Interazione tra batteriofago T4 ed E. coli nell'intestino murino: un modello prototipico per lo studio delle dinamiche ospite-batteriofago in vivo

Sommario

I batteriofagi (fagi), virus che infettano i batteri, sono parte integrante del microbioma intestinale. Sebbene questi abitanti simbiotici guidino la fitness batterica e le dinamiche di popolazione, si sa poco su come influiscono sull'omeostasi intestinale e sulle malattie. Questo protocollo studia i fagi T4 isolati all'interno di un modello murino, adattabile ad altre coppie fago-batterio.

Abstract

I batteriofagi (fagi) sono virus che infettano i batteri con specificità a livello di specie e ceppo e sono le entità biologiche più abbondanti in tutti gli ecosistemi conosciuti. All'interno delle comunità batteriche, come quelle che si trovano nel microbiota intestinale, i fagi sono implicati nella regolazione delle dinamiche di popolazione del microbiota e nel guidare l'evoluzione batterica. Nell'ultimo decennio c'è stato un rinnovato interesse per la ricerca sui fagi, in parte a causa delle capacità di uccisione dei fagi litici specifici per l'ospite, che offrono uno strumento promettente per contrastare la crescente minaccia dei batteri resistenti agli antimicrobici. Inoltre, recenti studi che dimostrano che i fagi aderiscono al muco intestinale suggeriscono che potrebbero avere un ruolo protettivo nel prevenire l'invasione batterica nell'epitelio sottostante. È importante sottolineare che, come i microbiomi batterici, i fageomi interrotti sono stati associati a esiti peggiori in malattie come le malattie infiammatorie intestinali. Studi precedenti hanno dimostrato che i fagi possono modulare il microbioma degli animali e degli esseri umani attraverso trapianti di filtrato fecale, a beneficio della salute dell'ospite. Con questa recente ondata di ricerca arriva la necessità di stabilire e standardizzare protocolli per lo studio dei fagi nel contesto del microbioma intestinale. Questo protocollo fornisce una serie di procedure per studiare i fagi T4 isolati e il loro ospite batterico, Escherichia coli, nel contesto del tratto gastrointestinale murino. I metodi qui descritti delineano come partire da un lisato fagico, somministrarlo ai topi e valutare gli effetti sui livelli di ospite batterico e fagico. Questo protocollo può essere modificato e applicato ad altre coppie fago-batterio e fornisce un punto di partenza per lo studio delle dinamiche ospite-fago in vivo.

Introduzione

I batteriofagi, o fagi, sono virus che infettano e uccidono i batteri con specificità a livello di specie e ceppo¹. I fagi svolgono un ruolo importante all'interno di comunità batteriche complesse come il microbiota intestinale, dove sono stati implicati nella regolazione delle dinamiche di popolazione e nel guidare la fitness batterica². Nel corso dell'ultimo decennio, c'è stato un rinnovato interesse per la ricerca sui fagi a causa dell'aumento dei patogeni resistenti agli antimicrobici³ e del potenziale della terapia fagica come strategia di trattamento alternativa. Negli ultimi anni, i cocktail di fagi litici sono stati utilizzati per via endovenosa con un certo successo nelle infezioni settiche batteriche gravi e resistenti agli antibiotici nell'uomo ^3,4. La terapia fagica orale è stata anche proposta come potenziale alternativa agli antibiotici per il trattamento delle infezioni intestinali e delle infiammazioni. Inoltre, i fagi sono stati implicati nel successo dei trapianti di filtrato fecale (FFT), che sono preparati del microbiota fecale che sono stati filtrati per rimuovere i batteri, nel trattamento dell'infezione ricorrente da Clostridioides difficile (rCDI)^5,6, dei disturbi infiammatori intestinali (IBD)^7,8 e dell'enterocolite necrotizzante nei suini prematuri⁹. Alla luce di questi risultati, è importante considerare le interazioni sia tra i fagi e il microbiota intestinale, sia tra i fagi e l'ospite mammifero, poiché l'aggiunta di nuovi fagi in una comunità preesistente può avere effetti indiretti sulla comunità nel suo complesso, e non solo sui suoi batteri bersaglio ^2,10.

Lo studio delle interazioni dei fagi con i loro batteri bersaglio in vitro si è dimostrato utile per comprendere i meccanismi e gli impatti delle interazioni tra fagi e batteri nell'intestino. In questo contesto, è stato dimostrato che i fagi T4 specifici per Escherichia coli dell'ordine Caudovirales richiedono domini simili alle immunoglobuline (Ig) situati all'interno di proteine del capside esterno (Hoc) altamente antigeniche sulla superficie del virione per aderire al muco intestinale¹¹. Inoltre, i saggi transwell hanno dimostrato che i fagi T4 sono in grado di interagire con colture cellulari epiteliali e di traslocare attraverso gli strati cellulari mediante macropinocitosi^12,13. Questi risultati supportano l'ipotesi che i fagi possano interagire con il loro ospite metazoico, anche se non sono in grado di infettare le cellule eucariotiche. Questi modelli, sebbene utili, mancano dell'intera gamma di interazioni complesse che si verificano in un ecosistema intestinale che sono necessarie per un'esplorazione completa dell'interazione tripartita tra fagi, batteri e l'ospite metazoo.

I modelli murini sono uno strumento importante per lo studio dei fagi all'interno di ambienti complessi. Un'applicazione auspicabile della somministrazione di fagi è come strategia alternativa per il trattamento di infezioni resistenti agli antimicrobici o patobionti associati a malattie infiammatorie croniche, tra cui l'IBD. Tuttavia, la letteratura emergente suggerisce che il comportamento dei fagi in vitro non rappresenta pienamente le funzioni in vivo. Buttimer et ^al.14 hanno dimostrato che un cocktail di fagi era in grado di esaurire i batteri bersaglio in un consorzio di microbiota umano semplificato in vitro, ma non poteva essere replicato in vivo in topi gnotobiotici colonizzati con lo stesso consorzio batterio-fago. Inoltre, in un microbioma murino convenzionale, il fago T7 ha portato a una deplezione selettiva dei suoi batteri intestinali bersaglio, sebbene sia stato osservato un graduale recupero nel tempo, indicativo di resistenza evoluta¹⁵. Altri studi hanno dimostrato la coesistenza di fagi somministrati per via orale e dei loro ceppi batterici bersaglio in vivo ^2,16. Infatti, al di là della coesistenza fagi/batteri, la somministrazione di fagi ha portato a cambiamenti diffusi nella composizione e nella funzione complessiva della comunità del microbiota ^2,16. Ciò è rilevante in contesti patologici poiché diversi studi hanno trovato associazioni tra l'aumento dell'abbondanza relativa di Caudovirales e IBD ^7,8,17 che erano indipendenti dai cambiamenti nell'abbondanza batterica⁷. Non è noto se questo sia un fattore trainante o una conseguenza della patogenesi della malattia.

L'obiettivo storico dell'indagine sui fagi è stato la relazione tra un fago e il suo batterio bersaglio. Tuttavia, è anche importante considerare le potenziali interazioni tra il fago e la mucosa, l'epitelio e il sistema immunitario dell'ospite metazoico. Tutte queste interazioni svolgono un ruolo importante nella risposta globale all'infezione fagica intestinale. Per dimostrarlo, i fagi sono stati studiati utilizzando topi privi di germi (GF) per chiarire il loro impatto sul sistema immunitario senza interferenze da parte del microbiota⁸. In questo sistema, gli acidi nucleici fagici sono stati rilevati dai recettori Toll-like (TLR) situati all'interno degli endosomi delle cellule immunitarie fagocitiche (macrofagi e cellule dendritiche). Ciò ha attivato la segnalazione a valle e stimolato la produzione dipendente dalle cellule T di interferone (IFN)-γ⁸ o IFN^{di tipo I 18}. Inoltre, Fluckiger et ^al.19 hanno implicato le cellule T CD8⁺ della memoria nel riconoscimento degli antigeni codificati dai fagi (profagi), che hanno portato alla cross-reattività delle cellule T con gli antigeni tumorali, con conseguente riduzione del carico tumorale. Infine, la produzione di anticorpi fagico-specifici è stata documentata in studi sui topi in cui i fagi sono stati somministrati a modelli animali in modo continuo attraverso l'acqua potabile ^8,20 o mediante somministrazione orale ripetuta per diversi mesi²⁰, dimostrando la capacità delle proteine fagiche di promuovere le risposte immunitarie umorali. Sebbene queste modalità di inoculazione dei fagi consentano un innesco ottimale e continuo del sistema immunitario, potrebbero non rappresentare le interazioni naturali tra i fagi e l'ambiente intestinale, né la cinetica della terapia fagica applicata per via orale. Finora, un numero limitato di studi ha esaminato le interazioni del fago con una singola specie batterica in modelli murini monocolonizzati²¹. Tuttavia, i topi monocolonizzati si sono dimostrati fondamentali nel decifrare gli effetti microbo-specifici delle singole specie sul tratto gastrointestinale (GI) e sullo sviluppo immunitario 22,23,24 e possono ancora rivelarsi utili nella comprensione delle interazioni tripartite tra i fagi, i loro batteri bersaglio e l'ospite metazoico.

