Ottimizzazione della coltura di cellule epiteliali primarie del cristallino di topo: una guida completa alla tripsinizzazione

Sommario

Questo manoscritto delinea un protocollo video dettagliato per la coltura di cellule epiteliali primarie del cristallino (LEC), con l'obiettivo di migliorare la riproducibilità e aiutare la ricerca sulla cataratta e sull'opacizzazione della capsula posteriore (PCO). Offre istruzioni dettagliate sulla dissezione delle lenti, l'isolamento e la convalida dei LEC, fungendo da guida preziosa, soprattutto per i nuovi arrivati nel settore.

Abstract

Le cellule epiteliali del cristallino (LEC) svolgono molteplici ruoli importanti nel mantenimento dell'omeostasi e della normale funzione del cristallino. I LEC determinano la crescita, lo sviluppo, le dimensioni e la trasparenza delle lenti. Al contrario, i LEC disfunzionali possono portare alla formazione della cataratta e all'opacizzazione della capsula posteriore (PCO). Di conseguenza, la creazione di un solido sistema di coltura LEC primario è importante per i ricercatori impegnati nello sviluppo di lenti, nella biochimica, nelle terapie della cataratta e nella prevenzione della PCO. Tuttavia, la coltivazione di LEC primari ha presentato a lungo sfide a causa della loro disponibilità limitata, del lento tasso di proliferazione e della natura delicata.

Questo studio affronta questi ostacoli presentando un protocollo completo per la coltura LEC primaria. Il protocollo comprende fasi essenziali come la formulazione di un terreno di coltura ottimizzato, l'isolamento preciso delle capsule di lenti, le tecniche di tripsinizzazione, le procedure di sottocoltura, i protocolli di raccolta e le linee guida per lo stoccaggio e la spedizione. Durante tutto il processo di coltura, la morfologia cellulare è stata monitorata utilizzando la microscopia a contrasto di fase.

Per confermare l'autenticità dei LEC in coltura, sono stati condotti saggi di immunofluorescenza per rilevare la presenza e la distribuzione subcellulare di proteine lente critiche, vale a dire αA- e γ-cristalline. Questo protocollo dettagliato fornisce ai ricercatori una risorsa preziosa per coltivare e caratterizzare i LEC primari, consentendo progressi nella nostra comprensione della biologia del cristallino e nello sviluppo di strategie terapeutiche per i disturbi correlati al cristallino.

Introduzione

Il cristallino dell'occhio svolge un ruolo cruciale nella visione focalizzando la luce in entrata sulla retina. È costituito da una struttura trasparente e avascolare composta da cellule specializzate, tra le quali le cellule epiteliali del cristallino (LEC) sono protagoniste. I LEC si trovano sulla superficie anteriore del cristallino e sono responsabili del mantenimento della sua trasparenza, della regolazione dell'equilibrio idrico e della partecipazione alla crescita e allo sviluppo del cristallino ^1,2. I LEC sono un tipo unico di cellule situate nella parte anteriore del cristallino, che svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento della chiarezza e della funzione del cristallino producendo continuamente fibre del cristallino per tutta la vita.

La cataratta è caratterizzata dal progressivo offuscamento del cristallino, con conseguente distorsione e dispersione della luce, che porta a una visione compromessa ^3,4. I meccanismi precisi alla base della formazione della cataratta sono complessi e multifattoriali, coinvolgendo vari processi cellulari e molecolari come la radiazione UV, il danno ossidativo e la glicazione ^5,6. È stato riscontrato che i LEC contribuiscono in modo significativo allo sviluppo della cataratta, rendendoli un obiettivo vitale della ricerca 1,2,7,8,9.

Inoltre, uno dei problemi più urgenti in oftalmologia oggi è l'incidenza relativamente elevata di opacizzazione della capsula posteriore (PCO), nota anche come cataratta secondaria. La PCO rimane la complicanza più comune dopo l'intervento di cataratta, colpendo fino al 20-40% dei pazienti adulti e il 100% dei bambini entro 5 anni dall'intervento chirurgico¹⁰. La PCO è causata principalmente dai LEC residui che rimangono nel sacco capsulare dopo l'estrazione della cataratta. Queste cellule subiscono una trasformazione fisiopatologica multiforme che coinvolge non solo la transizione da epiteliale a mesenchimale (EMT), ma anche la differenziazione dei LEC in fibre del cristallino, risultando in una popolazione cellulare che è una miscela di LEC, fibre e miofibroblasti 11,12,13. Le cellule trasformate proliferano e migrano attraverso la capsula posteriore del cristallino, portando a una compromissione della vista. La comprensione del comportamento e dei meccanismi di controllo dei LEC nei modelli di coltura può fornire preziose informazioni sulla prevenzione e la gestione della PCO. Pertanto, questo protocollo di coltura dei LEC rappresenta uno strumento vitale per i ricercatori oftalmici che mirano a studiare, comprendere e, infine, combattere questa complicanza postoperatoria prevalente.

