Il test Active Place Avoidance (APA), un compito di apprendimento spaziale efficace, versatile e ripetibile per i topi

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per il test di evitamento del luogo attivo, un paradigma di apprendimento spaziale dipendente dall'ippocampo progettato per i roditori. La modifica dei parametri chiave consente di ripetere i test sugli animali prima e dopo i trattamenti o nel tempo.

Abstract

L'apprendimento spaziale dipendente dall'ippocampo nei roditori è stato testato utilizzando una varietà di metodi. Questi includono il labirinto d'acqua di Morris (MWM), il labirinto a Y e le attività di localizzazione di nuovi oggetti (NOL). Più recentemente, l'attività di evitamento attivo del luogo (APA) è stata sviluppata come alternativa a questi approcci più tradizionali. Nel compito APA, i topi devono utilizzare segnali spaziali posizionati attorno a un'arena rotante per evitare una zona d'urto stazionaria. A causa dei molteplici parametri che possono essere regolati, l'attività APA si è dimostrata un approccio molto versatile. Si presta ad essere utilizzato longitudinalmente e ripetutamente per la stessa coorte di topi. Qui forniamo un protocollo dettagliato per condurre con successo l'attività APA. Evidenziamo anche approcci APA alternativi che possono essere utilizzati per esaminare diverse componenti dell'apprendimento spaziale. Descriviamo i processi di raccolta e analisi dei dati. Vengono discussi i passaggi critici durante l'attività APA per aumentare la probabilità di condurre con successo il test. L'attività APA presenta diversi vantaggi rispetto ai test di navigazione spaziale più tradizionali. È appropriato da usare con topi anziani o con fenotipi di malattia come il morbo di Alzheimer. La complessità del compito può essere facilmente modificata, consentendo di testare un'ampia gamma di ceppi di topi. Inoltre, l'attività APA è adatta per testare animali che hanno subito interventi chirurgici o sperimentali che potrebbero aver influenzato la funzione motoria o neurale, come ictus o lesioni cerebrali traumatiche.

Introduction

L'evitamento attivo del luogo (APA) è uno strumento efficace per testare l'apprendimento spaziale dipendente dall'ippocampo nei roditori 1,2,3,4. Durante l'attività APA, l'animale viene posizionato su un'arena rotante e deve utilizzare segnali visivi per orientarsi ed evitare una zona di shock avversiva⁵. La rotazione dell'arena assicura che il mouse non sia in grado di utilizzare un approccio idiotetico per la navigazione, né possono essere utilizzati segni di odore, poiché questi segnali ruotano sulla piattaforma mentre la zona d'urto rimane ferma⁵. L'alterazione della velocità e della direzione dell'arena, nonché della posizione della zona d'urto e dei segnali visivi, consente di ritestare i topi più volte ^6,7,8. L'APA offre diversi vantaggi distinti rispetto al labirinto d'acqua di Morris (MWM), uno dei test di apprendimento spaziale più utilizzati. È importante sottolineare che i topi hanno un'avversione per il nuoto e trovano il compito MWM estremamente stressante⁹. Inoltre, è stato segnalato che i topi anziani galleggiano durante il compito^{MWM 10}, rendendolo inadatto come compito di apprendimento spaziale in molti casi. Inoltre, poiché l'attività MWM richiede una piattaforma nascosta e sommersa che i topi possano localizzare durante i test. Ciò richiede che l'acqua sia opaca, che in genere si ottiene tramite l'aggiunta di vernice bianca. Il monitoraggio e l'analisi degli animali durante i compiti comportamentali richiedono un contrasto sufficiente tra il soggetto e l'ambiente circostante, escludendo alcuni ceppi di topi come Swiss o BALB/c dall'essere testati nel MWM. Nell'attività APA, questo problema viene aggirato attraverso l'aggiunta di plastica nera sotto la griglia.