Entusiasmantemente, c'è ancora molto da imparare sulle interazioni tra fagi intestinali e batteri commensali intestinali, nonché sulle interazioni che si verificano tra l'ospite metazoico e i fagi che risiedono al suo interno. Questo protocollo fornisce una serie di procedure per studiare il fago T4 isolato e la sua controparte batterica, E. coli (K-12, BW25113), utilizzando un modello murino gnotobiotico. Queste procedure standardizzate forniscono anche una base per l'ottimizzazione di altre diadi fagi/batteri adattando i parametri di crescita alle coppie di interesse. I metodi qui descritti delineano: (1) Preparazione di lisati fagici e veicoli T4 per il gavage orale di topi; (2) Somministrazione orale di fago T4 a topi gnotobiotici monocolonizzati da E. coli ; (3) Monitoraggio dei livelli di fagi T4 nelle feci e nei tessuti di topo nel tempo.

Per i risultati rappresentativi qui presentati, i lisati fagici T4 purificati sono stati propagati da stock di banche fagiche mantenute dal Rohwer Lab. Il metodo Phage-on-Tap per la propagazione del fago T4 è stato adattato²⁵, come indicato in questo protocollo. Il metodo produce titoli fagici ad alto titolo, a basso contenuto di endotossine entro tre giorni. Utilizzando questo approccio, sono stati raccolti di routine 10 ml di ≥^{10 10} unità formanti placca (pfu)/mL di fago T4 con < 0,5 unità di endotossine (EU)/mL. I livelli raccomandati di endotossine per la somministrazione orale o endovenosa nei topi sono rispettivamente ≤ 20 EU/mL e ≤ 5 EU/kg/h (o 0,1 EU somministrati in 1 ora per un topo di 20 g), il che lo rende un metodo adatto di preparazione dei fagi per l'inoculazione in vivo . Tutti gli stock fagici sono stati conservati a 4 °C in tampone fagico salino di magnesio (SM) (ricetta fornita al punto 1.1.5.1). E. coli è stato coltivato in terreni LB. Per varie coppie fagi-batteri, diversi terreni di coltura e condizioni di crescita possono essere adattati da questo protocollo. I fagi possono anche essere reperiti dall'ambiente, come le acque reflue, l'acqua marina, il suolo e il contenuto intestinale e possono essere isolati e purificati secondo Sambrook e Russell²⁶ prima della preparazione utilizzando le condizioni di crescita e propagazione appropriate per ciascuna coppia fago-ospite di interesse²⁵. In alternativa, i fagi possono essere ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali) o da banche di fagi.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida stabilite dai protocolli approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'UBC e dal Comitato per la sicurezza biologica (A23-0113, B19-0038). I topi sono stati ospitati presso l'Università della British Columbia in condizioni prive di agenti patogeni presso il Center for Disease Modelling. I topi C57BL/6 sono stati allevati all'interno della struttura in un isolatore sterile a film flessibile, dotato di dieta sterile per topi, acqua, lettiera e materiale per il nido. I topi sono stati mantenuti su un ciclo giorno/notte di 12 ore. I topi sperimentali, sia maschi che femmine, sono stati abbinati all'età di ciascun esperimento, di età compresa tra 6 e 12 settimane e del peso di 15-30 g per tutti gli esperimenti.