Per svelare le complessità della biologia LEC e il suo ruolo nella formazione della cataratta e della PCO, è essenziale stabilire sistemi di coltura cellulare primaria in vitro robusti e riproducibili. La coltura primaria di LEC fornisce ai ricercatori un ambiente controllato per studiare le funzioni, la segnalazione e le caratteristiche molecolari dei LEC. Inoltre, consente di studiare i processi cellulari e gli effetti di diverse condizioni sperimentali, fornendo preziose informazioni sulla fisiologia e sulla patologia del cristallino.

Ricerche precedenti hanno arricchito la nostra comprensione delle tecniche di coltura LEC 14,15,16,17,18,19,20. Sebbene questi studi abbiano impiegato varie metodologie e prodotto risultati significativi sul comportamento e sulle caratteristiche dei LEC, un protocollo di registrazione video completo e accessibile per la coltura dei LEC è assente nella letteratura attuale. Questa limitazione può ostacolare la capacità dei ricercatori alle prime armi di riprodurre accuratamente le tecniche e può portare a incongruenze e variazioni nei risultati sperimentali. Fornendo un protocollo di registrazione video, questo documento di ricerca mira a colmare questa lacuna e a fornire una risorsa standardizzata in grado di migliorare la riproducibilità e facilitare il trasferimento di conoscenze nel campo della cultura LEC.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dell'Associazione per la ricerca sulla visione e l'oftalmologia per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e sulla visione. L'approvazione procedurale è stata concessa dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Texas settentrionale Health Science Center (numero di protocollo: IACUC-2022-0008). In questi studi sono stati utilizzati topi giovani C57BL/6J, in genere di età inferiore alle 2 settimane.

1. Preparazione del terreno di coltura e dissezione delle lenti

1. Preparare il terreno di coltura aggiungendo 50 mL di siero fetale bovino (FBS) e 0,1 mL di gentamicina 50 mg/mL a 450 mL di DMEM.
2. Sopprimere umanamente i topi C57BL/6J di età inferiore a 2 settimane.
   NOTA: Abbiamo praticato l'eutanasia utilizzando il metodo di inalazione di CO₂ . Una portata ottimale per i sistemi di eutanasia di CO₂ dovrebbe spostare dal 30% al 70% del volume della camera o della gabbia/min.
3. Rimuovere delicatamente le palpebre con le forbici chirurgiche e applicare una leggera pressione con una pinzetta curva sui lati opposti dell'orbita, facendo sporgere l'occhio verso l'esterno. Praticare un'accurata incisione sulla cornea utilizzando il coltello per cataratta ed estrarre con cautela la lente utilizzando una pinzetta curva, assicurandosi di non danneggiare la lente o la sua capsula.
   NOTA: Prestare attenzione durante l'esecuzione di questi passaggi per mantenere l'integrità della capsula dell'obiettivo. A causa della natura delicata della lente, è importante utilizzare strumenti di dissezione con punte curve e smussate per ridurre al minimo il rischio di danni alla lente.
4. Utilizzare pinzette curve con punte smussate per trasferire le lenti in un piatto di coltura di tessuti in plastica da 60 mm riempito con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco preriscaldata e sterile contenente 10 μg/mL di gentamicina.
5. Sciacquare delicatamente le lenti con una soluzione DPBS contenente 10 μg/mL di gentamicina per rimuovere eventuali detriti o contaminanti, preparare le lenti per un'ulteriore lavorazione e mantenere un ambiente di coltura sterile.
6. Per ottenere un numero adeguato di LEC, raggruppare quattro lenti per una piastra di coltura a 24 pozzetti e sei lenti per una piastra di coltura a 6 pozzetti.