Diversi paradigmi APA sono stati progettati per testare l'apprendimento spaziale, dimostrando la sua utilità come strumento comportamentale efficace. Ad esempio, l'acquisizione, la conservazione e il consolidamento dell'apprendimento spaziale sono in genere realizzati mediante test giornalieri sugli animali che possono variare da 3-5 giorni 6,7,11,12. La memoria e l'apprendimento sono quantificati confrontando il numero di shock ricevuti ogni giorno di acquisizione. Anche il tempo al primo ingresso e il tempo massimo per evitare la zona d'urto sono parametri importanti che possono essere utilizzati per determinare i cambiamenti nella capacità di apprendimento durante l'attività. In alternativa, la memoria di lavoro spaziale può essere testata conducendo una singola sessione APA di 30 minuti ^2,13 in cui l'apprendimento spaziale viene misurato come cambiamenti all'interno della sessione confrontando le prestazioni, come il numero di shock, in contenitori di 5 minuti.

In questo articolo, descriviamo l'attività APA ed evidenziamo le caratteristiche chiave che devono essere considerate quando si conduce questo test di apprendimento spaziale.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato etico animale dell'Università del Queensland secondo le linee guida del National Health and Medical Research Council of Australia (numero di approvazione: QBI/189/15).

1. Configurazione della sala APA

NOTA: L'apparato APA comprende un'arena sopraelevata con un pavimento a griglia metallica racchiuso da un confine circolare trasparente alto 32 cm. Le barre metalliche sono equidistanti (0,5 cm l'una dall'altra) e hanno un diametro di 0,3 cm.

