Method Article

Pulizia ottica ed etichettatura per la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso nell'imaging cerebrale umano su larga scala

DOI:

10.3791/65960

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January 26th, 2024

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1European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS), University of Florence, 2Division of Physiology, Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, 3Department of Physics, University of Pisa, 4National Research Council - National Institute of Optics (CNR-INO), 5Department of Physics and Astronomy, University of Florence, 6Department of Biology, University of Florence

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo fornisce una procedura passo-passo per la clearing ottica rapida e simultanea, la marcatura multi-round e la ricostruzione volumetrica 3D di decine di sezioni di cervello umano post-mortem combinando la tecnica di trasformazione tissutale corta (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]) SHORT con l'imaging al microscopio a fluorescenza a foglio luminoso in un protocollo di routine ad alto rendimento.

Abstract

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Nonostante le numerose tecniche di clearing emerse nell'ultimo decennio, l'elaborazione post-mortem del cervello umano rimane un compito impegnativo a causa delle sue dimensioni e complessità, che rendono particolarmente difficile l'imaging con risoluzione micrometrica. Questo articolo presenta un protocollo per eseguire la ricostruzione di porzioni volumetriche del cervello umano elaborando simultaneamente decine di sezioni con il protocollo di trasformazione tissutale SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]), che consente la clearing, la marcatura e l'imaging sequenziale dei campioni con microscopia a fluorescenza a foglio di luce (LSFM). SHORT fornisce una rapida pulizia dei tessuti e una marcatura multipla omogenea di fette spesse con diversi marcatori neuronali, consentendo l'identificazione di diverse sottopopolazioni neuronali sia nella materia bianca che in quella grigia. Dopo la pulizia, le fette vengono visualizzate tramite LSFM con risoluzione micrometrica e in più canali contemporaneamente per una rapida ricostruzione 3D. Combinando l'analisi SHORT con LSFM all'interno di un protocollo di routine ad alto rendimento, è possibile ottenere la ricostruzione della citoarchitettura 3D di grandi aree volumetriche ad alta risoluzione in breve tempo, consentendo così una caratterizzazione strutturale completa del cervello umano.

Introduction

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L'analisi dell'organizzazione molecolare 3D e della citoarchitettura di grandi volumi del cervello umano richiede la trasparenza ottica dei campioni, ottenuta attraverso protocolli con tempi di elaborazione estesi. Le tecniche di compensazione ottica sono state sviluppate per ridurre al minimo l'eterogeneità dell'indice di rifrazione (RI) all'interno dei tessuti, riducendo così la dispersione della luce e aumentando la profondità di penetrazione della luce per l'imaging ad alta risoluzione 1,2,3,4,5. Gli attuali progressi nei metodi di clearing e marcatura dei tessuti profondi consentono l'imaging volumetrico di organi ed embrioni di roditori intatti sfruttando tecniche di microscopia all'avanguardia 6,7,8,9,10,11,12.

Tuttavia, la ricostruzione volumetrica 3D di vaste aree del cervello umano post-mortem rappresenta ancora un compito impegnativo rispetto agli organismi modello. La complessa composizione biologica e le variabili condizioni di fissazione e conservazione post-mortem possono compromettere l'efficienza di eliminazione dei tessuti, la profondità di penetrazione degli anticorpi e il riconoscimento dell'epitopo 13,14,15,16,17,18,19. Inoltre, il sezionamento meccanico dei tessuti e la successiva pulizia ed etichettatura di ogni fetta sono ancora necessari per ottenere una pulizia efficiente e un'etichettatura uniforme di grandi aree cerebrali umane, con conseguenti lunghi tempi di lavorazione e la necessità di sofisticate apparecchiature personalizzate, rispetto agli organismi modello 15,20,21,22.

La tecnica di trasformazione tissutale SWITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) è stata sviluppata specificamente per analizzare grandi volumi del cervello umano18,23. Questo metodo impiega la conservazione strutturale dei tessuti del protocollo SWITCH11 e alte concentrazioni di perossido di idrogeno per ridurre l'autofluorescenza tissutale, in combinazione con il ripristino dell'epitopo. SHORT consente una colorazione uniforme di fette di cervello umano con marcatori per diversi sottotipi neuronali, cellule gliali, vascolarizzazione e fibre mieliniche18,24. I suoi risultati sono compatibili con l'analisi di proteine sia a bassa che ad alta densità. Gli elevati livelli di trasparenza che ne derivano e l'etichettatura uniforme consentono la ricostruzione volumetrica di fette spesse con microscopia a fluorescenza, in particolare, per l'acquisizione rapida è possibile utilizzare apparecchi a foglio di luce 18,24,25,26,27.