2. Isolamento dei LEC

1. Dopo aver completato il processo di risciacquo, posizionare l'obiettivo su un pezzo di carta da filtro, lasciandolo asciugare.
2. Una volta che la lente è sufficientemente asciutta, trasferirla con cura sul coperchio di una capsula di Petri in preparazione per la rimozione della capsula della lente.
3. Ruotare la lente verso l'alto, assicurandosi che il segmento anteriore sia rivolto verso l'alto. Mentre usi le pinzette per tenere la capsula anteriore, impiega la pinza per capsuloressi nella mano dominante per creare una piccola lacerazione nella capsula. Tirare delicatamente i due strumenti in direzioni opposte per rimuovere la capsula e metterla in DPBS fino al completamento di tutte le dissezioni della lente.
   NOTA: Per evitare discrepanze, i ricercatori devono sezionare prontamente ciascuna capsula epiteliale del cristallino e conservarla temporaneamente in DPBS. Solo dopo aver completato tutte le dissezioni, le capsule vengono trasferite collettivamente alla tripsina mantenuta a 37 °C, garantendo un'esposizione sincronizzata e uniforme.
4. Trasferire con cautela la capsula dell'obiettivo su una piastra a 6 pozzetti. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina allo 0,05% in ciascun pozzetto per avviare il processo di digestione enzimatica.
5. Agitare delicatamente la soluzione di tripsina per garantire una permeazione uniforme. Mettere la piastra in un incubatore per colture cellulari e lasciare digerire la capsula per 8-10 minuti a 37 °C.
   NOTA: Questo passaggio facilita la disgregazione del tessuto della capsula del cristallino e il successivo rilascio delle singole cellule epiteliali.
6. Dopo l'incubazione, tritare con cura la capsula del cristallino digerita usando le forbici da dissezione per abbattere eventuali grumi di tessuto rimanenti e promuovere la separazione cellulare.
   NOTA: L'accuratezza nella triturazione dei tessuti è enfatizzata per garantire un efficiente rilascio cellulare dalle capsule di lenti digerite.
7. Aggiungere 0,5 mL del terreno di coltura contenente il 10% di FBS per estinguere la tripsina. Trasferire i campioni di tessuto in una provetta di centrifugazione e centrifugare a 1.000 × g per 5 minuti.
8. Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Utilizzare 1 mL di terreno di coltura per risospendere le cellule e seminare le cellule in una piastra a 24 pozzetti.
9. Cambiare il terreno di coltura ogni 2-3 giorni.

3. Sottocultura LEC

1. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza, rimuovere il terreno dalla piastra di coltura. Procedere al lavaggio delle cellule 2 volte con 1 mL di DPBS.
2. Aggiungere 200 μL di soluzione di tripsina-EDTA e mettere le cellule nell'incubatore per 5 minuti.
3. Dopo l'incubazione, rimuovere le cellule dall'incubatrice e ispezionarle al microscopio per confermare che si siano staccate dalla piastra di coltura e abbiano iniziato a galleggiare.
4. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura e pipettare delicatamente le cellule 3-5 volte per staccare tutte le cellule.
5. Trasferire le cellule in provette da centrifuga e centrifugare a 1.000 × g per 5 minuti.
6. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere le cellule nel terreno di coltura completo.
7. Se necessario, contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
8. Suddividere la sospensione cellulare in un rapporto 1:2 o 1:3 a scopo di subcoltura.
9. Quando la cultura diventa di nuovo confluente, ripetere le procedure sopra descritte.
   NOTA: I LEC prosperano in condizioni di coltura ad alta densità. Evitare di diluire eccessivamente le cellule, in quanto ciò potrebbe ostacolarne la crescita.

4. Stoccaggio e spedizione

NOTA: Il numero di celle ideale per la conservazione è ~1 × 10⁶.

1. Lavare accuratamente le celle 3 volte con 1 mL di DPBS. Dopo il lavaggio, aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA e mettere le cellule nell'incubatore per 5 minuti.
2. Aggiungere 2 mL di terreno di coltura completo e trasferire la sospensione cellulare nella provetta da centrifuga e centrifugare a 1.000 × g per 5 minuti.
3. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un terreno di congelamento composto per il 90% da FBS e per il 10% da DMSO, con l'obiettivo di ottenere una densità cellulare di 1 × 10⁶ cellule/mL. Trasferire la sospensione cellulare nel crioviale.
4. Spostare immediatamente le celle in un ambiente a -20 °C per 1 ora, seguito da -80 °C durante la notte, prima della conservazione permanente in azoto liquido.
   NOTA: Se l'azoto liquido non è disponibile, le celle possono essere conservate a -80 °C dopo un'ora iniziale a -20 °C.
5. Se è necessaria una spedizione, spedire le cellule nel crioviale in un pacco con ghiaccio secco per la consegna durante la notte.
6. Al ricevimento delle cellule, garantire un rapido recupero e posizionare le cellule nella sottocoltura. Se la coltura immediata non è fattibile, trasferire le cellule in azoto liquido per una conservazione prolungata.
   NOTA: Se le cellule devono essere spedite, assicurarsi che i campioni siano profondamente sepolti nel ghiaccio secco per evitare potenziali danni dovuti a fluttuazioni di temperatura.