1. Assicurarsi che l'apparecchio APA si trovi all'interno del telaio della telecamera montato sul soffitto. Traccia il mouse utilizzando il software di tracciamento degli animali disponibile in commercio.
2. L'arena APA ruota generalmente a una velocità di 1 giri/min e all'interno dell'arena rotante è impostata una zona d'urto stazionaria di 60° predesignata. Quando il mouse entra nella zona d'urto, erogare un leggero shock del piede di 0.5 mA (60 Hz, 500 ms).
3. Assicurarsi che la posizione della zona d'urto rimanga costante durante il test e sia impostata elettronicamente all'interno della configurazione sperimentale. L'arena rotante porta il mouse nella zona d'urto a meno che il mouse non si muova attivamente per evitarlo.
4. Posiziona quattro nuovi segnali visivi su quattro diverse pareti della stanza alla stessa altezza della piattaforma rotante, in genere a 30-50 cm di distanza dall'arena. Assicurati che i segnali siano colori neutri, come simboli o forme in bianco e nero stampati su carta A3 e laminati per una facile pulizia (Figura 1A).
5. Assicurati che l'intensità della luce della stanza sia compresa tra 30 e 70 Lux. L'aumento dell'intensità della luce induce un comportamento simile all'ansia e riduce l'esplorazione.
6. Prima di iniziare, apri il programma Tracker e seleziona l'attività APA.
7. In Opzioni per Tracker 2D, seleziona la scheda Esperimento . Qui, assicurati che sia selezionata l'opzione Evita luogo - Solo un fotogramma - Posizione . Ciò consentirà di configurare i parametri richiesti. Salvare il file di configurazione e modificarlo in base alle esigenze.
8. Nella scheda Esperimento impostare la durata dell'esperimento nella casella Tempo esperimento . La durata tipica dell'esperimento è di 600 s o 10 minuti.
9. Assicurati che l'opzione Abilita timer sia selezionata. Modificare i parametri di shock nella regione Timer come discusso sopra.
10. Immettere i dettagli sperimentali comuni nello spazio fornito nell'area Cornice locale della scheda Esperimento . Ad esempio, assicurarsi che il nome del file di output predefinito sia popolato con la data, un identificatore sperimentale semplice e il giorno del test. Terminare il nome con un carattere di sottolineatura "_" per consentire l'aggiunta di un ID mouse univoco durante l'esperimento.
11. Nella regione Cornice locale si trova anche la scheda Obiettivi . Fai clic sul pulsante Modifica per garantire che l'intera arena sia inclusa nella regione di interesse. Quindi, selezionare Arco per fornire i parametri regolabili per le dimensioni e la posizione della zona target dell'urto (Figura 1B).
12. Apri la scheda Tracciamento per regolare i parametri per garantire il corretto tracciamento dei mouse. La casella di contrasto ha opzioni Scuro o Chiaro per consentire sia mouse scuri (ad esempio, C57Bl/6) che chiari (ad esempio, BALB/c). Questo crea un contrasto efficace tra lo sfondo e i topi. Quando si utilizzano ceppi di topi albini, posizionare un pezzo di plastica nera sotto l'arena per consentire di ottenere questo contrasto (Figura 2).
13. Impostare le dimensioni dei mouse e gli intervalli di area in questa regione. Imposta questi parametri per riconoscere efficacemente il mouse quando sei nell'arena. In alternativa, impostarli dopo aver premuto il pulsante Da calibratore .
14. Seleziona il pulsante Da calibratore per assicurarti che l'arena sia completamente nella maschera della regione di interesse.
    1. Avvia l'arena in questa scheda per assicurarti che quando l'arena ruota, l'arena rimanga nella maschera. Questa scheda è fondamentale anche per selezionare la soglia di contrasto appropriata. Spostare la linea rossa nel riquadro Soglia per regolare la soglia di contrasto.
       NOTA: La Figura 3A mostra una selezione di soglia ottimale, come evidenziato da una regione arancione continua e da una "X" blu dove si trova il mouse. Una soglia scarsa è mostrata nella Figura 3B e mostra solo arancione maculato e nessuna "X".
15. Usa la scheda Dispositivi e imposta la direzione di rotazione e la velocità dell'arena usando il pulsante della velocità. Selezionare le velocità positive e negative, che rappresentano le rotazioni in senso orario e antiorario. Impostare l'intensità dell'urto nella sezione Sorgente corrente . L'impostazione più comune per i mouse è la rotazione di 1 rpm e uno shock di 0,5 mA.
16. Modificare come o quando erogare gli shock nella scheda Origine corrente .
    1. Assicurarsi che la modalità corrente sia selezionata su Traccia dipendente. Ciò fornirà una scossa elettrica quando il mouse si sposta nella zona di shock.
    2. Selezionare Tempo per emettere scosse a un intervallo di tempo impostato dall'utente. Usa le tracce registrate in precedenza per scuotere un mouse selezionando Da file. Questo per fornire un topo di controllo aggiogato sottoposto a un numero identico di scosse alla stessa durata e intensità indipendentemente dall'apprendimento spaziale.
       NOTA: Le schede Output file e Finestra consentono di salvare dati e file video in una directory specifica. Il pulsante Da immagine all'interno della scheda Output file consente inoltre di selezionare la regione di interesse per catturare l'intera arena.
17. Ritirati dietro la tenda e inizia il processo. La presenza dello sperimentatore vicino all'arena e qualsiasi rumore non necessario può influire sulle prestazioni dell'animale.
18. Assicurati che qualsiasi rumore e odore siano limitati durante la prova, il che può fornire al mouse un altro spunto, influenzando le sue prestazioni. Esempi per ridurre al minimo questo problema includono la garanzia di un cestino dei rifiuti clinici chiuso, l'utilizzo di stanze rimosse da spazi di laboratorio rumorosi e la pulizia accurata dell'attrezzatura tra i topi. I ricercatori possono prendere in considerazione l'utilizzo del generatore di rumore bianco per mascherare rumori esterni non correlati.
19. Lascia che la lettiera della gabbia domestica rimanga la stessa per tutto il periodo di test comportamentale, in quanto ciò potrebbe fornire nuovi stimoli e influenzare il comportamento.
20. Per evitare variazioni diurne, eseguire il test ogni giorno a un'ora costante.

2. Abitudine alla manipolazione dello sperimentatore

1. Maneggiare ogni mouse ogni giorno per 30 s a 1 minuto per almeno 2-3 giorni prima del test. La manipolazione degli animali riduce significativamente lo stress e il comportamento legato all'ansia durante i test.
2. Usa lo stesso camice da laboratorio ed evita di indossare deodoranti forti, colonie o profumi durante l'assuefazione e il test.

