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Articolo metodologico

Ottimizzazione della coltura di cellule epiteliali primarie del cristallino di topo: una guida completa alla tripsinizzazione

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⸱

DOI:

10.3791/65912

⸱

21 giugno 2024

 ,  , 
1Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center, 2North Texas Eye Research Institute, University of North Texas Health Science Center

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto delinea un protocollo video dettagliato per la coltura di cellule epiteliali primarie del cristallino (LEC), con l'obiettivo di migliorare la riproducibilità e aiutare la ricerca sulla cataratta e sull'opacizzazione della capsula posteriore (PCO). Offre istruzioni dettagliate sulla dissezione delle lenti, l'isolamento e la convalida dei LEC, fungendo da guida preziosa, soprattutto per i nuovi arrivati nel settore.

Abstract

Le cellule epiteliali del cristallino (LEC) svolgono molteplici ruoli importanti nel mantenimento dell'omeostasi e della normale funzione del cristallino. I LEC determinano la crescita, lo sviluppo, le dimensioni e la trasparenza delle lenti. Al contrario, i LEC disfunzionali possono portare alla formazione della cataratta e all'opacizzazione della capsula posteriore (PCO). Di conseguenza, la creazione di un solido sistema di coltura LEC primario è importante per i ricercatori impegnati nello sviluppo di lenti, nella biochimica, nelle terapie della cataratta e nella prevenzione della PCO. Tuttavia, la coltivazione di LEC primari ha presentato a lungo sfide a causa della loro disponibilità limitata, del lento tasso di proliferazione e della natura delicata.

Questo studio affronta questi ostacoli presentando un protocollo completo per la coltura LEC primaria. Il protocollo comprende fasi essenziali come la formulazione di un terreno di coltura ottimizzato, l'isolamento preciso delle capsule di lenti, le tecniche di tripsinizzazione, le procedure di sottocoltura, i protocolli di raccolta e le linee guida per lo stoccaggio e la spedizione. Durante tutto il processo di coltura, la morfologia cellulare è stata monitorata utilizzando la microscopia a contrasto di fase.

Per confermare l'autenticità dei LEC in coltura, sono stati condotti saggi di immunofluorescenza per rilevare la presenza e la distribuzione subcellulare di proteine lente critiche, vale a dire αA- e γ-cristalline. Questo protocollo dettagliato fornisce ai ricercatori una risorsa preziosa per coltivare e caratterizzare i LEC primari, consentendo progressi nella nostra comprensione della biologia del cristallino e nello sviluppo di strategie terapeutiche per i disturbi correlati al cristallino.

Introduzione

Il cristallino dell'occhio svolge un ruolo cruciale nella visione focalizzando la luce in entrata sulla retina. È costituito da una struttura trasparente e avascolare composta da cellule specializzate, tra le quali le cellule epiteliali del cristallino (LEC) sono protagoniste. I LEC si trovano sulla superficie anteriore del cristallino e sono responsabili del mantenimento della sua trasparenza, della regolazione dell'equilibrio idrico e della partecipazione alla crescita e allo sviluppo del cristallino 1,2. I LEC sono un tipo unico di cellule situate nella parte anteriore del cristallino, che svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento della chiarezza e della funzione del cristallino producendo continuamente fibre del cristallino per tutta la vita.

La cataratta è caratterizzata dal progressivo offuscamento del cristallino, con conseguente distorsione e dispersione della luce, che porta a una visione compromessa 3,4. I meccanismi precisi alla base della formazione della cataratta sono complessi e multifattoriali, coinvolgendo vari processi cellulari e molecolari come la radiazione UV, il danno ossidativo e la glicazione 5,6. È stato riscontrato che i LEC contribuiscono in modo significativo allo sviluppo della cataratta, rendendoli un obiettivo vitale della ricerca 1,2,7,8,9.

Inoltre, uno dei problemi più urgenti in oftalmologia oggi è l'incidenza relativamente elevata di opacizzazione della capsula posteriore (PCO), nota anche come cataratta secondaria. La PCO rimane la complicanza più comune dopo l'intervento di cataratta, colpendo fino al 20-40% dei pazienti adulti e il 100% dei bambini entro 5 anni dall'intervento chirurgico10. La PCO è causata principalmente dai LEC residui che rimangono nel sacco capsulare dopo l'estrazione della cataratta. Queste cellule subiscono una trasformazione fisiopatologica multiforme che coinvolge non solo la transizione da epiteliale a mesenchimale (EMT), ma anche la differenziazione dei LEC in fibre del cristallino, risultando in una popolazione cellulare che è una miscela di LEC, fibre e miofibroblasti 11,12,13. Le cellule trasformate proliferano e migrano attraverso la capsula posteriore del cristallino, portando a una compromissione della vista. La comprensione del comportamento e dei meccanismi di controllo dei LEC nei modelli di coltura può fornire preziose informazioni sulla prevenzione e la gestione della PCO. Pertanto, questo protocollo di coltura dei LEC rappresenta uno strumento vitale per i ricercatori oftalmici che mirano a studiare, comprendere e, infine, combattere questa complicanza postoperatoria prevalente.