1. Preparazione di lisati fagici e veicoli per il gavage orale nei topi

1. Purificazione dei fagi e generazione di scorte
   NOTA: In questo studio, i fagi T4 vengono coltivati e titolati placcando su un prato di batteri utilizzando il metodo dello strato singolo di agar, descritto di seguito. Il metodo del doppio strato di agar è stato descritto in precedenza^25,27e può anche essere usato con un'efficacia simile. Per questo protocollo è stato scelto il metodo a strato singolo di agar in quanto fornisce una migliore visibilità della placca²⁸.
   1. Coltiva E. coli in 5 mL di terreno sterile LB in provette sterili di polistirene o vetro (con tappi). Incubare le provette a 37 °C con agitazione a 200 giri/min per tutta la notte, fino al raggiungimento della fase stazionaria.
   2. Preparare l'agar morbido in un flacone di vetro sterilizzando in autoclave LB con agar allo 0,5% e raffreddando a 50 °C o meno (pur rimanendo un liquido) prima dell'integrazione. Preparare una quantità sufficiente di agar morbido per 15 ml per piastra.
   3. Integrare l'agar molle con MgSO₄ e CaCl₂ fino a una concentrazione finale di 1 mM per ciascuno. Aggiungere 100 μL di coltura notturna di E. coli per ogni 3 mL di agar molle. Mescolare delicatamente utilizzando una barra magnetica per omogeneizzare gli integratori e la coltura nell'agar morbido.
      NOTA: La coerenza nel volume e nella densità di E. coli che viene aggiunto alla preparazione di agar morbido è fondamentale (descritta nella sezione dei risultati rappresentativi).
   4. Aggiungere 15 ml di agar molle + E. coli per piastra di Petri (15 cm di diametro) utilizzando una pipetta sierologica. Lasciare che le piastre si solidifichino a temperatura ambiente per l'uso in giornata.
      NOTA: I piatti si solidificheranno in circa 20 minuti con i coperchi aperti. L'agar rimarrà morbido ma non si sposterà quando le piastre vengono capovolte.
   5. Preparare 8-10 diluizioni seriali del fago T4 sorgente in fattori di 10 diluendo in tampone SM. Versare 5 μL di ciascuna diluizione su piastre. Lasciare asciugare le macchie, capovolgere e incubare le piastre a 37 °C per una notte.
      1. Per preparare il tampone fagico di magnesio salino (SM), in 1 L di H₂O deionizzato, sciogliere 100 mM di NaCl, 8 mM di MgSO₄·7H₂O e 50 mM di Tris-HCl (pH 7,4). Autoclavare e conservare a temperatura ambiente.
         NOTA: Il giorno successivo, E. coli dovrebbe essere cresciuto in un prato in tutto il morbido agar LB. Le placche, o le aree di crescita ripulite visibili nel prato di E. coli , appariranno dove si è verificata l'uccisione dei fagi degli ospiti infetti di E. coli . Ogni placca rappresenta un'unità formatrice di placche (pfu).
   6. Prelevare una singola placca dalla piastra di agar morbida spingendo un puntale di pipetta sterile al centro della placca, creando un tappo di agar all'estremità del puntale. Risospendere il tappo della placca in 1 mL di tampone SM in una provetta per microcentrifuga da 1,7 mL. Agitare il tubo alla massima velocità per 1 minuto per mescolare.
   7. Centrifugare la provetta a 4000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per rimuovere eventuali detriti dal lisato. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga.
   8. Per propagare il fago isolato, ripetere i passaggi 1.1.1-1.1.3. Aggiungere 100 μL del fago isolato a un'aliquota di 15 mL di agar molle contenente E. coli in una provetta conica. Capovolgere il tubo tre volte per mescolare e versare l'agar in una capsula di Petri.
   9. Lasciare asciugare le piastre prima di capovolgerle e incubarle per una notte a 37 °C. Preparare una piastra di controllo del prato senza fagi per confermare la vitalità di E. coli .
      NOTA: Dopo l'incubazione notturna, la piastra di controllo dovrebbe avere un prato di E.coli mentre la piastra contenente fagi dovrebbe essere completamente lisata.
   10. Per estrarre il fago dalla piastra, aggiungere 5 mL di tampone SM sulla superficie della piastra eliminata dai fagi e agitare a 70 giri/min su un bilanciere per 15 minuti a temperatura ambiente.
   11. Raccogliere il tampone dalla piastra in una provetta da centrifuga conica da 50 mL e centrifugare a 4000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettare eventuali detriti dalla piastra di agar.
   12. Raccogliere il lisato di fago T4 in una nuova provetta e conservare a 4 °C fino alla titolazione e alla propagazione.
       NOTA: I fagi T4 sono stabili per oltre 10 anni²⁵; Tuttavia, la stabilità dipenderà dal tipo di fago e dalle condizioni di conservazione. Anche il titolo fagico varia con il tempo di conservazione. I fagi sono sensibili al congelamento. Pertanto, la crioconservazione è consigliata in azoto liquido ed evitare cicli di gelo-disgelo in quanto ciò potrebbe danneggiare i fagi, riducendo il titolo fagico²⁵.
   13. Titolare il lisato di fago T4 per determinare la concentrazione in pfu/mL, come descritto in precedenza 25,29,30. Uno stock di fagi T4 ad alto titolo conterrà 10⁸ pfu/mL o più.
2. Preparazione di lisati fagici sperimentali
   1. Coltura di E. coli in 5 mL di terreno LB in provette sterili di polistirene o vetro (con tappi). Incubare le provette per una notte a 37 °C con agitazione a 200 giri/min, fino al raggiungimento della fase stazionaria.
   2. Subcoltura la coltura notturna di E. coli 1:50 in terreni da 100 mL LB in un pallone conico di vetro. Incubare a 37 °C con agitazione a 200 giri/min fino a quando i batteri non hanno raggiunto la fase esponenziale medio-precoce (circa 1,5 ore).
      NOTA: È possibile eseguire una curva di crescita iniziale per determinare la densità ottica nell'intervallo di 600 nm (OD₆₀₀) in cui la coltura batterica è in fase esponenziale. La coltura in un tubo conico di vetro è suggerita poiché prove recenti hanno scoperto che i fagi sono in grado di aderire a materie plastiche come il polipropilene³¹.
   3. Aggiungere 100 μL del ceppo fagico T4 ad alto titolo della fase 1.1 nella sottocoltura di E. coli e incubare a 37 °C agitando per 3 ore o fino a quando il nuovo lisato non è più torbido. Raccogliere il lisato fagico T4 in provette coniche da 50 mL e procedere direttamente alle fasi di pulizia o, se necessario, conservare a 4 °C fino al giorno successivo.
      NOTA: Una dimensione maggiore del phage burst (che indica un numero medio più elevato di virioni rilasciati per ciclo di replicazione) richiede un periodo di incubazione più lungo per la sottocoltura batterica nella fase 1.2.2. Ciò fornisce una maggiore densità batterica prima del picco con le scorte di fagi.
   4. Centrifugare i lisati a 4000 x g per 20 minuti a temperatura ambiente per pellettare eventuali batteri e detriti cellulari rimanenti. Sterilizzare con filtro il surnatante risultante utilizzando un filtro in nylon da 0,22 μm e trasferire il filtrato in nuove provette da centrifuga coniche da 50 mL.
   5. Aggiungere 0,1 volumi di cloroformio a ciascun volume di lisato fagico T4 filtrato per uccidere eventuali batteri rimanenti e prevenire la crescita batterica. Vorticare brevemente per mescolare e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
      NOTA: I fagi con involucro lipidico sono sensibili al cloroformio, che può ridurre il titolo fagico²⁵. Salta questo passaggio se necessario.
      ATTENZIONE: Il cloroformio è un solvente organico tossico pericoloso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la pelle. Utilizzare una cappa aspirante e dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati quando si lavora con il cloroformio. Utilizzare il vetro invece delle pipette sierologiche in polistirolo quando si lavora con il cloroformio, poiché non è compatibile con la maggior parte delle materie plastiche. Il cloroformio può essere posto in provette da centrifuga coniche in polipropilene per i passaggi 1.2.5-1.2.6, ma non deve essere conservato a lungo termine in provette di plastica.
   6. Centrifugare il lisato a 4000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per separare il cloroformio dal lisato. Utilizzare una pipetta sierologica per trasferire con cautela lo strato superiore di lisato in una nuova provetta conica da 50 mL senza disturbare lo strato di cloroformio sottostante. Gettare i rifiuti di cloroformio nell'apposito contenitore per rifiuti liquidi pericolosi. Conservare i lisati a 4 °C fino al giorno successivo alla concentrazione e allo scambio del tampone.
   7. Concentrare i lisati fagici in un dispositivo filtrante centrifugo da 100 kDa (vedere Tabella dei materiali) aggiungendo 13 mL di lisato fagico al serbatoio superiore del dispositivo e centrifugando a 4000 x g per 5 minuti, o fino a quando la maggior parte del lisato non è passata attraverso il filtro nel serbatoio inferiore.
      NOTA: Cercare di avere circa 2 ml di lisato alla fine del tempo di centrifuga. Man mano che la concentrazione di fagi aumenta nel filtro con l'aggiunta di lisato, è probabile che i tempi di rotazione aumentino. I dispositivi di filtraggio centrifugo sono dotati di un fermo fisico per evitare che si asciughino³². Non lasciare che la membrana del filtro si asciughi se si prevede un uso continuato (ad esempio, rimuovendo tutto il liquido dal serbatoio superiore). I tempi di centrifuga possono variare in base al tipo di fago e al titolo.
   8. Utilizzando una pipetta P200 o P1000, pipettare delicatamente i restanti ~2 mL di lisato su e giù all'interno del serbatoio superiore per sbloccare la membrana del filtro dopo ogni centrifuga. Scartare il filtrato dal serbatoio inferiore in un contenitore di scarto, lasciando il fago concentrato nel serbatoio superiore.
   9. Ripetere i passaggi 1.2.7-1.2.8 fino a quando l'intero volume di lisato fagico non è stato fatto passare attraverso il dispositivo filtrante, con ~2 mL di fago concentrato trattenuto nel serbatoio superiore dopo ogni centrifuga.
   10. Sbloccare la membrana del filtro dopo l'ultima centrifuga pipettando il lisato rimanente (~2 mL) nel serbatoio superiore su e giù. Lavare il fago (scambio tampone) aggiungendo 12 mL di tampone SM al serbatoio superiore e centrifugare a 4000 x g per 10 minuti o fino a quando la maggior parte del tampone non è passata attraverso il filtro.
   11. Gettare il filtrato e ripetere la fase di lavaggio (fase 1.2.10). Risospendere i restanti 2 mL di lisato nel tampone SM a un volume finale di 10 mL (o meno), per la conservazione a lungo termine. Trasferire il lisato in una provetta da centrifuga conica da 50 mL e conservare a 4 °C fino alla rimozione dell'endotossina.
       NOTA: È facoltativo titolare il fago in questa fase per garantire che il lisato fagico sia stato concentrato (> 10⁸ ufu/mL) e per determinare la perdita di fagi durante il processo di rimozione dell'endotossina.
   12. Rimuovere le endotossine contaminanti dal lisato fagico T4 aggiungendo 0,4 volumi di 1-ottanolo (vedere Tabella dei materiali) al volume totale del lisato
       NOTA: Le endotossine vengono rimosse in quanto altamente immunostimolatorie, e quindi la loro presenza può portare all'induzione di una risposta immunitaria innata fago-indipendente²⁵.
       ATTENZIONE: L'1-ottanolo è un composto aromatico, organico, infiammabile con un forte odore ed è irritante per gli occhi. Indossare DPI appropriati quando si lavora con l'1-ottanolo. Eseguire tutti i lavori in una cappa aspirante per evitare l'inalazione di vapore. Utilizzare una pellicola sigillante per evitare la fuoriuscita dei tubi quando si lavora all'esterno della cappa aspirante.
   13. Sigillare il coperchio della provetta da centrifuga conica con pellicola sigillante per evitare perdite. Agitare a 120 giri/min su piattaforma o agitatore a dondolo a temperatura ambiente per 1 h, seguito da incubazione a 4 °C per 1,5 h, senza agitare.
   14. Centrifugare a 4000 x g per 10 minuti per separare il lisato eliminato dalle endotossine dall'1-ottanolo. Lo strato di 1-ottanolo galleggerà sopra il lisato. Utilizzare una pipetta P1000 per rimuovere con cura la maggior quantità possibile di 1-ottanolo e gettarla nell'apposito contenitore per rifiuti liquidi pericolosi/infiammabili.
   15. Utilizzare un ago da 18 G e una siringa da 10 mL per raccogliere il lisato fagico sotto il restante strato di 1-ottanolo, facendo attenzione a non raccogliere lo strato di 1-ottanolo. Conservare il lisato a 4 °C fino a velocità di aspirazione.
   16. Trasferire aliquote da 1 mL di lisato fagico T4 in provette sterili da microcentrifuga da 1,5 mL. Velocità di aspirazione con coperchi aperti a 4000 x g a temperatura ambiente per far evaporare l'1-ottanolo residuo dal lisato. Accelerare il vuoto per 3 ore o fino a quando il volume del lisato fagico non è stato ridotto del 30%²⁵. Conservare a 4 °C fino alla titolazione.
   17. Titolare il lisato fagico per determinare la concentrazione in pfu/mL. Diluire il lisato fagico T4 risultante nel tampone SM alla concentrazione desiderata e rititolare per confermare.
   18. Quantificare le endotossine presenti nel lisato fagico T4 utilizzando un kit di quantificazione delle endotossine cromogeniche secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali). Confrontare i livelli di endotossine nel lisato fagico finale con un campione di pre-rimozione delle endotossine, controlli del veicolo, tampone e acqua potabile di topo.
       NOTA: Il kit di quantificazione delle endotossine cromogeniche è inattivato dall'1-ottanolo²⁵. Eseguire passaggi di vuoto di velocità per rimuovere l'1-ottanolo (passaggio 1.2.16) prima di quantificare le endotossine. Il contenuto di endotossine per l'acqua distillata è stimato a 20 EU/mL²⁵; Tuttavia, il contenuto di endotossine nell'acqua potabile dei topi può variare da una struttura all'altra. Se i livelli di endotossine nel lisato fagico superano la quantità presente nell'acqua potabile, considerare la possibilità di ripetere i passaggi di rimozione dell'endotossina (1.2.12-1.2.16).
   19. Conservare i lisati fagici T4 concentrati e eliminati dalle endotossine in tampone SM a 4 °C.
3. Preparazione di lisato batterico privo di fagi per i comandi dei veicoli
   NOTA: Un lisato batterico privo di fagi può essere preparato come veicolo per controllare eventuali effetti dovuti a contaminanti batterici (ad esempio, endotossine) generati nella produzione di lisato fagico nella fase 1.2, che potrebbero influire sui risultati sperimentali una volta inoculati nei topi.
   1. Da una coltura notturna di E. coli, subcoltura di E. coli 1:50 in 100 mL di terreno LB. Senza aggiunta di fagi, continuare a coltivare i batteri agitando a 37 °C per 3 ore o facendo corrispondere il tempo di incubazione per il lisato fagico prodotto nella fase 1.2.
   2. Trasferire la coltura di E. coli in provette coniche da 50 mL e lisare le cellule utilizzando una sonda sonicatrice (vedere la tabella dei materiali) su ghiaccio a 30 kHz per impulsi di 30 s (3x) per lisare manualmente le cellule batteriche.
   3. Seguire il resto del protocollo come al passaggio 1.2, a partire dal passaggio 1.2.4, comprese tutte le fasi di pulizia, lavaggio e rimozione delle endotossine.
      NOTA: Durante la concentrazione utilizzando il dispositivo di filtraggio centrifugo, il lisato del veicolo scorrerà attraverso il filtro più rapidamente del lisato fagico, a causa dell'assenza di fagi. Pertanto, ridurre i tempi di centrifugazione da 5 minuti a 2-5 minuti per garantire che la membrana dell'ultrafiltro non si asciughi durante la centrifugazione prolungata.
   4. Titolare il lisato del veicolo per confermare che non contiene fagi.
   5. Utilizzare un kit di quantificazione delle endotossine cromogeniche secondo le istruzioni del produttore per misurare i livelli di endotossine nel lisato del veicolo. Diluire il lisato veicolo nel tampone SM in modo che corrisponda ai livelli di endotossine nel lisato fagico.
4. Controlli sperimentali alternativi: preparazione di lisato fagico termoinattivato
   NOTA: Un'alternativa al lisato batterico privo di fagi è un lisato fagico inattivato dal calore. L'inattivazione del calore dissocia i virioni fagici, mentre le endotossine residue come i lipopolisaccaridi (LPS) sono termostabili ^8,33. Questo metodo è stato utilizzato da Gogokhia et ^al.8 per determinare se i virioni fagici intatti e vitali fossero necessari per l'attivazione immunitaria. I ricercatori sono incoraggiati a testare entrambi i metodi (senza fagi vs. inattivati con calore) e determinare quale controllo è più appropriato per le loro esigenze sperimentali. Qualunque sia la scelta, è importante riconoscere che è improbabile che un controllo tampone sia appropriato a causa della significativa manipolazione necessaria per concentrare e ripulire uno stock di fagi.
   1. Trasferire il volume richiesto di lisato fagico T4 pulito, purificato e diluito dalla fase 1.2 (100 μL per topo) a provette sterili per microcentrifuga dotate di chiusure del coperchio.
   2. Riscaldare i lisati su un blocco termico a 95 °C per 15 min¹⁶.
   3. OPZIONALE: Se è necessaria la rimozione degli acidi nucleici fagi/batterici, eseguire il trattamento con DNasi I e RNasi A secondo Jakočiūnė e Moodley³⁴. Brevemente:
      1. Aggiungere 50 μL di tampone DNasi I 10x, 1 μL DNasi I (1 U/μL) e 1 μL RNasi A (10 mg/mL) (vedere la tabella dei materiali) a 450 μL di lisato fagico inattivato dal calore.
      2. Incubare i lisati a 37 °C per 1,5 h in blocco termico, senza agitare.
      3. Inattivare la DNasi I e la RNasi A aggiungendo 20 μL 0,5 M di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)³⁴.
   4. Tenere i lisati a temperatura ambiente per 10 minuti per raffreddare e combinare i lisati se si utilizzano più provette. Conservare a 4 °C fino alla titolazione.
   5. Eseguire un titolo fagico per confermare che non è presente alcun fago T4 vitale nel lisato. Conservare i lisati inattivati dal calore a 4 °C.
   6. Utilizzare un kit di quantificazione delle endotossine cromogeniche secondo le istruzioni del produttore per misurare i livelli di endotossine nel lisato inattivato dal calore. Diluire il lisato inattivato dal calore in tampone SM in base ai livelli di endotossine presenti nel lisato fagico abbinato.