3. Abituazione all'arena APA (1 giorno)

1. Porta il mouse nell'anticamera o nella sala prove per l'assuefazione. Lasciare che il mouse si abitui per un minimo di 30 minuti. Imposta l'intensità della luce nell'anticamera o nella sala di prova prima che i topi vengano portati ad abituarsi.
2. Configura il software Tracker.
   1. Crea una cartella specifica per l'esperimento. A seconda del paradigma sperimentale, avere cartelle separate per ogni giorno o prova. Configura le configurazioni dell'esperimento come descritto sopra e salva queste configurazioni per utilizzarle in futuro.
   2. Prima di iniziare una versione di prova, aprire la configurazione salvata facendo clic sulla scheda File , quindi fare clic sul simbolo Salva , aggiungere un ID mouse univoco nella finestra appena aperta ed eseguire la versione di prova premendo la scheda Riproduci .
3. Abituare il mouse all'apparato APA esponendolo all'arena rotante per 5 minuti senza erogare scosse.
4. Rimuovi il topo dalla gabbia di casa sollevandolo dalla base della coda e posizionandolo delicatamente sulla mano guantata. Trasportare il mouse sull'apparecchio APA e posizionarlo lontano dalla zona d'urto, rivolto verso il muro.
5. Ritirati dietro la tenda e inizia il processo.
6. Al termine del test, rimuovere il topo e tornare alla gabbia di casa.
7. Raccogliere tutta l'urina e gli escrementi e pulire accuratamente la griglia con etanolo all'80% (v/v).
8. Ripeti i passaggi 3.4-3.7 per tutti i topi.

4. Formazione all'acquisizione con APA (1-6 giorni)

1. Impostare l'illuminazione della stanza su condizioni identiche a quelle del giorno di assuefazione.
2. Porta il mouse nell'anticamera o nella sala prove e lascialo abituare per un minimo di 30 minuti.
3. Configura il software Tracker come descritto sopra.
4. Impostare la durata della versione di prova.
5. Assicurarsi che la sorgente di corrente sia accesa e impostata (ad es. 0.5 mA).
6. Posiziona il mouse sull'arena lontano dalla zona di shock e di fronte al muro.
7. Ritirati dietro la tenda e inizia la prova premendo il pulsante Riproduci . Monitorare il mouse sullo schermo del computer e intervenire se necessario. Ad esempio, il topo non riceve scosse o appare eccessivamente stressato, come evidenziato da salti o vocalizzi eccessivi.
8. Al termine del test, rimuovere il topo e tornare alla gabbia di casa.
   NOTA: Assicurati che i mouse ricevano e reagiscano agli urti. I topi rispondono allo shock indietreggiando e vocalizzando. In caso contrario, potrebbero non ricevere la scossa. Ciò potrebbe essere dovuto a scat sulla griglia o a un tracciamento inadeguato. Pertanto, è essenziale pulire la griglia dopo ogni prova e ottimizzare il tracciamento del mouse, come discusso sopra.

5. Formazione sull'acquisizione dell'inversione (opzionale, 1-6 giorni)

1. Nell'attività di inversione, riposizionare la zona d'urto in una nuova posizione, generalmente a 180° dalla posizione precedente. Valuta la capacità del topo di apprendere in modo flessibile una nuova posizione della zona d'urto. I segnali della stanza in genere non vengono modificati durante l'apprendimento inverso.
2. Ripeti i passaggi 3.4-3.7 per tutti i topi.

6. Prova della sonda (opzionale, 1 giorno)

1. Nella prova della sonda, misurare il tempo al primo ingresso e/o il tempo massimo evitando la zona d'urto.
   NOTA: Indica il consolidamento della memoria dopo la fase di acquisizione. Un topo ben addestrato eviterà di entrare nella zona d'urto per un periodo prolungato (>60 secondi), mostrando segni di apprendimento spaziale.
2. Impostare l'intensità della luce della stanza come il giorno della formazione di acquisizione.
3. Abituare il mouse nella sala prove o nell'anticamera per 30 minuti.
4. Configura il software Tracker.
5. Impostare la durata della prova sullo stesso tempo del periodo di prova precedentemente condotto (ad esempio, 10 minuti o 30 minuti, a seconda dei parametri della prova).
6. Non erogare shock per questa prova.
7. Posiziona il mouse sul lato opposto della zona di urto avversivo, rivolto verso il muro.
8. Inizia la prova e ritirati dietro le quinte.
9. Assicurati che il mouse sia tracciato in modo efficiente.
10. Monitorare il mouse sullo schermo del computer e interrompere la prova quando entra nella zona d'urto. Alcuni ricercatori preferiscono continuare la prova per 5 minuti per vedere se il topo continua a tornare nella zona d'urto.
11. Prendi delicatamente il topo e torna alla gabbia di casa.
12. Assicurarsi che tutta l'urina e gli escrementi siano raccolti e che la griglia sia accuratamente pulita con etanolo all'80% (v/v).

