Articolo metodologico

Ricostruzione della barriera emato-encefalica in vitro per modellare e colpire terapeuticamente la malattia neurologica

DOI:

10.3791/65921

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20 ottobre 2023

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1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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La barriera emato-encefalica (BBB) ha un ruolo cruciale nel sostenere un ambiente cerebrale stabile e sano. La disfunzione della BBB è associata a molte malattie neurologiche. Abbiamo sviluppato un modello 3D derivato da cellule staminali della BBB per studiare la patologia cerebrovascolare, l'integrità della BBB e il modo in cui la BBB viene alterata dalla genetica e dalla malattia.

Abstract

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La barriera emato-encefalica (BBB) è una componente fisiologica chiave del sistema nervoso centrale (SNC), che mantiene i nutrienti, elimina i rifiuti e protegge il cervello dagli agenti patogeni. Le proprietà di barriera intrinseche della BBB rappresentano una sfida per la somministrazione di farmaci terapeutici nel sistema nervoso centrale per il trattamento di malattie neurologiche. La compromissione della funzione della BBB è stata correlata a malattie neurologiche. L'angiopatia amiloide cerebrale (CAA), la deposizione di amiloide nella vascolarizzazione cerebrale che porta a una BBB compromessa, è una comorbilità nella maggior parte dei casi di malattia di Alzheimer (AD), suggerendo che la disfunzione o la rottura della BBB può essere coinvolta nella neurodegenerazione. A causa dell'accesso limitato al tessuto BBB umano, i meccanismi che contribuiscono alla corretta funzione e alla degenerazione della BBB rimangono sconosciuti. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato una BBB derivata da cellule staminali pluripotenti umane (iBBB) incorporando cellule endoteliali, periciti e astrociti in una matrice 3D. L'iBBB si auto-assembla per ricapitolare l'anatomia e le interazioni cellulari presenti nella BBB. La semina di iBBB con amiloide cattura gli aspetti chiave della CAA. Inoltre, l'iBBB offre una piattaforma flessibile per modulare i fattori genetici e ambientali implicati nelle malattie cerebrovascolari e nella neurodegenerazione, per studiare come la genetica e lo stile di vita influenzano il rischio di malattia. Infine, l'iBBB può essere utilizzato per lo screening dei farmaci e gli studi di chimica farmaceutica per ottimizzare la somministrazione terapeutica al SNC. In questo protocollo, descriviamo la differenziazione dei tre tipi di cellule (cellule endoteliali, periciti e astrociti) derivanti da cellule staminali pluripotenti umane, come assemblare le cellule differenziate nell'iBBB e come modellare CAA in vitro utilizzando amiloide esogena. Questo modello supera la sfida di studiare il tessuto cerebrale umano vivo con un sistema che ha sia fedeltà biologica che flessibilità sperimentale, e consente di interrogare la BBB umana e il suo ruolo nella neurodegenerazione.

Introduzione

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La barriera emato-encefalica (BBB) è una rete microvascolare chiave che separa il sistema nervoso centrale (SNC) dalla periferia per mantenere un ambiente ideale per una corretta funzione neuronale. Ha un ruolo fondamentale nella regolazione dell'afflusso e dell'efflusso di sostanze nel sistema nervoso centrale mantenendo l'omeostasi metabolica 1,2,3,4, eliminando i rifiuti 4,5,6 e proteggendo il cervello da agenti patogeni e tossine 7,8

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Protocollo

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1. Differenziare le iPSC in cellule iBBB

NOTA: Questi protocolli di differenziazione sono stati precedentemente descritti in Mesentier-Louro et al.34.

  1. Piastre per colture cellulari di rivestimento
    1. Scongelare la matrice di membrana con fattore di crescita ridotto (GF) durante la notte a 4 °C. Diluire 500 μL di matrice di membrana basale in 49,5 mL di DMEM. Mantenere questa soluzione fredda per evitare la polimerizzazione prematura della soluzione di rivestimento.
    2. Aggiungere 1-2 mL per pozzetto di una piastra trattata con coltura tissutale a 6 pozzetti. Lasciare agire la so....