In questo lavoro, descriviamo come la tecnica di trasformazione tissutale SHORT può essere utilizzata per la pulizia simultanea e l'etichettatura multi-round di decine di sezioni di cervello umano fissate in formalina. Quattro diversi marcatori fluorescenti possono essere utilizzati insieme, portando all'identificazione di diverse sottopopolazioni cellulari. Dopo la pulizia, è possibile eseguire l'imaging volumetrico ad alta risoluzione con microscopia a fluorescenza. In questo caso, abbiamo utilizzato un LSFM invertito su misura 18,24,25,26,27, che consente un rapido sezionamento ottico del campione e una rapida acquisizione di più canali in parallelo. Con questo protocollo di routine ad alto rendimento, è possibile ottenere una caratterizzazione cellulare e strutturale completa con una risoluzione sub-cellulare di vaste aree del cervello umano, come già dimostrato nella mappatura di un'intera area di Broca23.

Protocol

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Campioni di tessuto umano fissati in formalina sono stati forniti dal Dipartimento di Neuropatologia del Massachusetts General Hospital (MGH) Autopsy Service (Boston, USA). Il consenso scritto è stato ottenuto dai partecipanti sani prima della morte, seguendo i protocolli di raccolta dei tessuti approvati dall'IRB dal Comitato Istituzionale per la Biosicurezza dei Partner (PIBC, protocollo 2003P001937). I documenti di autorizzazione sono conservati presso il MGH Autopsy Services di Boston, MA, Stati Uniti, e sono disponibili su richiesta.

1. Inclusione dell'agarosio e taglio del campione

  1. Preparare una soluzione di agarosio al 4% p/v in 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) in un becher e incorporare il blocco di tessuto all'interno. Attendere che raggiunga la temperatura ambiente (RT) e poi conservare a 4 °C per 24 ore.
  2. Per ottenere sezioni di alta precisione, incollare il campione al disco del vibratomo e riempire il vassoio con PBS freddo 1x (pH 7,4). Regolare i parametri del vibratomo come frequenza, ampiezza e velocità in base al tipo di tessuto da affettare (valori utilizzati: frequenza = 5 (50 Hz); ampiezza = 0,4; velocità = 3 (0,15 mm/s).
    NOTA: È necessario utilizzare vibratomi diversi a seconda del volume del campione. Per campioni con un volume massimo di 70 x 40 x 15 mm, è possibile utilizzare un vibratomo (ad es. Leica VT1000 S); per campioni più grandi, è possibile utilizzare un compresstomo (ad es. VF-900-0Z Microtomo18) o un apparecchio personalizzato21. Qui presentiamo fette tagliate con uno spessore di 400 μm o 500 μm.
  3. Dopo il taglio, mettere tutte le fette in una soluzione conservante composta da 1x PBS (pH 7,4) con 0,01% p/v di Sodio Azide (NaN3) e conservare a 4 °C.
    NOTA: Prima dell'inclusione, attendere che la soluzione di agarosio raggiunga i 37 °C. Una temperatura più elevata potrebbe danneggiare il campione. Si raccomanda di non lasciare i campioni in PFA per più di 48 ore poiché una fissazione prolungata potrebbe interferire con la procedura di marcatura danneggiando gli antigeni e aumentando l'autofluorescenza dei tessuti. Per la conservazione a lungo termine dei tessuti umani, il PBS con NaN3 viene utilizzato per prevenire la contaminazione microbica. A causa della tossicità di NaN3, preparare la soluzione conservante sotto una cappa chimica.

2. Fissazione tissutale

NOTA: Tutte le soluzioni utilizzate nel seguente protocollo sono preparate in grandi volumi, sufficienti per processare tutte le fette dello stesso blocco di tessuto e minimizzare la variabilità tecnica e ridurre i tempi per i singoli passaggi.