7. Analisi della traccia

NOTA: L'esecuzione dell'attività può essere ottenuta tramite diversi software di tracciamento. Di seguito è riportato il modo in cui il software incluso viene utilizzato per determinare le prestazioni durante l'attività APA. In questo caso, i dati vengono analizzati utilizzando il programma Track Analysis .

1. Per analizzare i dati, aprire il programma Track Analysis e selezionare Evitamento dal menu a discesa nella finestra principale.
2. Clicca su Aggiungi attività per caricare in una nuova finestra i file di dati salvati durante la fase di acquisizione. In Nome gruppo, creare un gruppo da analizzare, ad esempio il giorno 1 o l'ora dell'analisi.
3. Fare clic sulla directory di output per selezionare la posizione in cui salvare i dati analizzati.
4. Aggiungere i file da analizzare facendo clic sulla scheda Aggiungi file e selezionando i file dall'unità locale.
5. Impostare l'ora da analizzare facendo clic sulla scheda Imposta ora . Ciò fornisce la possibilità di definire il periodo che verrà analizzato, ovvero da 0 a 600 s. In alternativa, analizza i dati in contenitori, cioè 60 s.
6. Una volta aggiunte tutte le tracce, fare clic sulla scheda Analisi e selezionare Esegui analisi per analizzare i dati. L'analisi produrrà diverse cartelle. I dati per l'analisi si troveranno nella cartella TBLfiles . Apri questi file di dati in un foglio di calcolo e usali per ulteriori analisi, ad esempio confronto a coppie o misure ripetute ANOVA.
   NOTA: L'analisi produrrà anche altre cartelle, inclusi i file PS che avranno una descrizione di una singola pagina dei topi durante il test, mostrando una mappa di traccia e dove sono stati ricevuti gli shock.

Results

I topi con capacità di apprendimento spaziale intatta mostreranno una diminuzione del numero di shock durante le successive prove di acquisizione (Figura 4A). Allo stesso modo, il tempo massimo per evitare la zona d'urto aumenterà man mano che il mouse impara ad allontanarsi con successo dalla zona d'urto (Figura 4B). Tuttavia, i topi che non sono in grado di apprendere una strategia di evitamento efficace mostreranno un numero costante di shock per ogni prova di acquisizione (Figura 4A). Spesso, i topi che non riescono a identificare la zona d'urto riceveranno più shock durante ogni ingresso nella zona. Le mappe di traccia sono utili per fornire esempi di topi che imparano a evitare la zona d'urto (Figura 4C) e quelli che non sono in grado di evitare la zona d'urto (Figura 4D). In entrambi i casi, queste mappe di traccia rappresentano l'ultimo giorno di acquisizione. Il topo nella Figura 4C ha ricevuto solo 2 urti, come rappresentato dai due cerchi. Inoltre, si noti che la mappa di traccia mostra il mouse che trascorre la maggior parte del tempo sul lato opposto della zona d'urto rappresentata dal cuneo rosso. Al contrario, il topo nella Figura 4D ha ricevuto più urti e la mappa di traccia rivela uno schema disordinato. Esempi di topi che non sono in grado di imparare con successo a evitare la zona di shock sono quelli che hanno una ridotta neurogenesi ippocampale a causa dell'età avanzata, come mostrato dai topi di 18 mesi (Figura 4A, B- modificata da Blackmore et al., 2021⁷), dell'ablazione chimica dei neuroni immaturi⁶ o delle lesioni ippocampali (vedi Codd et al., 2020)⁸.