5. Convalida LEC

1. Placcare i LEC in piastre di coltura da 35 mm con bicchieri di copertura e coltivarli per circa 48 ore.
2. Lavare le celle 2 volte con PBS e fissare le celle con metanolo freddo per 10 minuti a -20 °C.
3. Lavare le cellule fisse per 3 x 5 minuti con PBS e incubare le cellule fisse con tampone bloccante per 1 ora a temperatura ambiente per evitare legami non specifici.
4. Dopo il blocco, incubare le cellule per una notte a 4 °C con gli anticorpi primari (αA-cristallina, γ-cristallina e anticorpi PROX1) diluiti singolarmente in un rapporto 1:50 in tampone diluente.
5. Lavare le cellule per 3 x 5 minuti con PBS e incubare le cellule con l'anticorpo secondario diluito 1:100 in tampone diluente per 1 ora.
6. Lavare le cellule per 3 x 5 minuti con PBS e colorare le cellule con 5 μg/mL di Hoechst 33342 in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente per visualizzare i nuclei.
7. Lavare le cellule per 2 x 5 minuti con PBS per rimuovere la soluzione colorante in eccesso e acquisire immagini fluorescenti delle cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza utilizzando il canale DAPI per i nuclei e il canale FITC per αA-, γ-cristalline e PROX1.

Risultati

Come mostrato nella Figura 2, seguendo questo protocollo, i LEC primari dei topi C57BL/6J hanno aderito alle piastre entro un periodo di 4 ore. In particolare, c'erano resti visibili di altri tessuti come sezioni della capsula posteriore e cellule della fibra del cristallino. Tuttavia, questi elementi non intenzionali non si attaccavano al piatto e potevano, quindi, essere rimossi cambiando il terreno di coltura. Successivamente, tra il terzo e il quinto giorno, i LEC hanno iniziato la loro fase di proliferazione. Una rapida crescita, caratteristica della fase di proliferazione logaritmica, potrebbe quindi essere osservata tra il settimo e il decimo giorno. Nei casi in cui le cellule non progrediscono verso la fase di crescita rapida, può essere consigliabile incorporare integratori per la crescita, come EpiCGS-a, nel terreno di coltura. Inoltre, abbiamo osservato che le cellule mostrano un tasso di crescita più rapido nel terreno contenente il 20% di FBS rispetto al 10% di FBS. Una concentrazione di FBS più bassa in genere favorisce una crescita più lenta, rispecchiando i tratti dell'epitelio centrale del cristallino, mentre una concentrazione di FBS del 20% replica gli attributi della zona proliferativa del cristallino.

Secondo Reddy et al. e Andley et al., che hanno sviluppato la linea cellulare epiteliale umana immortalizzata B3, ci si aspetta che i LEC esprimano varie proteine specifiche del cristallino come αA- e γ-cristalline ^2,21. Quindi, in questo studio, abbiamo impiegato αA- e γ-cristalline come marcatori cellulari per convalidare l'identità delle cellule come LEC. I LEC all'interno dei tre passaggi iniziali sono stati coltivati su coprioggetti di vetro. Gli anticorpi primari specifici per le αA- e le γ-cristalline sono stati utilizzati per incubare le cellule durante la notte. Come mostrato nella Figura 3, queste cellule hanno mostrato una robusta espressione di αA- e γ-cristalline, fornendo la prova definitiva che si tratta di cellule epiteliali derivate dal cristallino. Inoltre, abbiamo utilizzato PROX1 come marcatore consolidato per le cellule in fibra per etichettare i LEC primari. I dati hanno indicato che questi LEC hanno mostrato una colorazione negativa per PROX1, confermando che queste cellule sono cellule epiteliali e non hanno ancora subito la differenziazione in cellule fibrose.