2. Somministrazione e monitoraggio del fago T4 in topi monocolonizzati da E. coli

1. Monocolonizzazione di topi con E. coli
   1. Preparare E. coli per la somministrazione nei topi GF⁸ coltivando E. coli prelevati da una singola colonia in terreni LB durante la notte.
   2. In condizioni rigorose e sterili³⁵, somministrare 200 μL di coltura di E. coli a topi GF alloggiati in isolatori vinilici sterili o gabbie ermetiche di bioesclusione mediante lavaggio orale. Se si utilizzano batteri aerotolleranti, i topi possono anche essere colonizzati mediante l'applicazione di 200 μL di coltura batterica sul dorso di ciascun topo.
      NOTA: La dose di inoculazione dipenderà dal ceppo, poiché batteri diversi dimostrano una diversa capacità di sopravvivenza a pH^36,37. Zucoloto et ^al.35 raccomandano l'inoculo con 1 x 10⁸ cfu per animale. I risultati rappresentativi mostrati qui sono stati generati da topi inoculati con una coltura notturna (la cfu non è stata determinata). Possono essere eseguiti esperimenti pilota per determinare una dose che si traduce in una colonizzazione affidabile del ceppo murino di interesse. Il volume di batteri da somministrare per via orale può essere influenzato dall'età e dal peso dei topi. Consultare il protocollo etico individuale di laboratorio o istituzionale sugli animali per le dosi massime consentite. Il volume qui suggerito si basa su una tolleranza di gavage del 10% del peso corporeo del topo (ad esempio, 200 μL al massimo per un topo di 20 g). Alcune specie batteriche non tollerano l'acidità dello stomaco e non riescono a colonizzare l'intestino. Prendere in considerazione prima il gavaging con 100 μL di 1 M NaHCO₃ per neutralizzare gli acidi dello stomaco². Se si utilizza un anaerobio rigoroso per colonizzare, il microbo dovrà essere coltivato in condizioni anaerobiche e trasferito alla struttura per animali gnotobiotici in contenitori ermetici preparati individualmente (1 per ogni topo). Eseguire rapidamente ogni sonda gastrica una volta aperto il contenitore per limitare la perdita di vitalità microbica dovuta all'esposizione all'ossigeno.
   3. Monitorare i topi per verificare la presenza di effetti avversi sulla salute.
      NOTA: In caso di effetti negativi sulla salute, fare riferimento agli standard stabiliti dalla struttura di cura degli animali pertinente. I possibili effetti avversi sulla salute includono, ma non sono limitati a: (1) Aspirazione del liquido gastrico: i sintomi includono l'espulsione di bolle attraverso il naso, respirazione/respiro a bocca aperta. (2) Perforazione dell'esofago: i sintomi includono salute rapidamente cagionta, ingobbimento, letargia, che porta alla morte dell'animale entro 24 ore. (3) Infiammazione dell'esofago dovuta a gavage ripetute: i sintomi includono difficoltà a inserire l'ago dell'anagrafe. (4) Diarrea dovuta ad alterazioni del microbioma.
   4. Confermare la colonizzazione batterica nei pellet fecali mediante coltura almeno una volta alla settimana e/o mediante sequenziamento dell'rRNA 16S³⁵.
      NOTA: Se si colonizzano gli allevatori all'interno di un isolatore gnotobiotico per la produzione di topi sperimentali, pianificare con almeno 9 settimane di anticipo la generazione di topi sperimentali di prima generazione di prole (F1) di 6 settimane. In alternativa, i topi adulti GF possono essere monocolonizzati. In questo approccio, si raccomanda di attendere 7 settimane dopo la colonizzazione prima dell'inoculazione dei fagi, poiché questo è il tempo necessario affinché la mucosa intestinale si stabilizzi dopo l'introduzione di un microbiota complesso nei topi GF³⁸.
2. Inoculazione orale del fago T4 in topi monocolonizzati da E. coli
   1. Diluire i lisati fagici T4 e i controlli del veicolo a una concentrazione predeterminata nel tampone SM. Secondo Hsu et ^al.2, diluire i lisati fagici per consentire la somministrazione di 2 x 10⁶ pfu per topo².
      NOTA: È possibile utilizzare una concentrazione più alta o più bassa di fago a seconda della stabilità del fago in vivo. Dosi di 2 x 10², 2 x 10⁴ e 2 x 10⁶ pfu di fago T4 per topo hanno portato a una colonizzazione stabile e a lungo termine nell'intestino che non sembrava essere dose-dipendente (mostrato nella sezione dei risultati rappresentativi). La cinetica fago-batteri dovrebbe quindi essere sperimentata in vivo prima di esperimenti su larga scala.
   2. In condizioni sterili e gnotobiotiche, manipolare ogni topo con 100 μL di NaHCO₃ 1 M sterilizzato in autoclave per neutralizzare gli acidi dello stomaco. Attendere 10 minuti, quindi eseguire il sonda gastrica con 100 μL di lisato fagico T4 o il controllo del veicolo.
   3. Monitorare i topi per verificare la presenza di effetti avversi sulla salute.

3. Monitoraggio dei livelli di fagi T4 in vivo

NOTA: Una volta che i topi sono stati inoculati con i fagi, la concentrazione sia dei fagi che dei batteri bersaglio può essere misurata in campioni fecali o tissutali. Questo fornisce informazioni sulla cinetica dell'infezione fagica e sulle dinamiche di colonizzazione di entrambi gli organismi.