È importante distinguere tra una prova non riuscita a causa del mancato apprendimento del mouse e un errore nella configurazione dell'apparecchiatura. Le due cause più comuni di scarsi risultati dovuti a guasti alle apparecchiature sono lo scarso tracciamento del mouse (Figura 5A) o il mouse che non riceve uno shock. Un tracciamento scadente può impedire al mouse di ricevere uno shock quando si trova nella zona di shock. In alternativa, un tracciamento scadente può indurre in modo impreciso uno shock quando il mouse non è nella zona. In entrambi i casi, ciò impedirà al topo di sviluppare un'efficace strategia di evitamento. Lo scarso tracciamento può essere risolto regolando la soglia nella scheda "Da calibratore". Un tracciamento scadente è in genere definito come più di 1000 fotogrammi errati durante un periodo di 10 minuti e si verifica molto raramente. Uno scarso monitoraggio può diventare un problema con i topi anziani, dove può svilupparsi l'alopecia. Quando riceve una scossa, il topo reagirà tendendo o, a volte, vocalizzando. Il mouse in genere si muove, anche se leggermente, e può essere visto sul software di monitoraggio in tempo reale. Quando il mouse rimane perfettamente fermo all'interno della zona d'urto, verrà mostrata una chiara linea di urti (Figura 5B). Ciò può essere dovuto al fatto che la scatola dello shock non è accesa o che gli escrementi sono rimasti bloccati tra le barre, riducendo l'ampiezza dello shock erogato all'animale.

Figura 1: Apparato APA, stanza comportamentale e impostazione della zona d'urto. (A) Un esempio dell'arena di prova e della configurazione della stanza. L'apparato APA è rialzato e posizionato al centro della stanza, circondato da nuovi segnali visivi. I segnali visivi in bianco e nero vengono utilizzati alla stessa altezza della piattaforma. (B). La funzione Bersaglio all'interno della scheda Esperimento consente di mascherare l'intera arena e crea una posizione della zona di shock. In questo esempio è stata creata una zona d'urto, rappresentata dal cuneo rosso, a 270°. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Configurazione APA per ceppi di topi albini. L'arena APA può essere impostata per ceppi di topi albini, come BALB/c, selezionando l'opzione Luce nella scheda Tracciamento e creando uno sfondo nero dell'arena. Un topo albino su sfondo nero raggiunge un contrasto elevato e offre un migliore tracciamento del mouse. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: La regolazione della soglia per il tracciamento del mouse è essenziale. La soglia deve essere opportunamente regolata per garantire una buona tracciabilità degli animali durante la prova. La soglia viene regolata spostando la linea rossa nel riquadro della soglia nella scheda Da calibratore . (A) Un esempio di una buona selezione di soglia con una regione arancione continua e una X blu sull'oggetto. (B) Una soglia scarsa con arancione maculato. Un tracciamento scadente porta alla perdita di un animale nell'arena o impedisce al topo di ricevere una scossa quando si trova nella zona di shock. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto delle prestazioni tra topi giovani (10 settimane) e più anziani (18 mesi) su un paradigma di apprendimento di 5 giorni e mappe Trace. (A) I topi di 10 settimane hanno ricevuto significativamente meno shock rispetto ai topi di 18 mesi durante 5 giorni di test; Si noti che la differenza nel numero di shock ricevuti era minima il primo giorno di test tra i gruppi, ma i topi giovani con memoria intatta hanno imparato a evitare l'ingresso nella zona di shock più rapidamente rispetto al gruppo più anziano. (B) Il tempo massimo di evitamento è stato calcolato come il tempo massimo impiegato per evitare lo shock durante la prova di 10 minuti. I topi più giovani hanno imparato rapidamente a evitare l'ingresso nella zona d'urto rispetto ai topi più anziani, suggerendo che i topi giovani stanno imparando in modo efficace. (C) Il topo in questa mappa di traccia ha ricevuto solo due shock, come rappresentato dai due cerchi in questa prova di acquisizione. Questo topo ha anche trascorso più tempo nell'arena opposta alla zona d'urto, che è rappresentata dal cuneo rosso. (D) Questo topo ha ricevuto più shock e ha trascorso più tempo vicino alla zona d'urto, suggerendo che l'apprendimento spaziale non è stato raggiunto in questo topo. Per testare la significatività sono stati utilizzati ANOVA a due vie e ripetute con test post hoc di Bonferroni. pag<0,0001. I pannelli A e B sono stati modificati da Blackmore et ^al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Le mappe di traccia forniscono informazioni importanti per ciascun mouse durante ogni prova. (A) Notare le linee rette presenti in questo esempio di tracciamento. Ciò è dovuto al fatto che il software di tracciamento identifica erroneamente un mouse durante l'attività. (B) Un esempio di buon monitoraggio durante il processo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Visualizzazione delle tracce e mappa di calore su diversi programmi di tracciamento degli animali. Sia (A) Programma 1 che (B) Programma 2 rilevano la posizione e il movimento dell'animale per creare tracciati per ispezionare visivamente se l'animale apprende il compito o l'effetto del trattamento sperimentale. Entrambi i programmi mostrano tracciati identici di un animale che ha imparato il compito in modo efficiente. (C) È inoltre possibile creare una mappa di calore che facilita l'identificazione degli hotspot e il clustering dei punti dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

