Quantificazione della citotossicità cellulare anticorpo-dipendente in un modello di sferoide tumorale: applicazione per la scoperta di farmaci

Sommario

Qui, presentiamo un metodo per identificare i composti che modulano il meccanismo ADCC, un importante meccanismo di uccisione delle cellule tumorali degli anticorpi antitumorali. L'effetto citotossico delle cellule NK è misurato negli sferoidi delle cellule del cancro al seno in presenza di Trastuzumab. L'analisi delle immagini identifica le cellule killer vive e morte e le cellule bersaglio negli sferoidi.

Abstract

L'immunoterapia basata su anticorpi monoclonali che ha come bersaglio gli antigeni tumorali è ora un pilastro del trattamento del cancro. Uno dei meccanismi d'azione clinicamente rilevanti degli anticorpi è la citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC), in cui l'anticorpo si lega alle cellule tumorali e impegna la componente cellulare del sistema immunitario, ad esempio le cellule natural killer (NK), per uccidere le cellule tumorali. L'efficacia di queste terapie potrebbe essere migliorata identificando composti adiuvanti che aumentano la sensibilità delle cellule tumorali o la potenza delle cellule immunitarie. Inoltre, interazioni farmacologiche non scoperte in pazienti oncologici co-medicati per condizioni pregresse o sintomi associati al cancro possono determinare il successo della terapia anticorpale; Pertanto, tali interazioni farmacologiche indesiderate devono essere eliminate. Con questi obiettivi in mente, abbiamo creato un modello di ADCC per il cancro e descriviamo qui un semplice protocollo per trovare farmaci modulanti l'ADCC. Poiché i modelli 3D come gli sferoidi delle cellule tumorali sono superiori alle colture 2D nel predire le risposte in vivo dei tumori alle terapie antitumorali, le co-colture sferoidi di cellule di carcinoma mammario HER2+ JIMT-1 che esprimono EGFP e NK92. Le linee cellulari CD16 sono state create e indotte con Trastuzumab, un anticorpo monoclonale clinicamente approvato contro il carcinoma mammario HER2-positivo. Gli sferoidi JIMT-1 sono stati lasciati formare in piastre a 96 pozzetti con fondo a U repellenti per le cellule. Il giorno 3 sono state aggiunte cellule NK e Trastuzumab. Gli sferoidi sono stati poi colorati con Annexin V-Alexa 647 per misurare la morte cellulare apoptotica, che è stata quantificata nella zona periferica degli sferoidi con un microscopio automatizzato. L'applicabilità del nostro test per identificare le molecole modulanti l'ADCC è dimostrata dimostrando che Sunitinib, un inibitore della tirosin-chinasi approvato dalla FDA contro il cancro metastatico, abolisce quasi completamente l'ADCC. La generazione degli sferoidi e le pipeline di acquisizione e analisi delle immagini sono compatibili con lo screening ad alto rendimento per i composti modulanti ADCC negli sferoidi delle cellule tumorali.

Introduzione

Gli sferoidi tumorali multicellulari (MCTS) sono modelli tridimensionali (3D) ampiamente utilizzati che si formano a causa della tendenza delle cellule aderenti ad aggregarsi e rappresentano uno strumento importante per ottenere informazioni meccanicistiche sulla biologia delle cellule tumorali. Possono essere generati da un'ampia gamma di tipi di cellule mediante numerose tecniche, come le colture 3D a base liquida e basata su scaffold¹. Il loro principale vantaggio rispetto ai modelli 2D monostrato è che ricapitolano le caratteristiche principali dei tumori in vivo , vale a dire l'organizzazione strutturale e l'ipossia, imitando il comportamento biologico delle cellule tumorali, in particolare i meccanismi che portano alla fuga terapeutica e alla resistenza ai farmaci². Pertanto, poiché gli MCTS possono migliorare la prevedibilità della tossicità e della sensibilità ai farmaci, sono ampiamente utilizzati per studiare i tumori in 3D e potrebbero migliorare lo sviluppo di farmaci efficaci per diversi tipi di cancro³.

Per studiare qualsiasi malattia, c'è un bisogno critico di modelli pertinenti e convenienti. La creazione di modelli per gli studi di immunologia del cancro è impegnativa perché il sistema immunitario è costituito da più tipi di cellule. Ogni tipo di cellula ha diversi sottotipi e un ampio spettro di stati di attivazione. Questi diversi tipi di cellule immunitarie interagiscono con le cellule tumorali e altri componenti tumorali, influenzando in ultima analisi l'esito della malattia. I metodi di coltura cellulare in vitro 2D non riescono a ricapitolare queste complesse interazioni cellulari, in quanto mancano di traducibilità e non sono in grado di prevedere l'azione di un farmaco a livello di sistema (ad esempio, nei tessuti)^4,5. Inoltre, i modelli murini hanno anche gravi limitazioni a causa delle differenze fondamentali tra il sistema immunitario umano e quello murino. I sistemi di coltura 3D possono, quindi, colmare le attuali lacune nei modelli disponibili, fornendo un metodo alternativo e migliorando la nostra comprensione dell'immunologia del cancro⁶. In particolare, i modelli sferoidi potrebbero essere utilizzati per testare le immunoterapie, principalmente per valutare l'efficienza dello screening farmacologico e degli anticorpi terapeutici per migliorare l'infiltrazione delle cellule immunitarie e gli effetti antitumorali contro i bersagli sferoidi⁷. Inoltre, è stato ampiamente dimostrato il potenziale degli MCTS composti da cellule in diversi stati metabolici e proliferativi per studiare le interazioni tra cellule dello stroma (ad esempio, linfociti, macrofagi, fibroblasti) e cellule tumorali e per lo sviluppo di nuove strategie antitumorali⁸. Quindi, c'è una necessità vitale di corroborare piattaforme predittive e accurate al fine di potenziare il processo di test farmacologico, tenendo conto della fisiopatologia del microambiente tumorale.