  1. Preparare la soluzione di spegnimento con il 50% v/v 1x PBS pH 3, il 25% v/v 0,1 M di acido cloridrico (HCl), il 25% v/v 0,1 M di idrogeno ftalato di potassio (KHP) e il 4% v/v di glutaraldeide fresca al 4%. Porre tutti i campioni in piastre con coperchio a vite (70 x 23 mm) e incubarli con la soluzione Switch-off agitando delicatamente a 4 °C per 1 giorno, proteggendoli dalla luce con un foglio di alluminio.
  2. Preparare la soluzione di accensione con 1x PBS (pH 7,4) e glutaraldeide fresca all'1% v/v. Mettere tutti i campioni in nuove piastre e incubarli con la soluzione Switch-on con agitazione delicata a 4 °C per 1 giorno, proteggendoli dalla luce con un foglio di alluminio.
    NOTA: A causa dell'elevata tossicità e sensibilità alla luce della glutaraldeide, sia le soluzioni di spegnimento che quelle di accensione devono essere sempre preparate fresche e conservate sotto la cappa chimica su ghiaccio. Riempire sempre il piatto con 20 ml di ciascuna soluzione e sigillarlo con parafilm.

3. Inattivazione e cancellazione

NOTA: La glutaraldeide reattiva nei campioni deve essere inattivata mediante incubazione con una soluzione di inattivazione costituita da 1x PBS pH 7,4, 4% p/v acetammide, 4% p/v glicina, pH 9,0. La soluzione può essere conservata a 4 °C per un massimo di 3 mesi. Per rimuovere i lipidi e rendere trasparente il tessuto, utilizziamo la soluzione di clearing composta da 200 mM di sodio dodecil solfato (SDS), 20 mM di solfito di sodio (Na2SO3) e 20 mM di acido borico (H3BO3), pH 9,0. La soluzione deve essere conservata a RT poiché la SDS precipita a 4 °C. Tutti i passaggi successivi verranno eseguiti in provette riempite con la soluzione.

  1. Spostare i campioni dalle piastre alle provette e lavare per 3 x 2 ore con 1x PBS pH 7,4 a RT agitando delicatamente.
    NOTA: Per il passaggio 3.1, è necessario lavorare sotto la cappa chimica a causa della tossicità della glutaraldeide. Anche l'acetammide, la SDS e l'acido borico sono reagenti tossici e devono essere maneggiati sotto una cappa chimica. Riempire sempre la provetta con 50 ml di ciascuna soluzione.
  2. Incubare i campioni in soluzione di inattivazione a 37 °C a bagnomaria per una notte (o/n).
  3. Lavare per 3 x 2 ore in 1x PBS pH 7,4 a RT agitando delicatamente.
  4. Incubare i campioni in soluzione di chiarimento a 55 °C a bagnomaria per 3-7 giorni. Cambiare la soluzione ogni 2 giorni (Tabella 1).

4. Immunoetichettatura

NOTA: Prima della fase di etichettatura, è necessario rimuovere la SDS residua, ridurre l'autofluorescenza e smascherare gli epitopi con una soluzione di recupero dell'antigene composta da 10 mM Tris base, 1 mM EDTA e 0,05% v/v Tween 20, pH 9. Il pH della soluzione di 9 è ottimizzato per un processo di recupero efficiente; La base Tris agisce come agente tampone per mantenere un ambiente a pH stabile; L'EDTA, che è un agente chelante, migliora l'accessibilità dell'antigene. Il detergente non ionico Tween 20 aiuta a migliorare la permeabilità del tessuto. Questa soluzione può essere conservata a 4 °C. È importante notare che il perossido di idrogeno combinato con la fase di recupero dell'antigene ha un effetto sinergico nel ridurre il segnale di autofluorescenza, scomponendo e/o modificando i fluorofori endogeni responsabili del segnale di fondo non specifico (come la lipofuscina).