In conclusione, il test di evitamento del luogo attivo è un compito di apprendimento spaziale efficace che può essere utilizzato su una varietà di ceppi di topi e condizioni sperimentali. Il compito APA supera i limiti associati ad altri paradigmi di apprendimento spaziale¹⁴, come il MWM, che è stressante per i topi misurato dai livelli di cortisolo⁹. Il MWM non è adatto anche per i topi anziani, dove è stato segnalato che galleggiano durante il compito¹⁰. Sebbene altri test di apprendimento spaziale, come il labirinto di Barnes e il nuovo test di localizzazione degli oggetti, siano meno stressanti, sono limitati dalla frequenza con cui i test ripetuti possono essere condotti sulla stessa coorte di topi. Pertanto, il vantaggio principale dell'attività APA è che può essere utilizzato più volte poiché diversi parametri possono essere regolati per mantenere la novità. In effetti, abbiamo utilizzato il compito APA fino a 5 volte sulla stessa coorte di topi per esaminare l'effetto dell'ablazione ippocampale e il successivo effetto dell'esercizio⁸. In ogni caso, i parametri, tra cui la rotazione dell'arena, la zona d'urto e i segnali spaziali, sono stati alterati tra i test. Ciò è stato efficace nel garantire che i topi utilizzassero segnali di navigazione spaziale per riapprendere il compito, come evidenziato dagli animali di controllo che iniziavano con un numero elevato di shock e poi diminuivano durante i giorni di test successivi per ogni periodo di test⁸. In genere, alla fine di un paradigma di test di 5 giorni, consideriamo che qualsiasi animale che ha ricevuto più di 10 shock l'ultimo giorno o ha un evitamento massimo inferiore a 60 s non ha imparato il paradigma.

Oltre alla possibilità di modificare facilmente le impostazioni per consentire più cicli di test spaziali, l'attività APA garantisce che i topi debbano utilizzare la navigazione spaziale per evitare efficacemente la zona d'urto. Ad esempio, gli animali devono utilizzare segnali esterni per localizzare ed evitare di entrare nella zona d'urto stazionaria allontanandosi da essa⁵. Poiché l'arena ruota, gli animali non sono in grado di utilizzare un approccio idiotetico per la navigazione, né possono utilizzare segnali esterocettivi come l'odore perché questi segnali ruotano con l'arena mentre la zona di shock e i segnali spaziali rimangono stazionari⁵.

È anche importante assicurarsi che i topi siano adeguatamente abituati al ricercatore e all'arena APA. Anche l'intensità dello shock del piede deve essere ottimizzata, poiché sia un'intensità di shock troppo bassa che troppo alta possono compromettere la capacità dei topi di apprendere ed eseguire il compito⁵. L'intensità dell'urto è generalmente impostata su 0,5 mA e non deve superare 0,7 mA. Per gli animali che hanno un comportamento simile all'ansia aumentato, considera di ridurre sia l'intensità della luce che l'intensità dello shock del piede. L'aumento dell'ansia durante l'attività APA può presentarsi come salti eccessivi, corsa incontrollata all'interno dell'arena o congelamento prolungato. Il protocollo qui descritto utilizzava un'intensità di shock di 0,5 mA, la stessa intensità che è stata precedentemente utilizzata con BALB/c, che è noto per avere un comportamento simile all'ansia più elevato¹⁵.