Il carcinoma mammario (BC) è il tumore più frequente diagnosticato in tutto il mondo nelle donne. La classificazione clinica di questa malattia eterogenea si basa sulla presenza di recettori transmembrana, ad esempio i recettori degli estrogeni (ER) e del progesterone (PR) (collettivamente chiamati recettori ormonali, HR), insieme alla sovraespressione o all'amplificazione della proteina/oncogene del recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2). Sulla base dell'espressione immunoistochimica di questi recettori, sono comunemente riconosciuti quattro sottotipi: carcinoma mammario luminale A (HR+/HER2-), luminale B (HR+/HER2+), HER2-positivo (HR-/HER2+) e carcinoma mammario triplo negativo (HR-/HER2-). Il gruppo HER2+ costituisce il 10-15% dei casi di BC ed è caratterizzato da un'elevata espressione di HER2 con assenza di ER e PR, ha una prognosi peggiore rispetto ai tumori luminali e richiede farmaci specifici diretti contro la proteina HER2/neu⁹.

Lo sviluppo del BC è un processo in più fasi e una diagnosi precoce è essenziale per un trattamento efficace della malattia¹⁰. Tuttavia, nonostante siano emerse di recente opzioni di trattamento personalizzate per la BC (ad esempio, terapie endocrine e anticorpali anti-HER2), la BC continua a rappresentare una sfida per gli oncologi. Proprio come la chirurgia, la chemioterapia e la radioterapia, anche queste terapie personalizzate possono avere gravi effetti avversi e i pazienti possono sviluppare resistenza a questi agenti, rendendo difficile determinare la strategia migliore a lungo termine^11,12. Pertanto, una migliore comprensione dell'interazione tra il tumore e il suo microambiente è essenziale e dovrebbe fornire nuove direzioni per lo sviluppo di nuovi trattamenti che tengano conto delle specificità dei diversi sottotipi di BC¹³. Una nuova ondata di immunoterapie, come i coniugati farmaco-anticorpale, le terapie adottive con cellule T, i vaccini e i nuovi anticorpi monoclonali diretti a HER2 (mAb) sono in fase di studio in un'ampia popolazione di pazienti con tumori che esprimono HER2¹⁴.

Trastuzumab, ad esempio, rappresenta una modalità di trattamento efficiente per HER2+ BC. Come parte del suo meccanismo d'azione, Trastuzumab media le attività dipendenti dal recettore gamma cristallizzabile (FcγR) del frammento. I FčγR si distinguono per la loro affinità per il frammento Fc e per la risposta immunitaria che avviano. L'attivazione di FcγRIIIa (CD16A) sulle cellule natural killer (NK) è fondamentale per mediare la citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC), mentre l'attivazione di FcγRIIa (CD32A) e FcγRIIIa sui macrofagi induce la fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente (ADCP)¹⁵. Studi su modelli animali hanno mostrato che i topi privi dei recettori FcγRI (CD64) e FcγRIII (CD16) non erano in grado di avviare risposte immunitarie protettive contro antigeni tumore-specifici, rivelando che l'ADCC è probabilmente un importante meccanismo d'azione per l'anticorpo monoclonale Trastuzumab¹⁶.

Poiché le cellule NK ricorrono agli Abs legati alle cellule tumorali per l'uccisione delle cellule tumorali da parte dell'ADCC, l'espressione dei recettori Fc è fondamentale per un trattamento efficace con Trastuzumab¹⁷ (Figura 1). Inoltre, la loro azione è efficacemente bilanciata da una stimolazione di recettori attivanti e inibitori, ad esempio i recettori Killer-cell immunoglobulin-like (KIR)¹⁸.

Figura 1. Meccanismo dell'ADCC nel contesto di una risposta antitumorale. Il recettore Fcγ di una cellula natural killer (NK) riconosce la regione Fc di un anticorpo, che in precedenza si era legato a un antigene di superficie su una cellula tumorale. Questa sinapsi immunologica porta alla degranulazione della cellula NK che rilascia mediatori citotossici come i granzimi e la perforina. Queste molecole contribuiscono alla formazione dei pori nella membrana cellulare e attivano le vie apoptotiche causando la morte cellulare programmata della cellula bersaglio (immagine creata con Biorender.com). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Lo sviluppo dell'immunoterapia per HER2+ BC rappresenta un campo in evoluzione. In questo caso, si dovrebbero considerare le interazioni tra i vari componenti del sistema immunitario. Inoltre, pubblicazioni precedenti hanno ampiamente testato terapie combinate che coinvolgono tutti i tipi di terapie tradizionali, immunitarie o cellulari per identificare combinazioni sinergiche¹⁹.