  1. Preparare 1x PBS con Triton X-100 (PBST) allo 0,1% v/v, preriscaldarlo a 37 °C e lavare i campioni 3 x 3 ore durante il giorno agitando delicatamente a 37 °C nell'incubatore. Lasciare l'ultimo lavaggio o/n.
    NOTA: Conservare la soluzione madre PBST a 4 °C. È fondamentale rimuovere la SDS dal tessuto in quanto può formare precipitati insolubili a basse temperature che possono interferire con i successivi processi di acquisizione.
  2. Il giorno dopo, aggiungere 10 mL di perossido di idrogeno al 30% v/v (H2O2 ) a ciascun campione e lasciarlo agitare delicatamente a RT per 45 minuti.
  3. Lavare 3 x 10 min con 1x PBS (pH 7,4) agitando delicatamente a RT.
  4. Preriscaldare la soluzione di recupero dell'antigene a 95 °C a bagnomaria; trasferire i campioni nella soluzione riscaldata e lasciarli a 95 °C per 10 minuti.
  5. Lasciare raffreddare i campioni a RT per 40 minuti agitando delicatamente.
  6. Lavare 3 x 5 minuti con acqua deionizzata agitando delicatamente.
  7. Equilibrare i campioni in PBS a 4 °C per 15 min.
  8. Preparare una soluzione anticorpale fresca a base di PBST con NaN3 allo 0,01% p/v (vedere la NOTA per il passaggio 1.3) e aggiungere gli anticorpi primari. Incubare i campioni con la soluzione in piastre con coperchio a vite a 37 °C per n giorni (1-7) in un incubatore agitando delicatamente e proteggendo dalla luce (Tabella 2).
    NOTA: Il tempo di incubazione dipende dalle dimensioni e dallo spessore (Tabella 1 e Tabella 2).
  9. Dopo n giorni, spostare i campioni in provette e lavare 3 x 2 ore con PBST preriscaldato a 37 °C agitando delicatamente nell'incubatore.
  10. Aggiungere gli anticorpi secondari in PBST con NaN3 allo 0,01% p/v e incubare i campioni in nuove piastre con coperchi a vite a 37 °C per n giorni (1-6) in un incubatore agitando delicatamente e al riparo dalla luce (Tabella 1 e Tabella 2).
  11. Dopo n giorni, trasferire i campioni in provette e lavare 3 x 3 ore durante il giorno con PBST preriscaldato a 37 °C in un'incubatrice ad agitazione delicata. Lasciare l'ultimo lavaggio o/n.
    NOTA: Poiché Triton X-100 e Tween 20 sono viscosi, pipettare lentamente per consentire il riempimento del puntale. Riempire sempre la provetta con 50 ml di ciascuna soluzione. Utilizzare 10 mL di soluzioni anticorpali per ogni campione e sigillare la piastra con parafilm per evitare l'evaporazione della soluzione. Poiché le soluzioni anticorpali contengono NaN3, possono essere conservate a 4 °C e riutilizzate per etichettare nuovi campioni entro 2 settimane.

5. Corrispondenza dell'indice di rifrazione

NOTA: Per ottenere un elevato livello di trasparenza, è necessario omogeneizzare l'indice di rifrazione tissutale. Qui usiamo il 2,2'-tiodietanolo (TDE) diluito in 1x PBS. Le soluzioni TDE devono essere conservate in RT.

  1. Trasferire i campioni in nuove stoviglie, aggiungere il 30% v/v TDE e lasciarli per 4 ore agitando delicatamente a RT.
  2. Rimuovere la soluzione di TDE al 30% v/v, aggiungere TDE al 68% v/v ai campioni e lasciarli agitare delicatamente a RT.
    NOTA: Poiché il TDE è viscoso, pipettare lentamente per consentire il riempimento del puntale. L'inalazione di vapore o nebbia TDE può irritare il sistema respiratorio. Pertanto, si consiglia di lavorare in un'area ben ventilata o di utilizzare cappe aspiranti per ridurre al minimo l'esposizione. Le soluzioni TDE devono essere conservate a RT. Utilizzare 10 mL di soluzioni TDE per ciascun campione.

6. Montaggio del campione

NOTA: Per facilitare il montaggio del campione e l'acquisizione dell'immagine LSFM, utilizziamo un portacampioni sigillato su misura (denominato "sandwich"), composto da tre parti: un vetrino da microscopio, un distanziatore e un vetrino coprioggetti.

  1. Posizionare il distanziatore in acciaio (56 x 56 x 0,5 mm3) sul vetrino del microscopio (60 x 60 x 1 mm3) e posizionare il campione sul vetrino per microscopia.
  2. Metti con cura il vetrino coprioggetti al quarzo (60 x 60 x 0,5 mm3), aggancia il tutto insieme e prepara una colla siliconica bicomponente in rapporto 1:1. Utilizzare un vetrino coprioggetti al quarzo per far corrispondere l'indice di rifrazione e ridurre l'aberrazione ottica durante il processo di acquisizione.
  3. Utilizzando una siringa da 1 ml, riempire lo spazio tra il distanziatore e il vetrino coprioggetto con una colla siliconica bicomponente e lasciare asciugare per 10 minuti.
  4. Rimuovere le clip e utilizzare un piccolo ago per riempire lentamente l'intero sandwich con TDE al 68% v/v.
  5. Prepara la colla fresca e sigilla il panino.
    NOTA: Se il TDE raggiunge accidentalmente il distanziatore al punto 6.1, la colla non si indurisce. Assicurarsi che non si formino bolle d'aria durante il passaggio 6.2.