Qui, descriviamo il software di tracciamento degli animali fornito dall'azienda che ha fornito l'impianto di evitamento del luogo attivo utilizzato. Il software di tracciamento video alternativo è adatto anche per analizzare le prestazioni comportamentali. Questi programmi possono anche misurare e analizzare con precisione le prestazioni del mouse durante le attività APA. Questi programmi consentono la creazione di diverse zone e luoghi all'interno dell'arena APA per valutare il comportamento. L'ambientazione dell'arena per un APA consiste in una zona d'urto triangolare, dove vengono misurati il numero di ingressi, il tempo per entrare per la prima volta e il tempo trascorso nella zona d'urto. È inoltre possibile aggiungere altre zone all'interno dell'arena. Ad esempio, possiamo aggiungere una zona centrale o una zona opposta alla zona d'urto per misurare il tempo trascorso e la distanza percorsa in quelle zone come strategia animale per evitare la zona avversiva. Questi programmi tracciano il centro di massa del mouse, che viene quindi salvato e visualizzato sopra il piano di riferimento per l'ispezione visiva (Figura 6A, B). Infine, è anche possibile creare una mappa di calore della densità per le prestazioni individuali e di gruppo (Figura 6C).

Quando si svolge l'attività APA, ci sono potenziali problemi che devono essere affrontati. A volte, i topi dovranno essere esclusi dall'analisi a causa della mancata risposta alla zona d'urto. Come sempre, l'esclusione dovrebbe essere presa in considerazione solo quando soddisfano condizioni anomale predefinite, ad esempio non rientrando in 2 deviazioni standard dalla media. Compiti comportamentali complessi come l'APA richiedono in genere alti valori di N degli animali. Suggeriamo di condurre un'analisi della potenza per calcolare la dimensione del campione appropriata prima di condurre l'APA. Ciò dipenderà dal ceppo utilizzato e dai gruppi di trattamento. Dall'esperienza, troviamo che un valore n di 10 o più per ciascun gruppo fornisce potenza sufficiente quando si conducono esperimenti APA. Il problema principale di questa attività è garantire un tracciamento di alta qualità del mouse durante l'attività. La fase di assuefazione del compito dovrebbe essere utilizzata per confermare che ciò si sta verificando. I topi che non rispondono a uno shock sono spesso dovuti allo scat tra le barre della griglia. È quindi essenziale pulire il rig dopo ogni animale e rimuovere eventuali escrementi o urina. Ciò ridurrà anche lo stress per gli animali che seguono. L'attività APA prevede in genere un paradigma di 5 giorni, che può presentare alcune limitazioni per gli studi che prevedono interventi efficaci meno di 5 giorni; tuttavia, la memoria a breve termine o l'acquisizione dell'apprendimento spaziale possono ancora essere valutate per tali studi utilizzando l'approccio di 30 minuti in una singola sessione.

In sintesi, questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di come impostare e utilizzare il paradigma di evitamento del luogo attivo per testare l'apprendimento spaziale dei topi. La capacità di modificare le condizioni in modo da poter testare più ceppi di topi di colore variabile è un netto vantaggio rispetto ad altri test spaziali più tradizionali come il MWM. Inoltre, la modifica di più parametri consente di ripetere i test in modo che i cambiamenti nell'apprendimento spaziale possano essere accuratamente confrontati durante vari paradigmi sperimentali o durante l'invecchiamento fisiologico. In un breve periodo di tempo, il test APA ha dimostrato di essere un'alternativa accurata ed efficace per l'apprendimento spaziale dipendente dall'ippocampo. In futuro, il compito APA può essere utilizzato come metodo affidabile per valutare gli interventi terapeutici o di esercizio sul comportamento cognitivo e spaziale sia nei topi wild-type che in quelli transgenici.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sorgente di corrente costante CS02	Gruppo BioSignal	N/A	Acton, Massachusetts, Stati Uniti
Scatola di controllo	Gruppo BioSignal	N/A	Acton, Massachusetts, Stati Uniti
Visione elettronica	Noldus	Versione 16	Wageningen, Paesi Bassi
Scrambler d'urto	Gruppo BioSignal	N/A	Acton, Massachusetts, Stati Uniti
Analisi delle tracce	Gruppo BioSignal	Versione 2.2	Acton, Massachusetts, Stati Uniti
Programma Tracker	Gruppo BioSignal	Versione: 2.36	Acton, Massachusetts, Stati Uniti