1. Placcatura a punti del fago T4 per determinare la concentrazione nei pellet fecali
   1. Raccogliere i pellet fecali da ciascun topo in provette sterili pre-pesate per microcentrifuga per misurare i livelli di fagi T4 ed E. coli . Conservare i tubi su ghiaccio fino alla placcatura.
      NOTA: Posizionare i campioni sul ghiaccio nel periodo intermedio tra la raccolta e la placcatura per rallentare la crescita dei batteri aerotolleranti. Per diverse ore, potrebbe esserci ancora una crescita di batteri aerobi o una certa morte di batteri anaerobici a causa dell'esposizione all'ossigeno che potrebbe portare a conteggi batterici distorti. Pertanto, la placcatura di batteri e fagi deve essere eseguita il prima possibile dopo la raccolta del campione. I batteri anaerobici obbligati non tollerano l'esposizione all'ossigeno. Per conservare il campione, raccogliere i campioni in provette sigillate e trasferire le provette in una camera anaerobica il prima possibile dopo la raccolta. Se non viene rilevata alcuna crescita nei campioni fecali, prendere in considerazione alternative come la qPCR dell'rRNA 16S per la quantificazione batterica.
   2. Registrare i pesi finali di ciascuna provetta e calcolare il peso del campione sottraendo il peso iniziale della provetta. Questo verrà utilizzato per normalizzare la concentrazione di fagi T4 ed E. coli al peso del campione (pfu/g o cfu/g, rispettivamente).
   3. Aggiungere 1 mL di tampone SM sterile a ciascuna provetta e vorticare accuratamente alla massima velocità (>1 min) per omogeneizzare i pellet fecali. Se il campione è inferiore a 15 mg, può essere aggiunto un volume minore di tampone SM. Registrare il volume di tampone SM aggiunto a ciascun campione per i calcoli di ufc/g o pfu/g di campione.
   4. Preparare una serie di 8 (o più a seconda della concentrazione di fagi prevista) diluizioni seriali di 20 μL di ciascun campione in tampone SM da 180 μL, in fattori di 10. Vorticare brevemente ogni campione omogeneizzato per mescolarlo prima di aggiungerlo alla prima provetta/pozzetto. Pipettare per miscelare tra un'aggiunta e l'altra e sostituire i puntali tra una diluizione e l'altra per evitare di gonfiare la conta dei fagi o dei batteri tramite il carryover del campione.
      NOTA: Se le fibre e i detriti presenti nel campione ostacolano il pipettaggio, aggiungere ulteriore tampone al liquame fecale per diluire ulteriormente il campione.
   5. Posizionare 5 μL di ciascuna diluizione su piastre di agar morbido LB contenenti E. coli (per i saggi della placca fagica) o piastre di agar LB (agar all'1,5%, per i saggi di colonie batteriche) per determinare la concentrazione di fagi T4 ed E. coli in ciascun campione. Per una maggiore precisione, individuare ogni campione in triplice copia.
      NOTA: Se si preparano diluizioni seriali in una piastra a 96 pozzetti, è possibile utilizzare una pipetta multicanale P20 a 8 canali per pipettare ciascuna colonna di campione diluito in serie sulle piastre. Cambiare i puntali tra una diluizione e l'altra, anche se si passa dal più diluito al più concentrato, poiché il fago può aderire alle pareti del puntale della pipetta e alterare la quantità di fago aggiunto a ciascun nuovo pozzetto³¹.
   6. Lasciare asciugare ogni punto prima di capovolgere la piastra e metterla nell'incubatrice. Incubare per una notte a 37 °C.
   7. Per ogni campione, selezionare la diluizione alla quale ci sono 3-30 placche numerabili per punto. Contare e annotare il numero di placche presenti nel punto e la diluizione utilizzata.
   8. Calcolare pfu/g di campione dividendo il numero di placche per il volume placcato in ciascun punto per ottenere pfu/μL. Moltiplicare questo valore per il fattore di diluizione e per il volume di tampone SM aggiunto a ciascun campione per ottenere pfu/campione. Infine, dividere per il peso del campione per ottenere³⁰ unità di ufc/g.
      
      
2. Campionamento tissutale agli endpoint sperimentali
   1. In ogni momento selezionato, sopprimere i topi secondo il protocollo di etica animale istituzionale approvato e raccogliere il contenuto cecale, il contenuto dell'intestino tenue e crasso e tutti i tessuti di interesse in provette per microcentrifuga sterili e prepesate da 2 ml.
   2. Registrare i pesi finali di ciascuna provetta per calcolare il peso del campione. Conservare i fazzoletti e il contenuto cieco sul ghiaccio fino alla placcatura in giornata.
   3. Aggiungere un tampone SM sterile a ciascuna provetta e registrare i volumi aggiunti.
   4. Per il contenuto cecale e intestinale, prelevare accuratamente i campioni di vortice (>1 min) come indicato al punto 3.1.3.
   5. Per i campioni di tessuto, aggiungere una perlina di metallo sterile a ciascuna provetta. Omogeneizzare i tessuti utilizzando un lizzatore tissutale (vedere Tabella dei materiali) a 20 Hz per 5 minuti o fino a quando i tessuti non sono dissociati e la sospensione è omogenea.
      NOTA: Se i campioni non si omogeneizzano bene, prendere in considerazione l'aumento del volume del tampone SM aggiunto, l'aumento del tempo di omogeneizzazione o l'aumento della frequenza di omogeneizzazione a 30 Hz. Un omogeneizzatore tissutale può anche essere utilizzato per dissociare i tessuti, consentendo il recupero di batteri e fagi^39,40. Gli omogeneizzatori funzionano a frequenze più elevate rispetto ai lisatori tissutali, mantenendo l'integrità dei batteri.
   6. Preparare le diluizioni seriali di ciascun campione in fattori pari a 10 ed eseguire la placcatura a punti per determinare le concentrazioni di E. coli e fagi T4 in ciascun campione, come descritto nei passaggi 3.1.4-3.1.8⁴¹.

Risultati

Per studiare le interazioni tra la diade fago T4/E. coli nell'intestino murino, sono stati preparati, puliti e purificati i lisati del fago T4 e del veicolo (Figura 1A). I lisati fagici T4 sono stati titolati mediante test a placca e diluiti a 2 x 10⁷ pfu/mL (2 x 10⁶ pfu/topo) in tampone SM. I lisati del veicolo sono stati anche titolati per confermare l'assenza di fagi vitali e diluiti nello stesso volume di tampone SM del lisato fagico T4. I livelli di endotossine sono stati quantificati in lisati diluiti utilizzando un kit di quantificazione delle endotossine cromogeniche. Il fago T4, il fago inattivato dal calore e i lisati veicolo presentavano livelli di endotossine inferiori a livelli accettabili per l'acqua potabile (<20 EU/mL)²⁵ (Figura 1B). Poiché il lisato veicolo aveva una quantità di endotossina simile a quella del lisato fagico T4, è stato ritenuto un controllo adatto. Il lisato fagico inattivato termicamente (2 x 10⁷ ufu/mL prima del trattamento termico) presentava meno endotossine sia del veicolo che del lisato fagico T4. Secondo le istruzioni del kit, i campioni che erano stati trattati con 1-ottanolo sono stati testati per l'inibizione del test mediante l'aggiunta di uno standard di endotossina al lisato del veicolo (veicolo a punta), per dare una concentrazione finale di 0,5 EU/mL. I livelli di endotossine del veicolo aumentati meno i livelli di endotossina del veicolo misuravano 0,5 EU/mL ±25%, secondo le raccomandazioni del produttore (Figura 1B). Ciò ha dimostrato che l'1-ottanolo è stato rimosso con successo e che non vi era alcuna inibizione del saggio causata dai lisati che potesse interferire con i risultati del test.

Coli I topi C57BL/6 monocolonizzati K-12 (BW25113) sono stati allevati all'interno di un isolatore vinilico sterile a film flessibile in condizioni gnotobiotiche (Figura 2A). I topi della generazione F0 sono stati colonizzati con E. coli attraverso la sua aggiunta al loro ambiente e al co-housing. Solo la progenie (generazione F1 e F2) che è stata colonizzata con E. coli dalla nascita attraverso la trasmissione verticale e il co-housing sono state utilizzate per gli esperimenti. Questa strategia ha controllato i cambiamenti nel sistema immunitario, la produzione di muco e lo sviluppo del tratto gastrointestinale che si verifica in risposta all'inoculazione batterica^22,37, consentendo quindi la misurazione dei cambiamenti che si verificano solo a causa dell'introduzione dei fagi. Una volta maturati, i topi sperimentali sono stati trasferiti in isogabbie sterili, dove ciascuno di essi ha ricevuto 2 x 10⁶ pfu di fago T4 o un volume uguale di lisato veicolo per via orale a 6-8 settimane di età. L'abbondanza di fagi T4 ed E. coli è stata monitorata per quattro settimane mediante raccolta di pellet fecali e saggi di placcatura spot rispettivamente su agar allo 0,5% (morbido) o all'1,5%. Nel corso di questo esperimento, il fago T4 e l'E. coli sono stati in grado di coesistere senza che nessuna delle due popolazioni si esaurisse (Figura 2B, C). La somministrazione orale di fago T4 a dosi più basse di 2 x 10² e 2 x 10⁴ pfu/topo non ha ridotto la capacità del fago T4 di colonizzare l'intestino rispetto a 2 x 10⁶ pfu (Figura 2D). Allo stesso modo, non è stato osservato un effetto dose-dipendente dell'inoculazione di T4 sui livelli di E. coli (Figura 2E).

