Rilevamento in tempo reale dell'affinità dinamica tra biomolecole utilizzando la tecnologia SPR (Surface Plasmon Resonance)

Summary

Il presente studio mira a chiarire il principio e la metodologia della tecnologia di risonanza plasmonica di superficie (SPR), che trova applicazioni versatili in più domini. Questo articolo descrive la tecnologia SPR, la sua semplicità operativa e la sua notevole efficacia, con l'obiettivo di promuovere una più ampia consapevolezza e adozione di questa tecnologia tra i lettori.

Abstract

La tecnologia di risonanza plasmonica di superficie (SPR) è un metodo sensibile e preciso per rilevare virus, proteine molecolari patogene e recettori, determinare i gruppi sanguigni e rilevare l'adulterazione degli alimenti, tra le altre rilevazioni biomolecolari. Questa tecnologia consente la rapida identificazione del potenziale legame tra le biomolecole, facilitando uno screening rapido, facile da usare e non invasivo di vari indicatori senza la necessità di etichettatura. Inoltre, la tecnologia SPR facilita il rilevamento in tempo reale per lo screening dei farmaci ad alto rendimento. In questo programma vengono brevemente introdotti il campo di applicazione e i principi di base della tecnologia SPR. Il processo operativo è descritto in dettaglio, a partire dalla calibrazione dello strumento e dal funzionamento di base del sistema, seguito dalla cattura del ligando e dall'analisi multiciclo dell'analita. Sono stati elaborati la curva in tempo reale e i risultati sperimentali del legame tra quercetina e calicosina e proteina KCNJ2. Nel complesso, la tecnologia SPR fornisce un metodo altamente specifico, semplice, sensibile e rapido per lo screening dei farmaci, il rilevamento in tempo reale della farmacocinetica correlata, il rilevamento di virus e l'identificazione ambientale e di sicurezza alimentare.

Introduction

La tecnologia di risonanza plasmonica di superficie (SPR) è una tecnica di rilevamento ottico che elimina la necessità di marcare l'analita. Consente il monitoraggio dinamico e in tempo reale dell'affinità quantitativa di legame, della cinetica e della termodinamica. Questa capacità di produzione elevata è altamente sensibile e riproducibile, consentendo la misurazione di vari tassi di apertura, velocità di spegnimento e affinità. Inoltre, la piccola quantità di campione richiesta aumenta ulteriormente l'utilità di questo metodo ^1,2. Il metodo di rilevame....

Protocol

NOTA: La curva di rilevamento sperimentale completa indica che il processo sperimentale può essere classificato in otto fasi distinte.

1. Preparazione del campione e del tampone

1. Preparare i chip del sensore prima dell'esperimento.
   1. Trattare le patatine con la soluzione piranha (30% H₂O₂: H₂SO₄=1:3; v/v) per 2 min. Successivamente, pulire accuratamente il chip con una grande quantità di acqua deionizzata e poi immergerlo in etanolo anidro, lasciandolo asciugare naturalmente.
   2. Successivamente, immergere il chip per una....

Results

Per determinare se la proteina è fissata sulla superficie del chip, viene utilizzata l'ordinata (segnale di risposta) della mappa del sensore SPR (Figura 1), mentre si ottiene lo spostamento angolare della curva SPR. La Figura 2 e la Figura 3 illustrano la curva SPR dell'interazione tra quercetina e calicosina con la proteina ricombinante KCNJ2 sulla superficie immobilizzata della proteina ricombinante KCNJ2 dopo la riduzione di con.......

Discussion

Il ciclo di analisi SPR è suddiviso in quattro fasi. La prima fase, la linea di base, prevede l'iniezione del tampone. Segue la seconda fase, la cattura del ligando. Il chip del sensore COOH viene attivato con EDC/NHS (1:1) a una portata di 20 μL/min. Il chip viene quindi disattivato utilizzando 1 M di etanolammina cloridrato-NaOH a una velocità di flusso di 20 μL/min. Passando alla terza fase, il metodo dell'analita multiciclo. L'analita viene iniettato nel canale a una velocità di flus.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) cloridrato di carbodiimmide (EDC)	Nan Jing Reagent, Nanjing, Cina	C08296594
Etanolo anidro	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, Cina	459836
Soluzione di normalizzazione BIA	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, Cina	49781
Soluzione di blocco	Bosheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Cina	110050
Acido bromoacetico	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, Cina	17000
Calycosin	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, Cina	PU0124-0025
Dextran	Canspec Scientific Instruments Co., Ltd., Shanghai, Cina	PM10036
Epicloridrina	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, Cina
Etanolammina cloridrato	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, Cina	S44235
Glycine-HCl	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, Cina	G2879
H2O2	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, Cina	3587191
H2SO4	Nantong high-tech Industrial Development Zone, Cina	2020001150C
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, Cina	S3872
KCNJ2 (Umano) Proteina ricombinante	Abnova, West Meijie Technology Co., Ltd., Pechino, Cina	H00003759-Q01
MUOH	Jizhi Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina	M40590
NaOH	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, Cina	SX0603
N-idrossisuccinimide (NHS)	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, Cina	S13005
OpenSPRTM	Nicoya
Quercetina	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, Cina	PU0041-0025
Chip sensore COOH	Nicoya
Acetato di sodio	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, Cina	229873