Per svelare le complessità della biologia LEC e il suo ruolo nella formazione della cataratta e della PCO, è essenziale stabilire sistemi di coltura cellulare primaria in vitro robusti e riproducibili. La coltura primaria di LEC fornisce ai ricercatori un ambiente controllato per studiare le funzioni, la segnalazione e le caratteristiche molecolari dei LEC. Inoltre, consente di studiare i processi cellulari e gli effetti di diverse condizioni sperimentali, fornendo preziose informazioni sulla fisiologia e sulla patologia del cristallino.

Ricerche precedenti hanno arricchito la nostra comprensione delle tecniche di coltura LEC 14,15,16,17,18,19,20. Sebbene questi studi abbiano impiegato varie metodologie e prodotto risultati significativi sul comportamento e sulle caratteristiche dei LEC, un protocollo di registrazione video completo e accessibile per la coltura dei LEC è assente nella letteratura attuale. Questa limitazione può ostacolare la capacità dei ricercatori alle prime armi di riprodurre accuratamente le tecniche e può portare a incongruenze e variazioni nei risultati sperimentali. Fornendo un protocollo di registrazione video, questo documento di ricerca mira a colmare questa lacuna e a fornire una risorsa standardizzata in grado di migliorare la riproducibilità e facilitare il trasferimento di conoscenze nel campo della cultura LEC.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dell'Associazione per la ricerca sulla visione e l'oftalmologia per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e sulla visione. L'approvazione procedurale è stata concessa dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Texas settentrionale Health Science Center (numero di protocollo: IACUC-2022-0008). In questi studi sono stati utilizzati topi giovani C57BL/6J, in genere di età inferiore alle 2 settimane.

1. Preparazione del terreno di coltura e dissezione delle lenti

  1. Preparare il terreno di coltura aggiungendo 50 mL di siero fetale bovino (FBS) e 0,1 mL di gentamicina 50 mg/mL a 450 mL di DMEM.
  2. Sopprimere umanamente i topi C57BL/6J di età inferiore a 2 settimane.
    NOTA: Abbiamo praticato l'eutanasia utilizzando il metodo di inalazione di CO2 . Una portata ottimale per i sistemi di eutanasia di CO2 dovrebbe spostare dal 30% al 70% del volume della camera o della gabbia/min.
  3. Rimuovere delicatamente le palpebre con le forbici chirurgiche e applicare una leggera pressione con una pinzetta curva sui lati opposti dell'orbita, facendo sporgere l'occhio verso l'esterno. Praticare un'accurata incisione sulla cornea utilizzando il coltello per cataratta ed estrarre con cautela la lente utilizzando una pinzetta curva, assicurandosi di non danneggiare la lente o la sua capsula.
    NOTA: Prestare attenzione durante l'esecuzione di questi passaggi per mantenere l'integrità della capsula dell'obiettivo. A causa della natura delicata della lente, è importante utilizzare strumenti di dissezione con punte curve e smussate per ridurre al minimo il rischio di danni alla lente.
  4. Utilizzare pinzette curve con punte smussate per trasferire le lenti in un piatto di coltura di tessuti in plastica da 60 mm riempito con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco preriscaldata e sterile contenente 10 μg/mL di gentamicina.
  5. Sciacquare delicatamente le lenti con una soluzione DPBS contenente 10 μg/mL di gentamicina per rimuovere eventuali detriti o contaminanti, preparare le lenti per un'ulteriore lavorazione e mantenere un ambiente di coltura sterile.
  6. Per ottenere un numero adeguato di LEC, raggruppare quattro lenti per una piastra di coltura a 24 pozzetti e sei lenti per una piastra di coltura a 6 pozzetti.