Diversi modelli 3D di HER2+ BC sono stati precedentemente utilizzati per la scoperta di farmaci. Ad esempio, Balalaeva et al. hanno utilizzato sferoidi SKBR-3 che sovraesprimono HER2 per valutare la citotossicità dell'immunotossina mirata a HER2 4D5scFv-PE40²⁰. In un altro studio, è stato creato un sistema di coltura HER2+ BC basato su Matrigel 3D per misurare la crescita cellulare in risposta a Trastuzumab e agenti endocrini²¹. Questi studi evidenziano l'importanza dei modelli di sferoidi tumorali di cellule tumorali sovraesprimenti HER2 nel rappresentare una strategia efficace per migliorare clinicamente le risposte terapeutiche²².

Il nostro gruppo ha precedentemente identificato Sunitinib, un inibitore multitarget della tirosin-chinasi, come inibitore dell'ADCC dipendente da trastuzumab nelle cellule JIMT-1 HER2+ BC in un test di coltura 2D. Lo studio ha rivelato che Sunitinib induce l'autofagia e compromette la funzione di uccisione delle cellule NK, riducendo l'espressione di HER2 e migliorando l'adesione superficiale delle cellule JIMT-1¹⁷.

Qui abbiamo stabilito un nuovo modello 3D di ADCC sferoidi (cellule tumorali NK.92.CD16+Trastuzumab+JIMT-1-EGFP) da utilizzare per applicazioni di screening ad alto rendimento e, al fine di convalidare i risultati sopra menzionati, Sunitinib è stato utilizzato come composto modello. In primo luogo, abbiamo generato cellule JIMT-1 esprimenti EGFP¹⁷ e abbiamo fatto crescere sferoidi da queste cellule. L'ADCC è stato indotto da cellule NK insieme a Trastuzumab e gli sferoidi sono stati mantenuti in coltura in presenza o assenza di composti in esame per 24 ore (Figura 2). La quantificazione dell'ADCC si basa sulla rilevazione della morte delle cellule tumorali apoptotiche (colorazione con annessina V) utilizzando un sistema di analisi ad alto contenuto.

Figura 2. ADCC in un sistema di co-coltura di sferoidi 3D. Le nostre impostazioni sperimentali si basano su un sistema di sferoidi 3D in grado di modellare in modo più accurato il microambiente in vivo rispetto ai modelli 2D. Le cellule di carcinoma mammario JIMT-1 EGFP sono state seminate su un fondo concavo repellente per formare un ammasso cellulare di forma rotonda, chiamato sferoide. L'ADCC è stato quindi avviato con l'aggiunta di NK92. Cellule natural killer CD16 (rapporto E:T = 20:1) e un anticorpo monoclonale anti-HER2, Trastuzumab. Il modello sperimentale si è dimostrato efficiente e facilmente applicabile per l'identificazione di composti modificanti ADCC (immagine creata con Biorender.com). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Abbiamo dimostrato che l'acquisizione di dati in questo modo può essere effettuata in tempo reale ed è statisticamente robusta per l'uso nello screening ad alto contenuto nella scoperta di farmaci antitumorali. È importante sottolineare che questo modello consente una convalida estesa di un insieme più ampio di composti e può essere applicato a diversi saggi di interesse.

Protocollo

1. Impostazione del modello sferoidale della proteina fluorescente potenziata JIMT-1 (EGFP)

1. Per formare un fondo repellente per cellule a forma di U, rivestire la piastra a 96 pozzetti con una soluzione di agarosio-PBS allo 0,5% (30 μL/pozzetto). Incubare la piastra a temperatura ambiente per circa 30-45 min.
2. Lavare due volte le cellule JIMT-1-EGFP con 2 mL di PBS sterile (la generazione della linea cellulare JIMT1-EGFP è stata riportata in una precedente pubblicazione¹⁷). Utilizzare palloni per coltura tissutale T25 e terreni JIMT-1 (terreno DMEM/F-12 integrato con il 20% di siero fetale bovino (FBS), 0,3 U/mL di insulina (100 UI/mL, Humulin R) e 1% di penicillina-streptomicina) per la coltura cellulare.
3. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA al matraccio e incubare per 10 minuti in un incubatore a CO₂ .
4. Picchiettare il pallone per verificare se le cellule JIMT-1 si sono staccate dopo il tempo di incubazione.
5. Utilizzare 2 mL di terreno JIMT-1 per fermare la digestione e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL.
6. Contare le cellule in una camera Bürker con lo 0,4% di blu di tripano (80 μL di colorante + 20 μL di sospensione cellulare) e regolare il numero di cellule a 20.000 cellule/mL.
7. Pipettare 100 μL della sospensione cellulare (2000 cellule/pozzetto) a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti (pre-rivestita con soluzione di agarosio-PBS allo 0,5% come indicato al punto 1.1).
8. Lasciare che le cellule si aggreghino durante un periodo di incubazione di 3 giorni a 37 °C in un incubatore a CO₂ .
9. Controllare regolarmente le dimensioni e la forma degli sferoidi con un microscopio invertito.

2. Rivestimento della piastra HCS

NOTA: Per evitare l'attaccamento degli sferoidi JIMT-1-EGFP alla superficie di vetro della piastra, è fondamentale rivestire la piastra di screening ad alto contenuto (HCS) (altrimenti l'analisi ad alto contenuto non sarebbe possibile).

1. Il giorno 3 dopo l'induzione degli sferoidi, rivestire la piastra di screening ad alto contenuto a 96 pozzetti con Pluronic-F127 (0,5% in DMSO, 50 μL/pozzetto) e incubare la piastra per 45 minuti a temperatura ambiente.
2. Aspirare la soluzione di rivestimento e lavare i pozzetti due volte con terreno privo di siero DMEM/F-12 (100 μL/pozzetto).