Figura 1: Flusso di lavoro dettagliato per la cultura LEC. La figura illustra i passaggi sequenziali coinvolti nella coltura di cellule epiteliali primarie del cristallino. La fase 1 prevede la creazione di una piccola lacerazione nella capsula anteriore. La fase 2 prevede la rimozione delicata della capsula dell'obiettivo. Nella fase 3, la capsula del cristallino viene accuratamente trasferita in una piastra a 24 pozzetti e incubata con una soluzione di tripsina allo 0,05% a 37 °C per 10 minuti. Dopo l'incubazione, la capsula del cristallino digerita viene tritata utilizzando forbici da dissezione per promuovere la separazione cellulare. La fase 4 prevede la tempra della tripsina aggiungendo 0,5 mL di terreno di coltura contenente il 20% di FBS alla provetta di centrifugazione e centrifugando i campioni di tessuto a 1.000 × g per 5 minuti. La fase 5 richiede la risospensione delle cellule in 1 mL di terreno di coltura e la semina in una piastra da 24 pozzetti. Infine, la fase 6 prevede la sostituzione del terreno di coltura ogni 2-3 giorni per supportare la crescita e il mantenimento delle cellule durante l'esperimento. Abbreviazioni: LECs = cellule epiteliali del cristallino; FBS = siero fetale bovino. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Andamento della crescita dei LEC nel tempo. I cambiamenti morfologici delle cellule epiteliali primarie del cristallino in vari momenti durante la loro crescita sono stati registrati al microscopio a contrasto di fase. Le immagini catturate nei giorni 1, 2, 3, 5, 7 e 10 mostrano l'evoluzione della morfologia cellulare, fornendo informazioni sullo sviluppo e sul comportamento delle cellule epiteliali del cristallino nel tempo. Freccia rossa che indica la posizione delle cellule epiteliali del cristallino che proliferano attivamente. Barre di scala = 100 μm. Abbreviazione: LECs = cellule epiteliali del cristallino. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Validazione dei LEC. (A) Immunocolorazione dell'αA-cristallina nei LEC di topo. I mLEC primari sono stati colorati con Hoechst 33342 (blu) e anticorpo αA-cristallina (verde). (B) Immunocolorazione della γ-cristallina nei LEC di topo. (C) Immunocolorazione di PROX1 nei LEC murini. I mLEC primari sono stati colorati con Hoechst 33342 (blu) e anticorpo PROX1 (verde). Barre di scala = 50 μm. Abbreviazione: LECs = cellule epiteliali del cristallino. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il protocollo presentato in questo documento fornisce una guida completa e dettagliata per il successo dell'isolamento, della cultura e della sottocultura dei LEC primari, completa di documentazione video di accompagnamento. La guida visiva dettagliata, insieme alle istruzioni scritte, migliora la chiarezza e l'accessibilità del protocollo, promuovendone l'uso e la riproducibilità tra i ricercatori del settore. L'obiettivo finale è quello di contribuire all'espansione delle conoscenze che circondano il ruolo dei LEC nella formazione della cataratta e della PCO, una complicanza prevalente dopo l'intervento di cataratta.

Quando si confrontano i LEC primari con le linee cellulari epiteliali del cristallino, come HLE-B3 e SRA01/04, ognuna presenta vantaggi e sfide unici in un contesto di ricerca. La linea cellulare HLE-B3, insieme alla SRA01/04, rappresenta una categoria di linee cellulari che, pur essendo facili da maneggiare e durevoli, spesso presentano cambiamenti genetici e fenotipici dovuti alla loro continua replicazione e alle condizioni di coltura prolungate. Ciò può portare a differenze significative rispetto alla funzione dei LEC originali, riducendo così l'autenticità delle loro risposte. Al contrario, i LEC primari, isolati direttamente dal tessuto vivente di pazienti o animali da ricerca, rispecchiano in modo più accurato l'ambiente cellulare naturale e le risposte intrinseche del cristallino in vivo. Nonostante la maggiore complessità della loro estrazione e coltura, sono spesso preferiti negli studi che richiedono un'elevata rilevanza fisiologica, in quanto forniscono risultati più accurati e affidabili.

Alcuni punti chiave devono essere considerati mentre si segue questo protocollo. In questi studi sono stati utilizzati topi giovani C57BL/6J, in genere di età inferiore alle 2 settimane. Abbiamo osservato che i LEC raccolti da questi giovani topi hanno dimostrato una crescita più vigorosa rispetto ai LEC di topi di età pari o superiore a 2 mesi. Ciò indica una correlazione negativa tra l'età dei topi e la crescita cellulare.