2. Isolamento dei LEC

  1. Dopo aver completato il processo di risciacquo, posizionare l'obiettivo su un pezzo di carta da filtro, lasciandolo asciugare.
  2. Una volta che la lente è sufficientemente asciutta, trasferirla con cura sul coperchio di una capsula di Petri in preparazione per la rimozione della capsula della lente.
  3. Ruotare la lente verso l'alto, assicurandosi che il segmento anteriore sia rivolto verso l'alto. Mentre usi le pinzette per tenere la capsula anteriore, impiega la pinza per capsuloressi nella mano dominante per creare una piccola lacerazione nella capsula. Tirare delicatamente i due strumenti in direzioni opposte per rimuovere la capsula e metterla in DPBS fino al completamento di tutte le dissezioni della lente.
    NOTA: Per evitare discrepanze, i ricercatori devono sezionare prontamente ciascuna capsula epiteliale del cristallino e conservarla temporaneamente in DPBS. Solo dopo aver completato tutte le dissezioni, le capsule vengono trasferite collettivamente alla tripsina mantenuta a 37 °C, garantendo un'esposizione sincronizzata e uniforme.
  4. Trasferire con cautela la capsula dell'obiettivo su una piastra a 6 pozzetti. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina allo 0,05% in ciascun pozzetto per avviare il processo di digestione enzimatica.
  5. Agitare delicatamente la soluzione di tripsina per garantire una permeazione uniforme. Mettere la piastra in un incubatore per colture cellulari e lasciare digerire la capsula per 8-10 minuti a 37 °C.
    NOTA: Questo passaggio facilita la disgregazione del tessuto della capsula del cristallino e il successivo rilascio delle singole cellule epiteliali.
  6. Dopo l'incubazione, tritare con cura la capsula del cristallino digerita usando le forbici da dissezione per abbattere eventuali grumi di tessuto rimanenti e promuovere la separazione cellulare.
    NOTA: L'accuratezza nella triturazione dei tessuti è enfatizzata per garantire un efficiente rilascio cellulare dalle capsule di lenti digerite.
  7. Aggiungere 0,5 mL del terreno di coltura contenente il 10% di FBS per estinguere la tripsina. Trasferire i campioni di tessuto in una provetta di centrifugazione e centrifugare a 1.000 × g per 5 minuti.
  8. Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Utilizzare 1 mL di terreno di coltura per risospendere le cellule e seminare le cellule in una piastra a 24 pozzetti.
  9. Cambiare il terreno di coltura ogni 2-3 giorni.

3. Sottocultura LEC

  1. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza, rimuovere il terreno dalla piastra di coltura. Procedere al lavaggio delle cellule 2 volte con 1 mL di DPBS.
  2. Aggiungere 200 μL di soluzione di tripsina-EDTA e mettere le cellule nell'incubatore per 5 minuti.
  3. Dopo l'incubazione, rimuovere le cellule dall'incubatrice e ispezionarle al microscopio per confermare che si siano staccate dalla piastra di coltura e abbiano iniziato a galleggiare.
  4. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura e pipettare delicatamente le cellule 3-5 volte per staccare tutte le cellule.
  5. Trasferire le cellule in provette da centrifuga e centrifugare a 1.000 × g per 5 minuti.
  6. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere le cellule nel terreno di coltura completo.
  7. Se necessario, contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
  8. Suddividere la sospensione cellulare in un rapporto 1:2 o 1:3 a scopo di subcoltura.
  9. Quando la cultura diventa di nuovo confluente, ripetere le procedure sopra descritte.
    NOTA: I LEC prosperano in condizioni di coltura ad alta densità. Evitare di diluire eccessivamente le cellule, in quanto ciò potrebbe ostacolarne la crescita.

4. Stoccaggio e spedizione

NOTA: Il numero di celle ideale per la conservazione è ~1 × 106.

  1. Lavare accuratamente le celle 3 volte con 1 mL di DPBS. Dopo il lavaggio, aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA e mettere le cellule nell'incubatore per 5 minuti.
  2. Aggiungere 2 mL di terreno di coltura completo e trasferire la sospensione cellulare nella provetta da centrifuga e centrifugare a 1.000 × g per 5 minuti.
  3. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un terreno di congelamento composto per il 90% da FBS e per il 10% da DMSO, con l'obiettivo di ottenere una densità cellulare di 1 × 106 cellule/mL. Trasferire la sospensione cellulare nel crioviale.
  4. Spostare immediatamente le celle in un ambiente a -20 °C per 1 ora, seguito da -80 °C durante la notte, prima della conservazione permanente in azoto liquido.
    NOTA: Se l'azoto liquido non è disponibile, le celle possono essere conservate a -80 °C dopo un'ora iniziale a -20 °C.
  5. Se è necessaria una spedizione, spedire le cellule nel crioviale in un pacco con ghiaccio secco per la consegna durante la notte.
  6. Al ricevimento delle cellule, garantire un rapido recupero e posizionare le cellule nella sottocoltura. Se la coltura immediata non è fattibile, trasferire le cellule in azoto liquido per una conservazione prolungata.
    NOTA: Se le cellule devono essere spedite, assicurarsi che i campioni siano profondamente sepolti nel ghiaccio secco per evitare potenziali danni dovuti a fluttuazioni di temperatura.