3. Trasferimento degli sferoidi sulla piastra HCS

1. Utilizzando una pipetta da 1 mL, trasferire gli sferoidi in triplice copia sulla piastra HCS a 96 pozzetti con fondo in vetro.

4. Pretrattamento degli sferoidi EGFP JIMT-1 con composti di prova

1. Aggiungere il composto in esame (ad es. Sunitinib diluito in DMSO a una concentrazione di 40 μM) pipettando 10 μL/pozzetto e aggiungere 10 μL di terreno JIMT-1 fresco ai pozzetti di controllo (CTL).
2. Incubare la piastra per 1 ora in un incubatore a CO₂ a 37 °C.

5. Induzione dell'ADCC mediante l'aggiunta delle cellule effettrici

NOTA: Le cellule CD16.176V.NK92 (di seguito denominate cellule NK) sono state coltivate in α-MEM integrato con il 20% di FBS, l'1% di MEM-NEAA, l'1% di Na-piruvato, l'1% di glutammina, l'1% di penicillina-streptomicina e 100 UI/mL di IL-2.

1. Raccogliere le cellule NK nel matraccio in una provetta da 15 ml. Contare le cellule con blu di tripano (80 μL del colorante + 20 μL della sospensione cellulare) e regolare la densità cellulare al rapporto effettore-bersaglio (E:T) di 20:1 (40.000 cellule NK/pozzetto).
2. Colorare le cellule NK con 10 μM Cell Tracker Blue (CTB, 1 μL in 1 mL di terreno NK α-MEM) e metterle in un incubatore di CO₂ a 37 °C per 1 ora.
3. Centrifugare le cellule NK a 150 x g per 3 minuti a temperatura ambiente due volte per lavare l'eccesso di colorante con 1 mL di terreno α-MEM.
4. Risospendere il pellet di cellule NK in 1 mL di terreno JIMT-1 fresco.
5. Aggiungere le cellule NK colorate insieme all'anticorpo anti-HER2 (Ab) (Trastuzumab, disciolto in H₂O distillato sterile) agli sferoidi JIMT-1 bersaglio pipettando 55 μL/pozzetto di cellule NK colorate con CTB e 55 μL/pozzetto di 10 μg/mL Ab nel terreno JIMT-1 (il volume totale di trattamento aggiunto per l'ADCC è di 110 μL/pozzetto e la concentrazione finale di Sunitinib è di 20 μM).
   NOTA: Per la selezione della concentrazione Ab e del rapporto E:T, ci siamo basati sulla nostra precedente pubblicazione¹⁷. Sono stati condotti esperimenti preliminari con diversi rapporti E:T e concentrazioni di Trastuzumab per valutare quale fosse il più efficace nell'indurre ADCC negli sferoidi (Figura supplementare S1).
6. Aggiungere 110 μL/pozzetto di terreno JIMT-1 fresco per controllare (CTL).
7. Incubare la piastra per 24 ore in un incubatore CO₂ a 37 °C.
   NOTA: Poiché è noto che le cellule NK92 esercitano funzioni citotossiche non specifiche, per il controllo utilizzare cellule JIMT-1 co-incubate sia con cellule NK da sole che con un controllo isotipo o un Ab F(ab')₂. In questo caso F(ab')2-Trastuzumab (TR-F(ab')₂) è stato utilizzato come CTL negativo. Il frammento TR-F(ab')₂ è stato preparato come riportato da Tóth et ^al.19 e aggiunto nello stesso volume di Trastuzumab insieme alle cellule NK come descritto in 5.5. La concentrazione è stata aggiustata a 6,6 μg/mL corrispondente a una concentrazione equimolare con Trastuzumab²³.

6. Annessina V-647: colorazione degli sferoidi

1. Per misurare la morte cellulare apoptotica, colorare gli sferoidi con coniugato di annessina V-Alexa Fluor 647 per 1 ora in terreno JIMT-1 (1:100) pipettando 50 μL/pozzetto.

7. Imaging

NOTA: La piastra viene ripresa a 24 ore dopo l'aggiunta delle cellule effettrici NK alle cellule bersaglio. Per l'imaging vengono utilizzati un analizzatore ad alto contenuto e un software di analisi delle immagini.

1. Selezionare il tipo di micropiastra dall'elenco delle piastre utilizzando l'opzione Tipo di piastra . Utilizzare una piastra di screening ad alto contenuto (HCS) a 96 pozzetti.
2. Selezionare l'autofocus a due picchi poiché il test viene eseguito su lastre con obiettivo 10x con apertura numerica di 0,3 (NA), utilizzando rispettivamente le opzioni Messa a fuoco automatica e Obiettivo . Scegliere la modalità confocale con l'opzione Modalità opzionale e applicare il Binning 2 utilizzando l'opzione Binning .
3. Per l'imaging degli sferoidi, selezionare i canali appropriati utilizzando l'opzione Selezione canale . Per rilevare le cellule JIMT-1 trasdotte con EGFP scegliere EGFP (tempo di integrazione 200 ms, potenza laser 50%, altezza stack 2,0 μm; es: 488 nm em: 500-550 nm) e per rilevare le cellule apoptotiche utilizzare Alexa 647 (tempo di integrazione 100 ms, potenza laser 50%, altezza stack 10,0 μm; es: 640 nm em: 650-760 nm). Per visualizzare le cellule NK all'interno degli sferoidi, scegliere il seguente canale: DAPI (tempo di integrazione 100 ms, potenza laser 50%, altezza stack 2,0 μm; es: 405 nm em: 435-480 nm).
4. Nell'opzione Selezione layout , selezionare le pile Z poiché le cellule negli sferoidi tendono a trovarsi su piani focali diversi del microscopio. 10 piani (con una distanza di 10 μm) sono sufficienti per coprire l'intera regione sferoidale. Impostare i valori del primo piano e dell'ultimo piano rispettivamente a 0 μm e 90 μm.
   NOTA: Prima di iniziare la misurazione, è possibile scattare immagini campione con la funzione istantanea per verificare le impostazioni corrette.
5. Impostare il numero di pozzetti e campi per l'imaging utilizzando l'opzione Definisci layout .