È importante sottolineare che la coerenza nella placcatura tra i campioni è risultata cruciale per il conteggio della placca. Ad esempio, quando si aggiungono batteri nell'agar morbido, è stato determinato che la densità dei batteri ha influenzato notevolmente l'esito del test. L'aggiunta di E. coli che è stata sottocoltivata per 1 ora, 1,5 ore o 2 ore, ha comportato un numero inferiore di placcature rispetto all'aggiunta di E. coli sottocoltivato per 2,8 ore o più. Inoltre, la quantificazione della placca si è stabilizzata a ~1 x 10⁹ ufc/mL quando E. coli è stato sottoposto a subcoltura per 2,8-16 ore (durante la notte), con un aumento di circa 5 volte rispetto al valore calcolato da una subcoltura di 1 ora (~2 x 10⁸ ufu/ml) (Figura 3A). Piuttosto che sub-colturare, i batteri bersaglio possono essere inoculati in agar molle da colture notturne. In questo caso, il volume della coltura di E. coli di 16 ore (durante la notte) che è stata inoculata nell'agar molle ha influito sulla conta delle placche (Figura 3B). Questi risultati indicano che la densità di E. coli all'interno dell'agar può influenzare il conteggio dei test di placca. In entrambi gli approcci, i risultati della quantificazione dei fagi si sono stabilizzati allo stesso valore (10⁹ ufu/ml), suggerendo che i batteri bersaglio devono avere una densità sufficientemente elevata nell'agar morbido per garantire l'accuratezza del conteggio delle placche.

Nel loro insieme, questi risultati evidenziano l'importanza di sviluppare una comprensione della cinetica fago-batteri attraverso esperimenti pilota in vitro e in vivo prima di eseguire manipolazioni sperimentali.

Figura 1: Preparazione dei lisati fagici. (A) Flusso di lavoro per l'avvio di un lisato fagico da uno stock fagico ad alto titolo. I lisati sono stati propagati, puliti, concentrati e le endotossine sono state rimosse. La contaminazione dell'1-ottanolo è stata rimossa con il vuoto di velocità. (B) Le endotossine sono state quantificate nei lisati fagici e veicoli utilizzando un kit di quantificazione delle endotossine cromogeniche. Le linee blu tratteggiate indicano i limiti superiore e inferiore per confutare l'inibizione del prodotto nel controllo dell'inibizione del prodotto (0,5 EU/mL ± 25%). Ogni punto rappresenta una delle due repliche tecniche. L'altezza della barra rappresenta la media tra le repliche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Generazione di topi monocolonizzati e monitoraggio dei livelli di fagi e batteri in pellet fecali. (A) Flusso di lavoro per la colonizzazione di topi privi di germi con una singola specie batterica e generazione di topi monocolonizzati F1 e F2. (B-E) Livelli di fago T4 ed E. coli rilevati in pellet fecali di topi C57BL/6 nati monocolonizzati con E. coli e inoculati con fago T4 a 6-8 settimane di età. Al giorno 0 (pre-colonizzazione) e nei giorni indicati dopo la colonizzazione, i livelli di fagi T4 sono stati misurati mediante placcatura spot e saggi di placca utilizzando il metodo dello strato singolo di agar. I livelli di E. coli sono stati misurati mediante placcatura spot su agar all'1,5% LB. (B, C) Cinetica dei livelli di (B) fago T4 e (C) E. coli in pellet fecali recuperati dopo inoculazione con 2 x 10⁶ pfu di lisato di fago o veicolo T4 (normalizzato per volume e livelli di endotossine). (D, E) (D) Livelli di fago T4 e (E) E. coli in pellet fecali recuperati dopo inoculazione con 2 x 10² ufu, 2 x 10⁴ pfu o 2 x 10⁶ pfu di fago T4. Le barre di errore rappresentano la media e l'errore standard della media (SEM). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Accuratezza della risoluzione dei problemi nei saggi della placca. (A) Titolo del lisato fagico T4 utilizzando colture notturne o sottocolture di E. coli per la preparazione di agar molle (agar allo 0,5%, LB). Le sottocolture sono state realizzate utilizzando una diluizione 1:50 di coltura notturna di E. coli in LB fresco. 5 mL di preparati di agar molle sono stati inoculati con 100 μL di E. coli e 20 μL di fago T4. CaCl₂ e MgSO₄ non sono stati aggiunti all'agar molle per questi test, ma possono essere aggiunti se lo si desidera. Tempi di sottocoltura di E. coli inferiori a 2,8 h hanno determinato un titolo fagico apparente inferiore. (B) Titolo di lisato fagico T4 utilizzando diverse densità di E. coli nella preparazione di agar molle. L'aggiunta di diversi volumi di E. coli da una coltura notturna (non sottocoltivata, come in A) nell'agar molle ha portato a diversi titoli fagici apparenti. Le barre di errore rappresentano l'incertezza calcolata del titolo fagico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Lo studio dei fagi nel microbioma presenta una sfida significativa rispetto alle loro controparti batteriche. In particolare, i fagi non contengono un marcatore filogenetico conservato comune a tutti i fagi affini alle subunità ribosomiali 16S e 18S che consentono la facilità di sequenziamento e identificazione delle specie procariotiche ed eucariotiche,^{rispettivamente.} Tuttavia, con i progressi negli approcci di sequenziamento di nuova generazione, tra cui l'aumento della lunghezza di lettura, della produttività e la diminuzione dei costi, arriva la rapida espansione dei database del genoma dei batteriofagi 42,43,44. Con molto lavoro di base nella scoperta dei fagi ben avviato, la ricerca sui fagi è ora più accessibile che mai. In quanto membri chiave del microbioma intestinale e gli organismi geneticamente più diversificati sulla Terra, i fagi rappresentano un punto di vista entusiasmante per una nuova ricerca che indaga la complessità del microbioma. I protocolli qui descritti si concentrano sullo studio delle specie fagiche conosciute nei topi colonizzati con i loro batteri bersaglio. Va notato che questi protocolli forniscono una linea guida per lo studio dei fagi in vivo e possono essere ampliati con la crescita del campo.

La ricerca sui batteriofagi per il trattamento terapeutico delle infezioni batteriche è in gran parte passata di moda con l'avvento degli antibiotici negli anni '40. Tuttavia, l'eccessiva prescrizione e l'uso improprio di antibiotici hanno accelerato l'emergere di agenti patogeni multiresistenti ai farmaci come una delle principali preoccupazioni per la salute pubblica³. I fagi rappresentano un'interessante potenziale alternativa agli antibiotici, grazie al loro alto grado di specificità dell'ospite³. È importante sottolineare che, poiché i fagi si insediano naturalmente come membri del microbioma intestinale umano, è necessario prima comprendere i ruoli che i fagi svolgono in questi ambienti complessi. Mentre molti studi hanno indagato la relazione tra un fago e i suoi batteri bersaglio in vitro, è importante considerare come queste relazioni potrebbero reggere all'interno del paesaggio del tratto gastrointestinale. Come negli studi esplorativi che indagano le componenti batteriche del microbiota, modelli murini semplificati come GF e topi monocolonizzati ci permettono di isolare gli effetti del fago sulle sue specie bersaglio e come questa relazione contribuisca alla risposta immunitaria. Questo è un passo importante verso la terapia fagica, poiché alcuni fagi potrebbero non fornire benefici quando vengono introdotti nell'intestino. Ad esempio, il fago Pf4 di Pseudomonas aeruginosa esacerba la malattia causata dal suo ospite, inibendo sia le risposte immunitarie antibatteriche che la migrazione dei cheratinociti, con conseguente compromissione della guarigione delle ferite^18,45. Le procedure qui descritte mirano a standardizzare le tecniche per lo studio dei fagi come membri del microbiota murino. Facendo eco a studi pionieristici che indagano l'impatto del microbiota sull'ospite metazoico, la ricerca continua sui fagi nel contesto del microbiota può rivelarsi entusiasmante e significativa nella più ampia comprensione del multibioma⁴⁶.

Limitazioni
I protocolli qui descritti sono stati ottimizzati per studiare la competizione tra il fago T4 e i suoi batteri bersaglio, E. coli, quando il fago T4 viene somministrato per via orale a topi monocolonizzati da E. coli. Come i batteri, le diverse specie di fagi si comportano in modo diverso l'una dall'altra, con tempi di replicazione, dimensioni di burst e gamme variabili di bersagli batterici⁴⁷. Pertanto, quando si studiano altre coppie fago-batteriche in modelli animali simili, si dovrebbe fare attenzione a ottimizzare questi protocolli in tutte le fasi. Ad esempio, i fagi con un tempo di replicazione più lungo e/o una dimensione di burst più piccola possono richiedere un'incubazione più lunga con il loro bersaglio batterico per la produzione di un lisato ad alto titolo. Allo stesso modo, potrebbe essere necessario prolungare i tempi di incubazione su piastra per i saggi della placca. Inoltre, i fagi con un breve tempo di replicazione e/o un'elevata dimensione dell'esplosione possono richiedere incubazioni su piastre più brevi, poiché l'incubazione notturna può causare una crescita eccessiva della placca. Se le condizioni di propagazione sono sconosciute per uno specifico fago di interesse, le basi per determinare le condizioni di crescita devono essere stabilite prima di iniziare il lavoro in vivo ⁴⁸.