La dissezione del cristallino dall'occhio di un topo è un compito delicato, che richiede l'uso attento di strumenti di dissezione per preservare l'integrità del cristallino e della sua capsula. La procedura descritta nella sezione 1 del protocollo garantisce che la lente venga estratta correttamente con il minimo danno. Sebbene mantenere la salute e l'integrità della capsula dell'obiettivo sia una sfida, la sua importanza non può essere sottovalutata in quanto qualsiasi danno potrebbe potenzialmente influire sulla qualità e sulla quantità di LEC isolati. È interessante notare che la maggior parte delle divisioni cellulari si verifica tipicamente nella zona germinativa vicino alla regione equatoriale nel cristallino, un'area non facilmente accessibile per la coltura. Secondo Zetterberg et al., sebbene la parte centrale dell'epitelio del cristallino mostri un'attività mitotica minima in circostanze normali, gli esperimenti che utilizzano la marcatura triziata con timidina (³H-Tdr) hanno contrassegnato queste cellule dell'epitelio del cristallino posizionate centralmente come potenziali cellule staminali^17,22. Le cellule staminali presentano caratteristiche distinte, come la capacità di proliferazione illimitata nonostante abbiano un basso tasso di proliferazione in condizioni standard. In quanto tale, la parte centrale dell'epitelio del cristallino può fornire una migliore rappresentazione della capacità proliferativa dei LEC rispetto alla zona germinativa.

L'isolamento dei LEC, come dettagliato nella sezione 2 del protocollo, costituisce un passaggio fondamentale in questa procedura sperimentale. Le azioni integrali, tra cui la rimozione della capsula del cristallino, la digestione enzimatica e la frammentazione dei tessuti, vengono eseguite con cura per separare le singole cellule epiteliali dalla capsula. Uno degli elementi critici all'interno di questo processo è la durata della digestione della tripsina. Si consiglia di impostare il periodo di digestione tra 8 e 10 min. Se questo periodo viene ridotto a meno di 5 minuti, può causare una separazione cellulare incompleta. Al contrario, l'eccessiva estensione di questo lasso di tempo può compromettere significativamente la vitalità cellulare. La scelta strategica di impiegare la tripsina-EDTA come reagente di dissociazione cellulare, in combinazione con un terreno di coltura DMEM integrato con FBS al 20% e gentamicina 10 μg/mL, ottimizza il rilascio cellulare e la successiva proliferazione, mitigando al contempo i potenziali rischi di contaminazione.

Gli antibiotici sono spesso usati per prevenire la contaminazione batterica durante le colture primarie di LEC. Tuttavia, la scelta degli antibiotici deve essere fatta con attenzione. Gli antibiotici comunemente utilizzati come la penicillina e la streptomicina, così come gli agenti antimicotici, hanno il potenziale per avere un impatto sulla vitalità dei LEC. In alternativa, si consiglia di utilizzare una soluzione di gentamicina a una concentrazione di 10 μg/mL per una crescita ottimale dei LEC.

Inoltre, il mantenimento di un'elevata densità cellulare è un altro fattore cruciale per il successo della coltura LEC primaria. A differenza delle linee cellulari consolidate, i LEC primari hanno bisogno di una maggiore densità cellulare per una crescita ottimale. Ciò è dovuto principalmente alla loro dipendenza da un'efficace comunicazione intercellulare, facilitata dal contatto diretto o dalla segnalazione paracrina, che aiuta a mantenere il loro stato di differenziazione e la loro funzione. L'alta densità cellulare mitiga anche gli effetti avversi dello "shock di coltura", una condizione sperimentata dalle cellule primarie quando vengono isolate e collocate in un ambiente in vitro significativamente diverso dalla loro origine in vivo ²³. Imitando un ambiente più simile a quello in vivo, un'alta densità cellulare aumenta i tassi di sopravvivenza. Inoltre, questa densità aiuta a stabilire un gradiente di concentrazione di fattori di crescita e citochine che supporta la crescita e la funzione cellulare. Dato che molte cellule primarie dipendono dall'ancoraggio, richiedendo l'adesione superficiale per la proliferazione, un'alta densità cellulare offre un numero adeguato di cellule vicine per l'adesione, promuovendo così una crescita sana. Di conseguenza, la regolazione della densità cellulare è una considerazione cruciale nella coltivazione di cellule primarie a causa del suo impatto significativo sulla comunicazione, la sopravvivenza e la proliferazione cellulare. Si consiglia di optare per piastre di coltura più piccole, come piastre a 24 o 6 pozzetti, per creare un ambiente ideale per i LEC. Seguendo questo protocollo, in genere i LEC raggiungono uno stato confluente ~10-14 giorni dopo la coltivazione. Si consiglia di utilizzare i LEC a un basso numero di passaggi, idealmente tra P0 e P6, per garantire il comportamento più naturale negli esperimenti. Oltre i 7-10 passaggi, i LEC possono mostrare una crescita ridotta e potrebbero non reagire alle condizioni sperimentali allo stesso modo delle cellule nei passaggi inferiori.