8. Analisi ad alto contenuto (HCA)

NOTA: Analizzare le immagini con il software Harmony o esportare le immagini per l'analisi utilizzando un software di terze parti preferito. Per l'analisi dell'efficienza dell'ADCC, viene misurata l'intensità di fluorescenza dell'annessina V 647. Le cellule bersaglio uccise dall'ADCC appaiono nell'area periferica degli sferoidi. Pertanto, le cellule positive all'annessina V vengono misurate in questo "anello" sferoidale. Al fine di convalidare questo metodo, sono state eseguite analisi con diversi parametri per valutare quale fosse il più affidabile e producesse i migliori risultati (Figura supplementare S2). Nel video viene mostrato un pozzetto ADCC per dimostrare passo dopo passo il processo di analisi delle immagini.

1. Identifica gli sferoidi in base alla fluorescenza EGFP delle cellule JIMT-1 utilizzando l'opzione Trova regioni di trama e filtrali per dimensione (> 25.000 μm²).
2. Rimuovi gli oggetti bordo tramite l'opzione Seleziona popolamento .
3. Poiché le cellule positive all'annessina V (apoptotiche) compaiono alla periferia degli sferoidi, misurare l'intensità dell'annessina in questo "anello" apoptotico, selezionato dall'opzione Seleziona regione (bordo esterno -90%) per determinare la morte cellulare apoptotica.
4. Esprimere i valori di intensità dell'annessina V come intensità media.

Risultati

Sono state generate cellule JIMT-1 che esprimono EGFP e da queste cellule sono stati coltivati sferoidi. Sunitinib è stato utilizzato come composto di prova in quanto è stato precedentemente dimostrato che influisce sul decorso dell'ADCC¹⁷. Gli sferoidi sono stati lasciati aggregare per 72 ore. Il giorno 3, 10 μg/mL di Trastuzumab (o 6,6 μg/mL TR-F(ab')₂¹⁹) equimolari e cellule NK (20:1) sono stati aggiunti agli sferoidi in presenza o in assenza di 20 μM di Sunitinib (1 ora di pre-trattamento), per un tempo totale di 24 ore. JIMT-1 da solo e JIMT-1 co-incubato con cellule NK (20:1) sono stati utilizzati come CTL. Gli sferoidi sono stati colorati con Annexin V 647 per 1 ora per rilevare la morte cellulare apoptotica e sono stati poi ripresi con un analizzatore ad alto contenuto.

Come indicato dalla colorazione con Annexin V, l'aggiunta di cellule NK insieme a Trastuzumab alle cellule JIMT-1 ha causato la morte cellulare negli sferoidi tumorali. Le cellule positive all'annessina (apoptotiche) sono emerse nella zona periferica degli sferoidi, come visibile nella Figura 3A. D'altra parte, l'aggiunta di cellule NK da sola non ha provocato l'apoptosi delle cellule tumorali. Per distinguere tra la capacità di Trastuzumab di reclutare ADCC e il suo effetto biologico diretto, TR-F(ab')₂ privo di capacità di legame funzionale con FcR è stato utilizzato come controllo negativo di Trastuzumab. Poiché TR-F(ab')₂ si è dimostrato inefficace in questo modello (Figura 3B), è probabile che l'effetto sia mediato dall'ADCC. Inoltre, il pretrattamento con Sunitinib ha ridotto la colorazione dell'annessina V negli sferoidi, confermando la resistenza all'ADCC indotta da Sunitinib e rivelando la prevenzione della morte cellulare apoptotica negli sferoidi JIMT-1 co-incubati con cellule NK e Trastuzumab.

Figura 3. Rilevamento di composti effettori ADCC in un modello sferoidale 3D. Gli sferoidi tumorali sono stati generati con cellule JIMT-1-EGFP. Dopo un tempo di incubazione di 3 giorni, gli sferoidi sono stati trasferiti su una piastra HCS, precedentemente rivestita con Pluronic F-127 per prevenire l'adesione cellulare. Il giorno successivo, 10 μg/mL di Trastuzumab (TR) (o equivalente 6,6 μg/mL TR-F(ab')₂ come CTL negativo) e NK92. Le cellule CD16 (pre-colorate con Cell Tracker Blue) sono state aggiunte ai pozzetti (rapporto E:T di 20:1), in assenza o in presenza di 20 μM di Sunitinib (SUN). Gli sferoidi JIMT-1 da soli e gli sferoidi JIMT-1 co-incubati con cellule NK (20:1) sono stati utilizzati come CTL. (A) Dopo un tempo di incubazione di 24 ore, l'annessina V 647 (colore rosso) è stata utilizzata per colorare gli sferoidi per 1 ora per visualizzare le cellule apoptotiche. (B) Sono state scattate immagini di 3 sferoidi e analizzate per l'intensità di fluorescenza dell'annessina V 647 nell'area periferica degli sferoidi (regione dell'anello). L'istogramma mostra 4 esperimenti indipendenti (medie±SEM). I dati sono stati analizzati con il test di Kruskal-Wallis seguito dal test post-hoc di Dunn (*p < 0,05, #p < 0,05, ns: non significativo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questi dati confermano che Sunitinib inibisce l'ADCC. Ci si aspetta che i composti che migliorano l'ADCC siano identificati in modo simile. In sintesi, il nostro test HCS può essere adatto per l'identificazione di composti che influenzano l'ADCC.