7. Strippaggio

NOTA: La conservazione strutturale e la maggiore accessibilità dell'epitopo di SHORT consentono l'etichettatura multi-round delle fette rimuovendo gli anticorpi e ricolorando i campioni con altri marcatori.

  1. Aprire il panino con una lama, mettere i campioni in nuovi piatti con coperchi a vite riempiti con TDE al 30% v/v e lasciarli per 3 h.
  2. Trasferire i campioni in provette, lavare per 3 x 2 ore in 1x PBS (pH 7,4) a RT con agitazione delicata e lasciare l'ultimo lavaggio o/n.
  3. Porre i campioni in soluzione di chiarimento a bagnomaria a 80 °C per 4 ore.
  4. Lavare per 3 x 2 h in 1x PBST (pH 7,4) a 37 °C agitando delicatamente e lasciare l'ultimo lavaggio. A questo punto il campione è pronto per essere etichettato nuovamente a partire dal passaggio 4.8.
    NOTA: Riempire sempre la provetta con 50 ml di ciascuna soluzione. Utilizzare 10 mL di soluzione TDE per ogni campione.

Results

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Il protocollo qui descritto consente il trattamento simultaneo di più fette, di spessore variabile da 100 μm a 500 μm, utilizzando il metodo SHORT. Questo approccio riduce significativamente il tempo di elaborazione complessivo per l'intera procedura. In questo lavoro, forniamo una descrizione completa dell'intera pipeline (Figura 1) per l'elaborazione simultanea di più sezioni spesse del cervello umano post-mortem e dimostriamo il protocollo su 24 fette contemporaneamente (Figura 2A). La durata per la clearing e la co-etichettatura varia da 11 a 30 giorni, considerando le dimensioni e lo spessore dei campioni (Tabella 1), escludendo l'imaging e il post-imaging processing. A seguito della corrispondenza della delipidazione e dell'indice di rifrazione in TDE, si ottiene una trasparenza ottimale e omogenea di tutte le fette di tessuto sia nella sostanza grigia che in quella bianca (Figura 2B).

L'acquisizione delle immagini può essere eseguita con diversi microscopi a fluorescenza avanzati, tra cui la microscopia confocale25 e la microscopia a due fotoni14. In questo caso, abbiamo utilizzato un LSFM18,23 invertito su misura dotato di quattro linee laser di eccitazione: 405 nm, 488 nm, 561 nm e 638 nm, in grado di acquisire quattro diverse caratteristiche biologiche marcate con anticorpi coniugati con fluorofori. La Figura 3A mostra immagini rappresentative di una fetta spessa 400 μm da un'area di Broca umana co-marcata per NeuN, un marcatore pan-neuronale, somatostatina (SST) e calretinina (CR), che marcano due diverse sottopopolazioni di interneuroni e il marcatore nucleare DAPI (Figura 3A, B). Nella lastra spessa 400 μm, abbiamo osservato che la fluorescenza globale lungo Z non è limitata alla superficie, ma è quasi uniforme in tutta la profondità del tessuto, anche se l'intensità del segnale diminuisce leggermente al centro (Figura 3C).

Per ottenere una caratterizzazione cellulare più completa del tessuto cerebrale umano, è possibile eseguire la marcatura multi-round degli stessi campioni rimuovendo gli anticorpi e rietichettando il campione come dimostrato nell'articolo originale di SHORT. La Figura 4 (adattata da Pesce et al.18) mostra la potenziale applicazione di sette diversi anticorpi su una fetta di tessuto di 500 μm di spessore processata con SHORT in tre cicli consecutivi di immunocolorazione. Gli anticorpi utilizzati includono NeuN, SST, CR, Parvalbumina (PV) e peptide intestinale vasoattivo (VIP) come marcatori neuronali inibitori, proteina acida fibrillare gliale (GFAP) per le cellule gliali e vimentina (VIM) per la vascolarizzazione (Tabella 2). I risultati mostrano la notevole capacità di SHORT di preservare le informazioni sui tessuti durante le varie procedure di stripping, ridurre efficacemente i segnali di autofluorescenza e ottenere un'efficiente pulizia dei campioni.