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Risultati

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Un iBBB correttamente formato si solidifica in un singolo disco traslucido (Figura 3A). È normale che l'iBBB si stacchi dalla superficie su cui è stato pipettato per la prima volta dopo alcuni giorni. Questo non può essere evitato, ma non è una grande preoccupazione per la corretta formazione dell'iBBB se si presta attenzione quando si cambia il supporto per non aspirare accidentalmente l'iBBB. Dopo 24 ore, le singole cellule uniformemente distribuite possono essere identificate al microscop.......

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Discussione

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La disfunzione della BBB è una comorbilità e, potenzialmente, una causa o un fattore esacerbante in numerose malattie neurologiche 7,40,41. Tuttavia, è quasi impossibile studiare la biologia molecolare e cellulare alla base della disfunzione e della degradazione della BBB negli esseri umani con malattie neurovascolari. La BBB inducibile (iBBB) presentata in questo protocollo fornisce un sistema in vitro che ricapitola i.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non segnalano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è supportato da NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation e Brain Injury Association of America. C.G. è supportato da NIH F31NS130909. La Figura 1A è stata creata con BioRender.com.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
6e10 amiloide-β anticorpoBiolegendSIG-39320Utilizzato a 1:1000
AccutaseTecnologie cellulari innovativeAT104
Activina APeprotech20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 anticorpi secondariInvitrogenVariUtilizzato a 1:1000
Amiloide-beta 40 fibrillaAnaSpecAS-24235
Beta-amiloide 42 fibrillaAnaSpecAS-20276
Anticorpo Aquaporin-4InvitrogenPA5-53234Utilizzato a 1:300
Terreni basali e integratori per astrocitiScienCell1801
B-27 integratore senza sieroGibco17504044
BMP4Peprotech120-05ET
CHIR99021Cyamn Chemical13112
DMEM/F12 con GlutaMAX medioGibco10565018
DoxiciclinaMillipore-SigmaD3072-1ML
FGF-basicPeprotech100-18B
Fluoromount-G supporto scorrevole medioVWR100502-406
ForskolinR& D Systems1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC qualificato Fattore di crescita ridotto Seminterrato GibcoA1413302
Fondo in vetro a 48 pozzetti Piastre di colturaMattek CorporationP48G-1.5-6-F
Supplemento GlutaMAXGibco35050061
Hoechst 33342 InvitrogenH3570
Mezzo senza siero endoteliale umanoGibco11111044
LDN193189Tocris6053
Soluzione di aminoacidi non essenziali minimi (MEM-NEAA) Integratore Gibco11140050
N-2Gibco17502048
Neurobasal mediumGibco21103049
Siero d'asino normaleMillipore-SigmaS30-100mLUtilizzare il siero per abbinare l'anticorpo secondario ospite
Paraformaldeide (PFA) ThermoFisher28908
PDGF-BBPeprotech100-14B
PDGFRB (recettore beta del fattore di crescita derivato dalle piastrine) anticorpoR& D SystemsAF385Utilizzato a soluzione salina tamponata con fosfato 1:500
(PBS), pH 7,4Gibco10010031
Pecam1 (molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche)anticorpo R& D SystemsAF806Utilizzato a 1:500
Penicillina-StreptomicinaGibco15140122
Plasmide PiggyBac (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)AddGene  Catalogo #168805
Anticorpo S100BSigma-AldrichS2532-100uLUtilizzato a 1:500
SB43152Reprocell04-0010
Tioflavina TChem Impex22870Utilizzato a 25uM
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787-250mL
VE-caderina (CD144) anticorpoR& D systemsAF938Usato a 1:500
VEGF-APeprotech100-20
Y27632R& D Systems1254/10
ZO-1InvitrogenMA3-39100-A488Diluizione = 1:500

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412(2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021)....

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Blood Brain BarrierIn Vitro ModelPluripotent Stem CellsEndothelial CellsAstrocyte DifferentiationPericyte DifferentiationAmyloid PathologyCerebrovascular DiseaseDrug ScreeningNeurodegeneration

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