5. Convalida LEC

  1. Placcare i LEC in piastre di coltura da 35 mm con bicchieri di copertura e coltivarli per circa 48 ore.
  2. Lavare le celle 2 volte con PBS e fissare le celle con metanolo freddo per 10 minuti a -20 °C.
  3. Lavare le cellule fisse per 3 x 5 minuti con PBS e incubare le cellule fisse con tampone bloccante per 1 ora a temperatura ambiente per evitare legami non specifici.
  4. Dopo il blocco, incubare le cellule per una notte a 4 °C con gli anticorpi primari (αA-cristallina, γ-cristallina e anticorpi PROX1) diluiti singolarmente in un rapporto 1:50 in tampone diluente.
  5. Lavare le cellule per 3 x 5 minuti con PBS e incubare le cellule con l'anticorpo secondario diluito 1:100 in tampone diluente per 1 ora.
  6. Lavare le cellule per 3 x 5 minuti con PBS e colorare le cellule con 5 μg/mL di Hoechst 33342 in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente per visualizzare i nuclei.
  7. Lavare le cellule per 2 x 5 minuti con PBS per rimuovere la soluzione colorante in eccesso e acquisire immagini fluorescenti delle cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza utilizzando il canale DAPI per i nuclei e il canale FITC per αA-, γ-cristalline e PROX1.

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Risultati

Come mostrato nella Figura 2, seguendo questo protocollo, i LEC primari dei topi C57BL/6J hanno aderito alle piastre entro un periodo di 4 ore. In particolare, c'erano resti visibili di altri tessuti come sezioni della capsula posteriore e cellule della fibra del cristallino. Tuttavia, questi elementi non intenzionali non si attaccavano al piatto e potevano, quindi, essere rimossi cambiando il terreno di coltura. Successivamente, tra il terzo e il quinto giorno, i LEC hanno iniziato la loro ...

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Discussione

Il protocollo presentato in questo documento fornisce una guida completa e dettagliata per il successo dell'isolamento, della cultura e della sottocultura dei LEC primari, completa di documentazione video di accompagnamento. La guida visiva dettagliata, insieme alle istruzioni scritte, migliora la chiarezza e l'accessibilità del protocollo, promuovendone l'uso e la riproducibilità tra i ricercatori del settore. L'obiettivo finale è quello di contribuire all'espansione delle conoscenze che circondano il ruolo dei LEC nell...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da NEI R21EY033941 (a Hongli Wu); Dipartimento della Difesa W81XWH2010896 (a Hongli Wu); R15GM123463-02 (a Kayla Green e Hongli Wu)

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,05% Tripsina-EDTAThermo Fisher25300054Per la dissociazione LEC
Alexa Fluor 488 Anticorpo secondarioJackson ImmunoResearch#715-545-150Per la convalida cellulare
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-605-003Per la convalida cellulare
Tampone di diluizione degli anticorpiLicor#927-60001Per la convalida cellulare
Coltello di sicurezza Beaver-VisitecInternational#3782235Per la dissezione
delle lentiTampone di bloccoLicor#927-60001Per la convalida cellulare
Pinze per capsuloressiTitan Medical InstrumentsTMF-124Per l'isolamento della capsula della lente
DMEMSigma AldrichD6429Per il terreno di coltura LEC
DMSOSigma Aldrich#D2650Per la produzione di terreno di congelamento 
salina tamponata con fosfato di Dulbecco Thermo Fisher#J67802Per la dissezione delle lenti,
Pinzette DumontRoboz Strumento chirurgicoRS-4976Per l'isolamento della capsula delle lenti,
EpiCGS-a (opzionale)ScienCell4182Per i terreni di coltura delle LEC,
FBS,Sigma, Aldrich,F2442Per i terreni di coltura delle LEC:
Gentamicina (50  mg/mL)Sigma-AldrichG1397Per terreno di coltura LEC
Soluzione Hoechst 33342Thermo Fisher#62249Per la convalida cellulare
Forbici per micro-dissezioneRoboz Surgical Instrument RS-5983Per la dissezione delle lenti
Pinzette per micro-dissezioneStrumento chirurgico Roboz RS5137 Per la dissezione delle lenti
Anticorpo PROX1Thermo Fisher11067-2-APPer la convalida cellulare
Forbici a molla per micro-dissezione VannasStrumento chirurgico RobozRS-5608Per l'isolamento della capsula del lente
α Anticorpo A-crystallinaSanta Cruzsc-28306Per la convalida cellulare 
Anticorpo γ-cristallinaSanta Cruzsc-365256Per la validazione cellulare
#Soluzione ,

Riferimenti

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