Figura supplementare S1. Ottimizzazione del rapporto E:T e della concentrazione di Trastuzumab. Le cellule JIMT-1-EGFP sono state utilizzate per generare sferoidi. Il giorno 3, gli sferoidi sono stati trasferiti su una piastra HCS e le cellule NK sono state aggiunte a diversi rapporti E:T (20:1, 40:1 e 60:1) con 10, 20 e 50 μg/mL di Trastuzumab (TR) per vedere quale fosse il trattamento più efficace che potesse indurre la morte cellulare negli sferoidi. Il controllo (JIMT-1-EGFP) è stato trattato con terreni di coltura cellulare JIMT-1. (A) Dopo 24 ore, le cellule sono state colorate con Annexin V 647 (colore rosso) per 1 ora e la morte cellulare apoptotica è stata misurata con HCA. Gli istogrammi mostrano 3 esperimenti indipendenti (medie±SEM). Le colonne rappresentano l'intensità dell'annessina V 647 attorno agli sferoidi JIMT-1. (B) Sono state analizzate immagini di 3 sferoidi/condizione per l'intensità dell'annessina V 647 della regione dell'anello. I dati sono stati analizzati utilizzando l'ANOVA unidirezionale seguita dal test post-hoc di Tukey (*p < 0,05, **p < 0,01, ns: non significativo). Fare clic qui per scaricare il file.

Figura supplementare S2. Valutazione dell'apoptosi cellulare JIMT-1 negli sferoidi. Le cellule JIMT-1-EGFP sono state utilizzate per generare sferoidi. Il giorno 3, gli sferoidi sono stati trasferiti su una piastra HCS e sono stati pretrattati con 20 μM di Sunitinib (SUN) per 1 ora, quindi le cellule NK sono state aggiunte con un rapporto E:T di 20:1 con 10 μg/mL di Trastuzumab. Dopo 24 ore, le cellule sono state colorate con Annexin V 647 per 1 ora e la morte cellulare apoptotica è stata misurata con HCA. Le immagini di 3 sferoidi/condizione sono state analizzate per l'intensità di Annexin V 647 (controllo: JIMT-1-EGFP, ADCC: 20:1 cellule NK + 10 μg/mL Trastuzumab, ADCC + SUN: 20 μM Sunitinib + 20:1 cellule NK + 10 μg/mL Trastuzumab). Le colonne rappresentano l'intensità dell'annessina V 647 attorno agli sferoidi JIMT-1 ( anello) (A), nell'intero sferoide (B) e nell'intero pozzo (C). Gli istogrammi mostrano 3 esperimenti indipendenti (medie±SEM). I dati sono stati analizzati utilizzando l'ANOVA unidirezionale seguita dal test post-hoc di Tukey (*p < 0,05, **p < 0,01, ns: non significativo). Fare clic qui per scaricare il file.

Discussione

Nonostante i significativi miglioramenti nel trattamento della BC negli ultimi decenni, i pazienti sviluppano ancora regolarmente resistenza ai farmaci o sperimentano effetti collaterali negativi²⁴. L'elevata morbilità e mortalità legate alla BC richiede una continua indagine sui meccanismi molecolari sottostanti, così come robuste piattaforme di screening per identificare nuove molecole utilizzabili per lo sviluppo terapeutico²⁵. Queste strategie richiedono saggi traduzionali basati su colture cellulari. I sistemi di coltura tumorale 3D, come gli sferoidi e gli organoidi tumorali, sono recentemente emersi come modelli a basso costo e facili da implementare che rappresentano aspetti chiave della fisiopatologia del tumore in modo più accurato rispetto alle colture monostrato convenzionali. Una di queste caratteristiche è l'interazione spazialmente coordinata tra varie cellule immunitarie associate al tumore e cellule tumorali. Ciò rende i modelli di co-coltura 3D strumenti superiori per lo screening dei farmaci orientati verso modulatori che agiscono sulle cellule immunitarie per il trattamento delle neoplasie maligne²⁶.

In questo lavoro, abbiamo introdotto un nuovo modello sferoidale per l'ADCC dipendente da trastuzumab mediato da cellule NK contro cellule di carcinoma mammario JIMT-1 e descritto un flusso di lavoro automatizzato di imaging e analisi per la valutazione dell'uccisione delle cellule tumorali mediate dalle cellule NK. La procedura è stata implementata per un imager ad alto contenuto e un software di analisi delle immagini che consente di monitorare la capacità delle cellule NK di indurre l'apoptosi delle cellule tumorali. L'inibitore multitarget della tirosin-chinasi Sunitinib come composto che induce resistenza all'ADCC dipendente da trastuzumab nelle cellule JIMT-1 in saggi di coltura cellulare 2D è stato precedentemente identificato. Sunitinib compromette la funzione di uccisione delle cellule NK e induce l'autofagia, la sottoregolazione dell'espressione di HER2 e migliora l'aderenza delle cellule JIMT-1¹⁷. Al fine di convalidare la nostra pipeline di analisi sferoidi per l'identificazione dei composti, abbiamo testato Sunitinib come composto modello e stiamo dimostrando che può ostacolare significativamente la capacità delle cellule NK di uccidere gli sferoidi delle cellule tumorali riproducendo l'effetto dimostrato in monostrato.