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Figura 1: Timeline di SHORT. Schema che rappresenta le fasi necessarie per processare i campioni con il protocollo SHORT. In ogni fase, decine di lastre di tessuto cerebrale umano vengono elaborate insieme. Dopo l'incorporazione nell'agarosio e l'affettatura, i campioni vengono posti in soluzioni di accensione e spegnimento per 1 giorno ciascuna; Le fasi di inattivazione vengono eseguite durante la notte mentre la delipidazione tramite incubazione in soluzione di chiarimento richiede 3-7 giorni. Successivamente, i campioni vengono incubati con soluzioni anticorpali primarie e secondarie per un massimo di 7 e 6 giorni, rispettivamente. Dopo la corrispondenza dell'indice di rifrazione, i campioni vengono montati nel portacampioni (sandwich) per l'imaging e la conservazione LSFM. In qualsiasi momento dopo l'assemblaggio del sandwich, i campioni possono essere rimossi e rietichettati per il rilevamento di diversi marcatori. Abbreviazioni: TDE = 2,2'-tiodietanolo; CORTO = SWITCH - H2O2 - Recupero dell'antigene-TDE; o/n = pernottamento; RI = indice di rifrazione; LSFM = microscopia a fluorescenza a foglio luminoso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Fette di cervello umano da un blocco di Broca elaborate simultaneamente. (A) Ventiquattro fette consecutive dall'area di Broca di 4 x 4 x 0,04 cm3 in PBS prima dell'elaborazione con il metodo SHORT. (B) Gli stessi campioni in A mostrati dopo l'elaborazione SHORT. Barra della scala = 1 cm. Abbreviazioni: TDE = 2,2'-tiodietanolo; CORTO = SWITCH - H2O2 - Recupero dell'antigene-TDE; PBS = soluzione salina tamponata con fosfati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Immagini LSFM rappresentative di una fetta chiarificata etichettata con quattro diversi marcatori. (A) Immagini di proiezione a massima intensità (risoluzione di 3,3 x 3,3 x 3,3 μm3) che mostrano una ricostruzione mesoscopica di una fetta di area di Broca trattata in SHORT marcata per NeuN, Somatostatina, Calretinina e il marcatore nucleare DAPI. A destra viene mostrata l'immagine unita (NeuN-SST-CR-DAPI). Barra della scala = 0,5 cm. (B) Inserto ingrandito dell'immagine unita in A. Barra della scala = 100 μm. (C) Immagini yz ad alta risoluzione (0,55 x 0,55 x 3,3 μm) da (B). Barra della scala = 100 μm. Abbreviazioni: TDE = 2,2'-tiodietanolo; CORTO = SWITCH - H2O2 - Recupero dell'antigene-TDE; LSFM = microscopia a fluorescenza a foglio luminoso; NeuN = Antigene Nucleare Neuronale; SST = somatostatina; CR = calretinina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Immagini LSFM rappresentative della colorazione multi-round in fette lavorate SHORT. (A) Immagini di una fetta di cervello umano prima della depurazione (in PBS) e dopo l'etichettatura multi-round con corrispondenza dell'indice di rifrazione (TDE 68%). Barra della scala = 1 cm. (B) Unione dei vari canali acquisiti durante tre successivi multi-round. L'immagine mostra sia la materia bianca che quella grigia marcata con peptide intestinale vasoattivo, somatostatina, parvalbumina, calretinina, antigene nucleare neuronale, proteina acida fibrillare gliale e vimentina. Le immagini ad alta risoluzione (risoluzione di 0,55 x 0,55 x 3,3 μm), a canale singolo, sono mostrate a destra e sotto l'immagine. Barra della scala = 100 μm per tutte le immagini, ad eccezione della GFAP (barra della scala 10 = μm). (C) Immagini di proiezione a massima intensità di una fetta di 500 μm di spessore che mostrano il segnale di sette diversi anticorpi utilizzati in tre cicli sequenziali di immunocolorazione. Round 1: PV-SST-VIP; giro 2: CR-SST-NeuN; giro 3: VIM-SST-GFAP. Barra della scala = 1 mm. Questa figura è stata modificata da Pesce et al.18. Abbreviazioni: TDE = 2,2'-tiodietanolo; CORTO = SWITCH - H2O2 - Recupero dell'antigene-TDE; LSFM = microscopia a fluorescenza a foglio luminoso; NeuN = Antigene Nucleare Neuronale; SST = somatostatina; CR = calretinina; PV = parvalbumina; GFAP = proteina acida fibrillare gliale; VIM = vimentina; VIP = peptide intestinale vasoattivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Durata rappresentativa di SHORT per campioni con una gamma di aree e spessori. Campioni con aree e spessori diversi richiedono un tempo di incubazione variabile nelle soluzioni di clearing e anticorpi, con conseguenti lunghezze di tempo distinte per l'intera pipeline SHORT. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Anticorpi compatibili con SHORT. La tabella elenca tutti gli anticorpi che sono stati testati con il protocollo SHORT e hanno mostrato una colorazione specifica in campioni di cervello umano di 400-500 μm di spessore. La colonna P/M indica gli anticorpi policlonali e monoclonali. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

