di Biologia Molecolare)Fisher BioReagents BP160-500
Dispositivo di filtraggio centrifugo Amicon® 100kDa Ultra-15, Ultracel-100Millipore SigmaUFC910008
BD Microtainer® Tubi, SSTBD Medical365967
Gabbie ermetiche per bioesclusione (gabbie ISO) Techiplast1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Termociclatore con modulo di reazione rapida a 96 pozzettiBioRad1851196
cloruro di calcio diidrato (cristalli bianchi in polvere)Fisher BioReagentsBP510-500
Tappi Serrature per provetta da 1,5 ml 100/confAndwin Scientific 
Cloroformio (etanolo come conservante/certificato ACS)PerlineC298-500
(4,5 mm)Crosman Corporation0767
DNeasy Blood & Kit Tessuti (50)Thermo Scientific 69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)Thermo Scientific K1081
Soluzione di sale disodico di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), per biologia molecolare, 0,5 M in H2OSigma AldrichE7889
Fisher BioReagents&commercio; Agar, polvere / fiocchi, Fisher BioReagenti&commercio;  Fisher BioreagentsBP1423-500
Fisher BioReagents™ Terreni di microbiologia: brodo LB (polvere) - Lennox Fisher BioreagentsBP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA LadderThermo Scientific SM0241
Miscela qPCR FastMix® verde, 1250 rxnsQuantaBio95072-012
Filtri HEPA per coperchi isocage, FILTRI H14 AUTOCLAVABILI PER LINEA ISO IRRADIATITechiplastUISOHEPAXTBOX-300
Solfato di magnesio eptaidratoFisher BioReagentsBP213-1
MaxQ 6000 Agitatore incubatoThermo Scientific 8354-30-0009
Terreni di microbiologia: brodo LB (polvere) - LennoxFisher BioReagentsBP1427-500
Provette per microcentrifuga con tappo a scatto di bloccaggio, 2 mlFisher14-666-315
Pellicola sigillante ParafilmBemisPM-996
Scorte di fagiCarolina Biological Supply n/a
PicoLab® Dieta del topo 20 EXTLabDiet5R58
Pierce™ Kit Quant Endotossina CromogenicaThermo Scientific 
RNasi A (17.500 U)Qiagen19101
Set di DNasi senza RNasiQiagen 79254
Bicarbonato di sodio (polvere bianca fine)Fisher ChemicalBP328-500
Cloruro di sodio (cristallino/certificato ACS)Fisher ChemicalS271
Sonicator (sonda modello CL-18; fonte di alimentazione modello FB50)Fisher scentific n/a
Isolatore sterile a film flessibile Classe Biologicamente Pulito n/a
SYBR&commercio; Disinfettante per gel DNA sicuroInvitrogenS33102
T100 Thermal Cycler BioRad1861096
Primer fagico T4, in avanti (CCACACACATAGCGCGAGTATAA)IDTn/a
Primer fagico T4, in avanti (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)IDTn/a
TissueLyser II Qiagen 85300
Tris-HCl, soluzione 1M, pH 8.0, grado di biologia molecolare, termo scientifico ultrapuro.
Acqua, (senza DNASI, RNASI)Fisher BioReagentsBP2484100
SCGP0052516812612 d'acciaio rivestite di rame Fisher A39552SAAJ22638AE

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