La concentrazione sierica è direttamente correlata al tasso di crescita cellulare. Livelli più bassi di FBS hanno maggiori probabilità di indurre una crescita più lenta, simile alle caratteristiche dell'epitelio centrale. Al contrario, livelli più elevati di FBS imitano le condizioni della zona proliferativa. Se la crescita cellulare è lenta, come può accadere quando i LEC devono essere isolati da animali più anziani o geneticamente modificati, può essere utile aumentare l'FBS al 20% o aggiungere un integratore di crescita come EpiCGS-a (5 ml, vedere la tabella dei materiali) al terreno di coltura. Questo siero e l'arricchimento di integratori possono migliorare la proliferazione cellulare e promuovere la crescita ottimale delle cellule epiteliali.

Il protocollo di stoccaggio e spedizione (sezione 5 del protocollo) prende in considerazione le sfide associate alla conservazione e al trasporto di cellule vive. La scelta del mezzo di congelamento è fondamentale per la sopravvivenza dei LEC durante lo stoccaggio e il trasporto. Abbiamo sperimentato diversi terreni di congelamento, tra cui il 70% di terreno di coltura completo + 20% FBS + 10% DMSO; 90% FBS + 10% DMSO; e mezzo di congelamento privo di DMSO e siero. L'evidenza dei nostri esperimenti suggerisce che una soluzione composta dal 10% di DMSO e dal 90% di FBS mostra prestazioni superiori nel preservare la vitalità cellulare. Utilizzando questa specifica formulazione, abbiamo mantenuto con successo i LEC primari in conservazione a -80 °C per periodi superiori a 10 anni, dimostrando la robustezza di questo approccio e la sua capacità di facilitare il rilancio cellulare dopo la conservazione.

L'αA-cristallina e la γ-cristallina sono state utilizzate come marcatori per i LEC. PROX1 è stato utilizzato come marcatore per le cellule della fibra del cristallino. Ulteriori marcatori come PAX6, FOXE3 ed E-caderina possono anche essere impiegati per caratterizzare il fenotipo LEC. Se i ricercatori sono interessati ad esplorare l'EMT, l'αSMA dovrebbe essere usato come marcatore. È essenziale regolare i tempi di incubazione e le diluizioni in base ai requisiti specifici dell'esperimento e alle raccomandazioni fornite per i rispettivi anticorpi utilizzati.

Sebbene questo studio presenti una solida metodologia per la coltivazione dei LEC primari, è importante riconoscerne i limiti. Mentre le cellule isolate inizialmente sono LEC primarie, qualsiasi procedura di subcoltura, tripsinizzazione e rianimazione porterà ad alterazioni del loro stato. Il protocollo che abbiamo progettato utilizza principalmente la lente del mouse come fonte di LEC; tuttavia, i LEC possono anche essere coltivati da altre risorse, tra cui campioni di pazienti affetti da cataratta, occhi della banca degli occhi o pazienti con diverse malattie oculari tra cui glaucoma e retinopatia diabetica^17,24. I LEC raccolti da individui più anziani o da quelli con condizioni oculari specifiche potrebbero non essere conformi al protocollo con la stessa efficacia delle cellule di controparti più giovani e più sane. La coltura di LEC da individui o animali più anziani o geneticamente modificati potrebbe richiedere l'ottimizzazione del terreno di coltura, potenzialmente aumentando l'FBS al 20% o incorporando fattori di crescita aggiuntivi. Inoltre, precedenti studi di Menko et al., condotti su colture cellulari epiteliali embrionali primarie di pulcino, hanno dimostrato una differenziazione spontanea che si verifica dopo il secondo giorno di coltura²⁵. Pertanto, i ricercatori dovrebbero prestare attenzione e considerare le differenze nelle metodologie, soprattutto se lo studio della differenziazione è il loro principale obiettivo di ricerca.