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L'imaging ad alta risoluzione e la ricostruzione 3D di grandi aree cerebrali umane richiedono il sezionamento meccanico dei tessuti, seguito dalla pulizia ottica e dall'immunomarcatura di singole fette. Il protocollo qui presentato descrive come il metodo di trasformazione tissutale SHORT può essere utilizzato per l'elaborazione rapida e simultanea di più sezioni spesse del cervello umano per la ricostruzione cerebrale 3D con una risoluzione subcellulare con LSFM.

A differenza di altri approcci, con il metodo SHORT le fasi di clearing e multi-etichettatura non richiedono sofisticate apparecchiature personalizzate. La maggior parte dei campioni può essere processata complessivamente, riducendo il tempo di elaborazione di grandi blocchi di tessuto cerebrale umano e riducendo al minimo la variabilità tecnica.

I trattamenti di decolorazione e smascheramento degli epitopi sono fondamentali quando si lavora con tessuti umani invecchiati e fissati in formalina. Il perossido di idrogeno e le soluzioni di recupero dell'antigene alcalino possono essere utilizzate anche in combinazione con altri metodi di compensazione come iDISCO 6,28, CLARITY, SWITCH e SHIELD24.

Per garantire la conservazione delle informazioni epitopiche e ottenere una pulizia uniforme della materia grigia e bianca, è necessario trasformare il campione in un ibrido gel/tessuto resistente al calore e ai reagenti chimici. La glutaraldeide è stata selezionata per la sua eccellente capacità di reticolazione e la sua capacità di penetrare nella lastra di tessuto a basso pH (pH = 3). La concentrazione di glutaraldeide è un fattore critico nel determinare la forza e la chiarezza del tessuto. Una concentrazione più elevata porta a una migliore conservazione della struttura del tessuto, ma aumenta anche il tempo necessario per la pulizia. Questa scelta consente di ottenere i risultati desiderati in termini di conservazione dell'epitopo e di pulizia omogenea. Nel caso della soluzione di spegnimento (fase 2.1 del protocollo), la concentrazione di glutaraldeide è stata accuratamente scelta e ottimizzata per trovare un equilibrio tra un'efficace reticolazione e una rapida eliminazione18,25. SHORT è specificamente progettato per lavorare con fette di cervello umano fissate in formalina dall'area di Broca, dall'ippocampo e dalla corteccia corticale 18,23,25. Tuttavia, quando si lavora con altri modelli biologici o diverse regioni cerebrali, possono essere necessarie alcune modifiche a causa delle variazioni nella composizione della materia grigia e bianca.

Un compito critico di questo protocollo è anche l'ottimizzazione del tempo di incubazione in clearing (fase 3.4 del protocollo) e delle soluzioni anticorpali (fasi 4.8 e 4.10 del protocollo), principalmente in relazione alle dimensioni del campione e alla composizione biologica del tessuto. Abbiamo stimato che 500 μm rappresentano il limite di spessore del tessuto per ottenere una trasparenza ottimale sia nella sostanza bianca che in quella grigia e un'etichettatura uniforme in tutta la profondità del tessuto per la colorazione di diversi anticorpi (Tabella 2). Una descrizione dettagliata di questi processi può essere trovata in Pesce et al.18 e Scardigli et al.24. Diverse aree cerebrali potrebbero avere una composizione diversa in lipidi e proteine e i cervelli invecchiati sviluppano un alto contenuto di pigmenti di tipo lipofuscina e neuromelanina che producono un forte segnale di autofluorescenza e alterano la diffusione della sonda in tutto il tessuto. Ad esempio, una fetta spessa 400 μm di 16cm2 proveniente dall'area di Broca umana necessita di 7 giorni di trattamento con la soluzione di chiarimento per raggiungere un alto livello di delipidazione. Per garantire una colorazione uniforme in tutta la profondità del tessuto, richiede l'incubazione con soluzioni anticorpali primarie e secondarie rispettivamente per 7 e 6 giorni (Figura 3). È quindi necessaria un'ottimizzazione fine per le fasi di compensazione ed etichettatura prima dell'applicazione del protocollo ad alta produttività qui descritto.