Il nostro metodo è semplice, comprende la crescita di sferoidi in piastre di coltura tissutale a 96 pozzetti rivestite di agarosio, un trasferimento una tantum degli sferoidi formati in una micropiastra con fondo di vetro adatta per applicazioni HCS e HCA, l'aggiunta di composti di prova e le cellule NK colorate separatamente attivate per uccidere mediante somministrazione di Trastuzumab, una colorazione della morte cellulare in un unico passaggio e l'analisi al microscopio. Dopo l'inizio della co-coltura dei due tipi cellulari e del trattamento farmacologico, non vengono applicate manipolazioni severe ai pozzetti per evitare di compromettere l'integrità degli sferoidi. Il test richiede solo 4 giorni per essere eseguito. Il rivestimento del fondo delle piastre di coltura tissutale a 96 pozzetti con agarosio a basso punto di fusione all'1% come parte della procedura è un'alternativa economica all'utilizzo di piastre a bassissimo attacco per evitare che le cellule JIMT-1 aderiscano alla superficie della piastra e per promuovere l'organizzazione spontanea delle cellule tumorali in sferoidi. Poiché l'acquisizione dell'immagine non è possibile attraverso il cuscino di agarosio e la superficie di plastica a forma di U, gli sferoidi dovevano essere trasferiti nella piastra ai fosfori. Fondamentale è stata la passivazione della superficie di vetro della piastra HCS con il tensioattivo bio-inerte, Pluronic-F127 prima del trasferimento dello sferoide. Senza questo passaggio, gli sferoidi si diffondono sul fondo dei pozzetti, rendendo difficile l'imaging e l'analisi.

Una linea cellulare tumorale umana che esprime stabilmente EGFP è stata utilizzata per la formazione di sferoidi¹⁷. Il marcatore geneticamente codificato offre una fluorescenza sostenuta per tutto il protocollo invece di colorazioni cellulari. L'analisi non supervisionata della tessitura del segnale EGFP fornisce la base per riconoscere il nucleo compatto degli sferoidi, che comprende l'intero sferoide senza induzione della morte cellulare. Quando sono state aggiunte cellule NK ed è stato indotto l'ADCC, la marcata disintegrazione dei contorni a volte ha rappresentato una sfida per l'algoritmo di analisi delle immagini per delineare il contorno dello sferoide. Poiché le cellule positive all'annessina V sono state trovate principalmente alla periferia degli sferoidi, questo problema è stato aggirato valutando la morte cellulare in una regione anulare periferica generata dal modulo di segmentazione delle immagini integrato nel software estendendo il nucleo sferoidale ben definito. Il fattore di espansione che definisce il confine esterno di quest'area è stato scelto per comprendere la penombra di cellule morenti, triturate e disperse in tutti i casi dopo aver curato visivamente centinaia di immagini sferoidi. La determinazione della fluorescenza totale dell'area dell'anello apoptotico nelle proiezioni massime delle immagini Z-stack ha prodotto errori sperimentali inferiori e un effetto ADCC più pronunciato rispetto alla misurazione dell'intera area dello sferoide o dell'intera area del pozzo (Figura supplementare S2). Le etichette fluorescenti sono state scelte per marcare le cellule BC (EGFP) e rilevare la morte cellulare (Alexa 647) per precludere la necessità di separazione dei canali. Si è optato per una lettura dell'end-point basata sulla marcatura fluorescente per la fosfatidilserina esposta, un marcatore apoptotico, invece di monitorare la diminuzione della fluorescenza dell'EGFP per determinare la vitalità degli sferoidi nel tempo, che potrebbe essere un'altra opzione. La colorazione con annessina ha permesso un'identificazione più accurata e sensibile della morte cellulare. In linea di principio, è possibile migliorare l'attuale approccio di colorazione unidimensionale integrandolo con marcatori di morte cellulare aggiuntivi e più precisi in grado di identificare la modalità di morte cellulare (ad esempio, substrati fluorescenti di caspasi) e il tipo di cellula perita.

Questo metodo può essere modificato con modifiche minime per studiare altri tipi di cellule immunitarie effettrici (macrofagi, cellule T e cellule immunitarie che esprimono il recettore dell'antigene chimerico [CAR]) e molecole attivatrici (ad esempio, citochine, interleuchine). Puntando alla semplicità, alla robustezza e ai brevi tempi di lavorazione, non abbiamo esaurito le possibilità che l'HCA può offrire per questo saggio. I protocolli di imaging e analisi sono suscettibili di aggiungere ulteriori etichette fluorescenti. Questo saggio è adattabile allo studio di sferoidi più complessi aggiungendo diversi tipi di cellule e utilizzando sonde fluorescenti multiplexate per distinguere tali tipi di cellule e specifici marcatori fluorescenti per collegarli agli eventi cellulari^{in corso 4,5}. Il protocollo può essere adattato a qualsiasi imager HC e le immagini possono essere analizzate con qualsiasi software di analisi delle immagini che incorpora un modulo di analisi delle texture.