Vari metodi possono essere utilizzati per coltivare i LEC primari. Ad esempio, i metodi sviluppati da Ibaraki et al., Sundelin et al. e Andjelic et al., prevedono la coltura di LEC primari direttamente sulla piastra di Petri utilizzando la porzione anteriore della capsula del cristallino raccolta durante l'intervento di cataratta 16,17,19,20. Questo approccio mantiene i contatti naturali cellula-cellula e la matrice extracellulare, fornendo un'elevata rilevanza fisiologica cruciale per condizioni come la PCO. In alternativa, il metodo dell'espianto del cristallino, come delineato da Zelenka et al., preserva l'architettura tissutale nativa, consentendo studi più rilevanti dal punto di vista fisiologico, particolarmente utili per esplorare il differenziamento terminale dei LEC, le interazioni cellulari e i processi di sviluppo del cristallino, garantendo una comprensione dettagliata degli eventi cellulari e molecolari sequenziali durante il differenziamento²⁶.

Al contrario, il metodo di tripsinizzazione descritto in questo protocollo produce una sospensione unipolare a singola cellula, semplificando la semina uniforme e il conteggio preciso delle cellule, il che è vantaggioso per alcuni esperimenti come i saggi di vitalità e proliferazione cellulare, lo screening dei farmaci e l'analisi della via di segnalazione cellulare. Tuttavia, è fondamentale riconoscere che, sebbene questo metodo faciliti studi controllati e precisi grazie alla sua popolazione cellulare uniforme, può alterare il comportamento cellulare e compromettere la rilevanza fisiologica osservata nei metodi di espianto e coltura diretta a causa del trattamento enzimatico. Per i ricercatori che si concentrano esclusivamente sullo studio delle cellule epiteliali, questo metodo si rivela altamente applicabile e conveniente, offrendo informazioni affidabili sulle caratteristiche e sui comportamenti di queste cellule. Tuttavia, per coloro le cui indagini scientifiche si estendono al differenziamento cellulare, diventa essenziale contemplare metodi alternativi come le tecniche di espianto, o adattare e ottimizzare quello attuale per comprendere questi aspetti.

Nel complesso, questo protocollo è progettato tenendo in attenta considerazione le esigenze e i requisiti specifici dei LEC. Ogni fase, dalla dissezione alla validazione, è realizzata con cura per mantenere la vitalità e la funzionalità delle cellule. Di conseguenza, può essere una guida preziosa per i ricercatori che studiano i LEC e il loro ruolo nella fisiologia e nella patologia oculare. Studi futuri possono adattare e modificare questo protocollo per esplorare diversi aspetti della biologia LEC, fornendo una piattaforma per ulteriori progressi nella comprensione delle malattie correlate al cristallino e nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche per la prevenzione della cataratta e della PCO.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,05% Tripsina-EDTA	Thermo Fisher	25300054	Per la dissociazione LEC
Alexa Fluor 488 Anticorpo secondario	Jackson ImmunoResearch	#715-545-150	Per la convalida cellulare
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-605-003	Per la convalida cellulare
Tampone di diluizione degli anticorpi	Licor	#927-60001	Per la convalida cellulare
Coltello di sicurezza Beaver-Visitec	International	#3782235	Per la dissezione
delle lentiTampone di blocco	Licor	#927-60001	Per la convalida cellulare
Pinze per capsuloressi	Titan Medical Instruments	TMF-124	Per l'isolamento della capsula della lente
DMEM	Sigma Aldrich	D6429	Per il terreno di coltura LEC
DMSO	Sigma Aldrich	#D2650	Per la produzione di terreno di congelamento
salina tamponata con fosfato di Dulbecco	Thermo Fisher	#J67802	Per la dissezione delle lenti,
Pinzette Dumont	Roboz Strumento chirurgico	RS-4976	Per l'isolamento della capsula delle lenti,
EpiCGS-a (opzionale)	ScienCell	4182	Per i terreni di coltura delle LEC,
FBS,	Sigma, Aldrich,	F2442	Per i terreni di coltura delle LEC:
Gentamicina (50  mg/mL)	Sigma-Aldrich	G1397	Per terreno di coltura LEC
Soluzione Hoechst 33342	Thermo Fisher	#62249	Per la convalida cellulare
Forbici per micro-dissezione	Roboz Surgical Instrument	RS-5983	Per la dissezione delle lenti
Pinzette per micro-dissezione	Strumento chirurgico Roboz	RS5137	Per la dissezione delle lenti
Anticorpo PROX1	Thermo Fisher	11067-2-AP	Per la convalida cellulare
Forbici a molla per micro-dissezione Vannas	Strumento chirurgico Roboz	RS-5608	Per l'isolamento della capsula del lente
α Anticorpo A-crystallina	Santa Cruz	sc-28306	Per la convalida cellulare
Anticorpo γ-cristallina	Santa Cruz	sc-365256	Per la validazione cellulare