I domini Ig-like che si trovano all'interno delle proteine del capside Hoc del fago T4 facilitano l'aderenza al muco intestinale¹¹. A seconda della capacità di legare il muco del fago di scelta, la cinetica dei livelli di fagi-batteri nei campioni fecali può differire dai risultati mostrati nella Figura 2B-E. Ad esempio, è stato dimostrato nei sistemi gut-on-a-chip che i fagi contenenti proteine Hoc intatte avevano una maggiore capacità di uccisione di E. coli rispetto al fago¹¹ carente di Hoc. Mentre si sospetta che i fagi T4 siano trattenuti attraverso il legame del muco in vivo 11,12,13, l'impatto della reinoculazione attraverso il comportamento coprofagico dei topi non può essere escluso. Questi effetti potrebbero essere ridotti utilizzando fondi di gabbie metalliche o cambiando frequentemente le gabbie. Dal momento che i domini Ig-like non sono stati identificati nei fagi⁴⁹ di ssDNA o RNA, sarà interessante distinguere le altre strategie utilizzate dai fagi per mantenere la residenza all'interno della mucosa intestinale.

Infine, questi studi esplorativi hanno esaminato le interazioni fago-batteri-ospite solo in omeostasi. Nei modelli animali di malattie umane, non è noto come i cambiamenti nell'integrità della barriera intestinale, come nell'IBD, possano influire su queste interazioni. Studi recenti hanno dimostrato che i fagi di Caudovirales hanno aumentato la ricchezza e la diversità nei pazienti con IBD ^7,8. Nei modelli murini, è stato dimostrato che il trattamento continuo con fagi ha esacerbato la colite sperimentale indotta da destrano solfato di sodio (DSS)⁸. Resta da determinare come le interazioni fago-batteri-ospite si svolgono in ambienti infiammatori e se l'integrità della barriera compromessa facilita l'infiammazione indotta dai fagi.

Risoluzione dei problemi e metodi alternativi

Modelli di topi
I modelli murini monocolonizzati consentono di interrogare una singola specie di batteri sulla fisiologia dell'ospite¹⁶. La ricerca che coinvolge topi monocolonizzati ha svolto un ruolo cruciale nel chiarire come il microbiota influenzi il sistema immunitario²². Come sistema modello, i topi monocolonizzati non ricapitolano la fisiologia delle loro controparti convenzionali del microbiota. Più simili ai topi GF, i topi monocolonizzati da E. coli hanno una ridotta produzione di muco (simile ai topi GF⁵⁰) e un sistema immunitario immaturo²³. Tuttavia, i topi monocolonizzati sono stati preziosi per svelare gli effetti specifici dei microbi delle singole specie sul tratto gastrointestinale e sullo sviluppo immunitario. Un esempio classico è la scoperta che i batteri filamentosi segmentati (SFB) sono potenti induttori delle cellule CD4⁺ T helper 17 nei topi²⁴. Con riferimento al muco, ci sono effetti microbo-specifici sulla trascrizione del gene del muco⁵¹e sullo spessore del muco⁵⁰. Anche se limitata, i topi monocolonizzati offrono l'opportunità di studiare l'impatto di una coppia fago-batterio sull'ospite mammifero in un modello controllato. È importante sottolineare che i fagi possono, e dovrebbero, essere studiati nel contesto di un microbiota complesso. Al momento in cui scriviamo, pochi studi hanno affrontato gli impatti della predazione fagica di specie batteriche commensali all'interno di un microbioma convenzionale. Si tratta di un'applicazione futura dei protocolli presentati in questo documento, che potrebbero essere adattati per facilitare questi studi.

Uso di comandi appropriati del veicolo
Controlli appropriati sono essenziali in qualsiasi esperimento. Qui, è stato definito un veicolo adatto per la somministrazione orale ai topi che controlla la pulizia e la purificazione a più fasi dei lisati fagici T4. Un requisito importante è che il controllo del veicolo contenga un livello di endotossine batteriche uguale a quello del lisato fagico, per controllare qualsiasi risposta immunitaria mediata da endotossine. Il cloroformio e l'1-ottanolo vengono aggiunti al lisato come parte del processo di purificazione e successivamente rimossi. Per controllare le potenziali risposte immunitarie che possono essere generate a livelli di tracce di queste sostanze chimiche, è possibile produrre un lisato batterico privo di fagi come controllo del veicolo. I lisati fagici e veicoli T4 contenevano una concentrazione molto bassa di endotossine batteriche, ben al di sotto dei livelli consentiti nell'acqua potabile²⁵ (Figura 1B). Possono essere utilizzati controlli alternativi che possono essere modificati per adattarsi alla domanda di ricerca prevista. Più semplicemente, è possibile utilizzare un tampone fagico contenente una quantità equivalente di endotossina, sebbene ciò non tenga conto dei processi di pulizia e purificazione in più fasi. Gogokhia et ^al.8hanno riportato l'uso di fagi inattivati dal calore come controllo per verificare se la proteina fagica senza DNA fosse sufficiente per suscitare una risposta immunitaria. Nelle nostre mani, il fago inattivato dal calore aveva livelli più bassi di endotossina rispetto al lisato fagico T4 (Figura 1B) e quindi non è stato utilizzato per controllare i livelli di endotossine in questo studio. Tuttavia, incoraggiamo la sperimentazione di entrambi i protocolli per determinare quale metodo è più adatto ai singoli scopi sperimentali. Se il veicolo e i lisati fagici T4 differiscono in modo significativo nella quantità di endotossina presente, il lisato contenente i livelli più bassi può essere integrato con endotossina purificata. L'1-ottanolo viene aggiunto ai lisati durante il processo di purificazione, ma inattiva il test del kit di quantificazione dell'endotossina cromogenica. È importante testare l'inibizione del prodotto da parte di sostanze potenzialmente interferenti nel campione per garantire che le misurazioni delle endotossine siano accurate. Se si sospetta l'inibizione del prodotto, è possibile che il campione non sia stato aspirato a velocità sufficientemente lunga. Se i problemi persistono, la dialisi può essere utilizzata per rimuovere il rimanente 1-ottanolo²⁵.

Via di somministrazione e dose
A causa della capacità di legare il muco del fago T4, i modelli murini sono stati inoculati in una singola dose orale di sonda. Lo scopo di questo era quello di monitorare la durata della convivenza tra fagi ed E. coli del tratto gastrointestinale; Tuttavia, sono stati riportati altri approcci allo studio dei fagi in modelli in vivo. Ad esempio, l'acqua potabile arricchita di fagi è stata utilizzata per fornire una fornitura continua di fagi ai topi ^8,20. Il vantaggio di questo metodo di somministrazione è che i fagi vengono continuamente reintegrati, anche in assenza di un ospite batterico, come dimostrato da Gogokhia et al.⁸. Questo disegno sperimentale ha permesso di valutare la risposta immunitaria ai fagi in assenza di batteri e ha fornito una stimolazione immunitaria continua nel corso dell'esperimento. Fisiologicamente, questo metodo non rappresenta un decorso naturale dell'infezione fagica o della colonizzazione fagica di un ambiente intestinale, ma fornisce importanti informazioni su come l'esposizione ripetuta ai fagi possa innescare il sistema immunitario. Ciò ha un significato nel contesto dello sviluppo della terapia fagica, poiché i cocktail fagici possono essere somministrati come corso di trattamento per trattare le infezioni batteriche intestinali, in modo simile ai regimi antibiotici. Nel contesto della coppia fago T4-E. coli, è stato determinato che la diminuzione della dose di fago T4 applicata per via orale a topi monocolonizzati non alterava i livelli fecali di fagi o batteri (Figura 2D, E). Pertanto, in questo caso la dose di inoculazione del fago T4 non è cruciale per il mantenimento della colonizzazione stabile del fago T4-E. coli nell'intestino dei topi bicolonizzati. Si noti che la dose più bassa somministrata è stata di 200 pfu/topo e la dose più alta è stata di 2 x 10⁶ pfu/topo (secondo Hsu et al.) ². Pertanto, i dati a sostegno della cinetica del fago-E. coli T4 al di fuori di questo intervallo non sono disponibili in questo studio.

Titoli fagici a piastre spot e intere
Per misurare i livelli di fagi T4 nelle feci e nei tessuti, i protocolli qui descritti si basano su tecniche di placcatura spot piuttosto che su saggi di placca intera, che possono contribuire alla variabilità dei livelli di fagi tra i topi (Figura 2B). Nelle tecniche a piastra intera, le placche vengono contate su un'area più ampia, consentendo una quantificazione più accurata. Tuttavia, un'appropriata diluizione di ciascun campione deve essere solitamente predeterminata mediante placcatura a punti. Poiché i campioni sono stati analizzati il giorno della raccolta del campione, la placcatura a punti è stata ritenuta il metodo più appropriato per un approccio ad alto rendimento. Pertanto, la risoluzione di questi dati è rappresentata in modo più accurato dall'ordine di grandezza del fago in ciascun campione. Per misurazioni precise dei fagi, ci sono considerazioni aggiuntive per ogni fago. Misurazioni più accurate possono essere ottenute mediante saggi su piastra intera o utilizzando intervalli di diluizione seriale più piccoli per ciascun campione. Se questi metodi portano ancora a conteggi variabili dei fagi o dei batteri bersaglio, sarebbe prudente valutare se le interazioni uniche tra il fago e i batteri potrebbero spiegare le differenze tra i singoli topi attraverso il sequenziamento metagenomico o altri metodi per valutare sperimentalmente la co-evoluzione e la resistenza. Secondo Bonilla et ^al.25, quando si prepara l'agar morbido per i saggi della placca, è importante essere coerenti con la quantità di ospite batterico aggiunto²⁵. Come mostrato nella Figura 3, anche variazioni relativamente piccole nei tempi di coltura dei batteri (Figura 3A) e nella densità (Figura 3B) possono influire sull'accuratezza dei test della placca. Questi risultati possono essere diversi per altre coppie fagi-batteri, e esperimenti simili sono raccomandati quando si inizia con nuovi organismi. Inoltre, per le nuove coppie fagico-batterio, dovrebbero essere eseguiti esperimenti esplorativi per determinare le caratteristiche di crescita di ciascuno. Ad esempio, le curve di crescita possono essere eseguite per determinare il ritardo, le fasi esponenziali e stazionarie e il tasso di crescita dei batteri. L'esperimento di crescita in un'unica fase può essere utilizzato per determinare il periodo di latenza (tempo alla lisi) e la dimensione del burst (numero di fagi rilasciati in seguito alla lisi batterica) dei fagi^52,53.