Aspetto chiave dell'importanza di questo protocollo è l'uso degli sferoidi. Pertanto, è necessario considerare una serie di parametri. È noto che le cellule in coltura 3D mostrano una risposta attenuata ai composti rispetto alle cellule coltivate in monostrati^21,22. L'uso di colture cellulari 2D non consente di prevedere l'effettiva gamma di concentrazioni di un agente testato nell'intero organismo. Durante la configurazione del nostro modello 3D, abbiamo testato concentrazioni di composti e rapporti E:T più elevati rispetto a quelli riportati in 2D. Ad esempio, il protocollo è stato ottimizzato aumentando il rapporto E:T da 2:1 utilizzato nel nostro test ADCC 2D¹⁷, a 20:1 per gli sferoidi tumorali. La logica alla base di ciò potrebbe essere che i farmaci non sono stati in grado di penetrare efficacemente nel nucleo degli sferoidi e hanno colpito principalmente le cellule degli strati esterni. D'altra parte, l'aumento della concentrazione di Trastuzumab non ha ulteriormente migliorato la risposta dell'ADCC (Figura supplementare S1). Questa selezione può differire tra le linee cellulari e il bersaglio. Pertanto, sarebbe interessante testare questo protocollo su altre linee cellulari, ad esempio una linea cellulare non-HER2 BC, tenendo conto del fatto che il livello di espressione di HER2 è un importante determinante nella risposta ADCC²⁰.

In sintesi, il nostro nuovo metodo rappresenta una piattaforma rapida e robusta per analizzare l'effetto dei composti in un modello 3D di cancro immunitario con il potenziale per essere utilizzato per lo screening di farmaci ad alto rendimento. Ciò evidenzia l'importanza dell'utilizzo degli sferoidi HER2+ BC e NK92. CD16 nel migliorare ulteriormente la comprensione dei meccanismi molecolari di Trastuzumab, fornendo così l'opportunità di anticipare l'efficacia dell'ADCC Trastuzumab-dipendente nel potenziale terapeutico in vivo²⁷. La ricerca di nuovi immunomodulatori antitumorali può trarre grandi benefici da questo test. Il metodo può essere esteso a test di chemiosensibilità personalizzati di colture cellulari tumorali derivate da pazienti. Abbiamo dimostrato che le tradizionali co-colture 2D utilizzate nei test di uccisione delle cellule immunitarie e ADCC possono essere convertite in saggi sferoidi 3D, aumentando potenzialmente la loro rilevanza traslazionale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cell Carrier Ultra micropiastre	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	LLC	per la misurazione degli sferoidi
Piastre per coltura tissutale a 96 pozzetti	TPP	92096	per la semina cellulare
α-MEM terreno	Sigma	M8042	in NK
terreno Agarosio	Sigma	A9539	per la semina di sferoidi
Annexin V-Alexa Fluo 647 coniugato	Invitrogen-ThermoFisher Scientific	A23204	per la misurazione dell'apoptosi con cellule HCS
CD16.176 V.NK-92	Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA per conto di Brink Biologics, Inc. San Diego, CA)	ATCC CRL-2407	per colture cellulari
Cell Tracker Blue	Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)	C2110	per la colorazione di cellule NK
DMEM/ F-12 medium	Sigma	D8437	in JIMT1-EGFP medium
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	per il rivestimento della piastra HCS prima del trasferimento degli sferoidi
Siero fetale bovino (FBS)	Biosiero	FB-1090/500	JIMT-1-EGFP e NK medium
Glutammina	Gibco	35.050" 061	in NK medio
GraphPad Prism 8.0.1	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA		per l'analisi statistica
Software Harmony	PerkinElmer, Waltham, MA, USA		per HCA
IL-2	Proleuchina, Novartis Hungá ria Kft., Budapest, Ungheria	PHC0026	in NK medium
Insulina (Humulin R)	Eli Lilly	HI0219	JIMT-1-EGFP medium
JIMT-1 cellule di cancro			per colture cellulari
MEM Aminoacidi non essenziali (MEM-NEAA)	Gibco	11,140– 050	in NK medium
Na-piruvato	Lonza	BE13-115E	in NK medium
Opera Phenix High-Content Analysis equipment	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	HH14001000	per HCA
PBS (soluzione salina tamponata con posfato)	Lonza	BE17-517Q	per il lavaggio delle cellule
Penicillina-Streptomicina	Biosera	LM-A4118	JIMT-1-EGFP e NK medium
pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP	Invitrogen, (Prof. Jó zsef Tzsé r, Università di Debrecen)		per la linea cellulare JIMT-1-EGFP
Pluronic-F127	Sigma	P2443	per il rivestimento della piastra HCS prima del trasferimento degli sferoidi
Sunitinib malato	SigmaAldrich	PZ0012	per i trattamenti
Trastuzumab Ab (anticorpo monoclonale umanizzato anti-HER2)	Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Ungheria	NDC-63459-303-43	per i trattamenti
Trastuzumab-F(ab')2	Dono del Prof. Gyö rgy Vereb e Á rpá d Szö r	Dipartimento di Biofisica e Biologia Cellulare, Università di Debrecen	per trattamenti
Soluzione di blu di tripano 0,4%	Sigma	T8154	per la conta cellulare
Tripsina-EDTA 1X in PBS	Biosiero	LM-T1706	per il distacco di cellule