Misurazione alternativa dei fagi T4 mediante qPCR
La quantificazione dei fagi può essere eseguita con saggi di placca, come descritto sopra, o tramite reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). Questi due approcci hanno un'importante distinzione: i saggi a placca determinano il numero di fagi vitali in grado di infettare e uccidere i loro ospiti batterici, mentre la qPCR quantifica il materiale genetico specifico del fago (come proxy del numero di fagi presenti) ma non fornisce informazioni sulla vitalità e l'infettività del fago. Le qPCR sono state eseguite per confrontare la quantificazione delle copie del gene fagico con le placche formate nei saggi di placca utilizzando i primer descritti da Hsu et ^al.2 (Figura 4). Il DNA del fago T4 è stato estratto e amplificato dal contenuto cecale di topi bicolonizzati fagi T4/E. coli . Nella maggior parte dei topi, i test qPCR e i test a placca hanno rilevato livelli simili di fago T4 nel contenuto cecale (Figura 4A, B). Mentre una certa amplificazione è stata rilevata nel contenuto cieco inoculato con veicolo, le copie geniche calcolate/g erano al di sotto del limite di rilevazione (LOD) (Figura 4A). L'assenza di fagi quantificabili in questi campioni è stata confermata mediante elettroforesi su gel. I prodotti del gene fagico T4 (96 bp) sono stati prontamente visualizzati nel DNA isolato dal contenuto cieco di topi inoculati con T4, ma erano assenti dai controlli del veicolo (Figura 4C).

In questi test, copie del gene fagico T4 sono state rilevate nel contenuto cecale di un topo colonizzato da fagi T4 mediante qPCR (Figura 4A, freccia) nonostante l'incapacità di rilevare T4 nei saggi di placca dello stesso campione (Figura 4B, freccia). Questi risultati suggeriscono che le particelle virali che non formano placche possono insorgere in vivo, sia a causa della produzione di particelle virali difettose che della co-evoluzione di fagi e/o batteri. Le tecniche di placcatura batterica su agar duro possono essere utilizzate per determinare la suscettibilità dei batteri fecali al fago¹⁴. Suggeriamo che la rilevazione mediata dalla qPCR possa essere un'aggiunta preziosa ai flussi di lavoro dei fagi in vivo in quanto potrebbe essere più robusta per l'evoluzione dei fagi all'interno dell'ambiente intestinale, dato che si rivolge a sequenze geniche brevi e conservate. Approcci non distorti come la metagenomica sono preziosi per esaminare la co-evoluzione fago-batterica e le abbondanze relative, ma alla fine possono essere più costosi.

Figura 4: Rilevamento del fago T 4 mediante qPCR. (A,B) I carichi fagici T4 sono stati misurati tramite (A) qPCR assoluto o (B) test della placca nel contenuto cecale di topi C57BL/6 colonizzati da E. coli al giorno 29 dopo l'inoculazione con fago o veicolo T4. La freccia indica i risultati di un singolo topo che aveva copie del genoma T4 rilevabili ma non virus plaquable nel contenuto cecale. (C) Elettroforesi su gel di prodotti PCR che mostrano la presenza della banda 96 bp in campioni ciechi inoculati con fagi T4, ma non in campioni inoculati con veicoli. È stata utilizzata una scala di DNA da 100 bp. LOD = limite di rilevamento. Le barre di errore rappresentano la media e il SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Applicazioni
I batteriofagi rappresentano oltre il 90% delle particelle simili a virus presenti nel microbioma⁴⁴; Tuttavia, l'impatto dei fagi sul microbioma intestinale è poco compreso. Gli studi iniziali che hanno indagato la componente batterica del microbioma lo hanno fatto isolando particolari specie e studiando il loro impatto sulla maturazione immunitaria^22,24. Simili interrogatori del fageoma presentano un compito arduo ma necessario, e un requisito per ottenere una comprensione completa del multibioma⁴⁶. Mentre l'attenzione dello sviluppo della terapia fagica tende ad essere orientata verso la cura delle infezioni batteriche settiche, è importante capire come l'aggiunta di un cocktail fagico al tratto gastrointestinale possa alterare l'ecosistema intestinale. Inoltre, la sicurezza dei cocktail fagici terapeutici dovrebbe essere valutata generando un profilo immunitario. I fagi sono stati studiati come potenziali trattamenti per le infezioni batteriche intestinali come C. difficile⁵ e Salmonella enterica sierotipo Typhimurium⁵⁴. Studi recenti hanno anche dimostrato che le FFT sono ugualmente o più efficaci nel trattamento dell'enterocolite necrotizzante nei suini pretermine⁹, suggerendo che la componente virale dei trapianti di microbiota fecale (FMT) può svolgere un ruolo attivo nella riduzione della malattia. I continui studi che indagano il ruolo dei fagi nel microbioma sono giustificati per promuovere lo sviluppo di terapie fagiche contro i patogeni intestinali, ma anche per informare meglio gli FMT come trattamento per le malattie. Standardizzando i metodi per lo studio dei fagi in vivo, la trasparenza e la riproducibilità nella ricerca sui fagi saranno aumentate, insieme a una guida per coloro che estendono il loro lavoro ai modelli murini.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1-ottanolo (99%)	Thermofisher	CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Unità filtranti sottovuoto monouso sterili	Millipore Sigma
Agarosio (Basso EEO/Multiuso/Grado di Biologia Molecolare)	Fisher BioReagents	BP160-500
Dispositivo di filtraggio centrifugo Amicon® 100kDa Ultra-15, Ultracel-100	Millipore Sigma	UFC910008
BD Microtainer® Tubi, SST	BD Medical	365967
Gabbie ermetiche per bioesclusione (gabbie ISO)	Techiplast	1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Termociclatore con modulo di reazione rapida a 96 pozzetti	BioRad	1851196
cloruro di calcio diidrato (cristalli bianchi in polvere)	Fisher BioReagents	BP510-500
Tappi Serrature per provetta da 1,5 ml 100/conf	Andwin Scientific
Cloroformio (etanolo come conservante/certificato ACS)	Perline	C298-500
(4,5 mm)	Crosman Corporation	0767
DNeasy Blood & Kit Tessuti (50)	Thermo Scientific	69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Soluzione di sale disodico di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), per biologia molecolare, 0,5 M in H2O	Sigma Aldrich	E7889
Fisher BioReagents&commercio; Agar, polvere / fiocchi, Fisher BioReagenti&commercio;	Fisher Bioreagents	BP1423-500
Fisher BioReagents™ Terreni di microbiologia: brodo LB (polvere) - Lennox	Fisher Bioreagents	BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0241
Miscela qPCR FastMix® verde, 1250 rxns	QuantaBio	95072-012
Filtri HEPA per coperchi isocage, FILTRI H14 AUTOCLAVABILI PER LINEA ISO IRRADIATI	Techiplast	UISOHEPAXTBOX-300
Solfato di magnesio eptaidrato	Fisher BioReagents	BP213-1
MaxQ 6000 Agitatore incubato	Thermo Scientific	8354-30-0009
Terreni di microbiologia: brodo LB (polvere) - Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500
Provette per microcentrifuga con tappo a scatto di bloccaggio, 2 ml	Fisher	14-666-315
Pellicola sigillante Parafilm	Bemis	PM-996
Scorte di fagi	Carolina Biological Supply	n/a
PicoLab® Dieta del topo 20 EXT	LabDiet	5R58
Pierce™ Kit Quant Endotossina Cromogenica	Thermo Scientific
RNasi A (17.500 U)	Qiagen	19101
Set di DNasi senza RNasi	Qiagen	79254
Bicarbonato di sodio (polvere bianca fine)	Fisher Chemical	BP328-500
Cloruro di sodio (cristallino/certificato ACS)	Fisher Chemical	S271
Sonicator (sonda modello CL-18; fonte di alimentazione modello FB50)	Fisher scentific	n/a
Isolatore sterile a film flessibile	Classe Biologicamente Pulito	n/a
SYBR&commercio; Disinfettante per gel DNA sicuro	Invitrogen	S33102
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
Primer fagico T4, in avanti (CCACACACATAGCGCGAGTATAA)	IDT	n/a
Primer fagico T4, in avanti (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)	IDT	n/a
TissueLyser II	Qiagen	85300
Tris-HCl, soluzione 1M, pH 8.0, grado di biologia molecolare, termo scientifico ultrapuro	.
Acqua, (senza DNASI, RNASI)	Fisher BioReagents	BP2484100