SHORT consente di conservare i campioni nel supporto per imaging personalizzato, poiché è stato dimostrato che il segnale fluorescente viene conservato per almeno un anno. I ricercatori possono quindi preparare tutti i panini in anticipo e conservarli per la fase di imaging che può essere eseguita successivamente. In particolare, il vetrino del microscopio, il distanziatore e il vetro di copertura utilizzato per preparare i panini possono essere personalizzati in base alle dimensioni del campione.

I campioni processati con il protocollo SHORT qui descritto sono stati analizzati utilizzando un LSFMinvertito 18,23 su misura. Questa configurazione comprende due bracci dotati di 12 obiettivi personalizzati con un collare di correzione dell'indice di rifrazione (RI). Ogni obiettivo funge contemporaneamente da braccio di illuminazione e rilevamento, consentendo l'acquisizione simultanea di due canali ad una velocità volumetrica di 0,16 cm3/h. Poiché il portacampioni può ospitare due sandwich alla volta, siamo in grado di visualizzare consecutivamente quattro canali in due fette in 10 ore. A causa della lieve tossicità del vapore TDE per il sistema respiratorio, per evitare aberrazioni sferiche, il portacampioni è riempito con una soluzione di glicerolo/acqua al 91% v/v che corrisponde al RI (1,46) sia del vetrino coprioggetti al quarzo che della soluzione TDE. La soluzione di glicerolo/acqua al 91% v/v deve essere cambiata ogni 3 giorni per evitare la contaminazione da polvere. Pertanto, il nostro LSFM consente l'acquisizione rapida di campioni con basso fotosbiancamento a una risoluzione isotropa di 3,6 μm dopo la post-elaborazione 18,23,29. La grande quantità di dati prodotti è stata elaborata utilizzando una pipeline definita per il re-slicing e lo stitching delle pile di immagini utilizzando un software auto-sviluppato, ZetaStitcher (https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher)23,29.

Sebbene sia stato utilizzato SHORT in combinazione con la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso, è possibile impiegare diversi tipi di tecniche di imaging a fluorescenza per l'acquisizione a seconda della disponibilità del laboratorio e delle applicazioni specifiche. Ad esempio, la microscopia confocale25 o la microscopia a due fotoni14 possono essere utilizzate per analizzare campioni cancellati. Questo tipo di analisi è consigliato per campioni con volumi relativamente piccoli poiché si tratta di sistemi basati sulla scansione e il tempo di acquisizione per grandi aree di tessuto è molto lungo30. Ottenendo un imaging più rapido e disaccoppiando la risoluzione laterale e assiale, la microscopia a fluorescenza a foglio di luce è il metodo preferito per l'imaging di grandi volumi di campioni cancellati 3,4,18,31,32,33.

In sintesi, abbiamo descritto un protocollo rapido ad alto rendimento per la clearing simultanea, la co-etichettatura omogenea e la ricostruzione volumetrica 3D di dozzine di sezioni di cervello umano post-mortem. Combinando SHORT con l'imaging LSFM e l'analisi computazionale, è possibile ottenere dati tridimensionali per un censimento cellulare completo e un'analisi proteomica del cervello umano.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Dipartimento di Radiologia, per aver fornito i campioni di cervello umano analizzati in questo studio. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma quadro di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 654148 (Laserlab-Europe), dal programma quadro Horizon 2020 dell'Unione europea per la ricerca e l'innovazione nell'ambito dell'accordo di sovvenzione specifico n. 785907 (Human Brain Project SGA2) e n. 945539 (Human Brain Project SGA3), dal General Hospital Corporation Center del National Institutes of Health con il numero di premio U01 MH117023, e dal Ministero dell'Istruzione nell'ambito di Euro-Bioimaging Italian Node (infrastruttura di ricerca ESFRI). Infine, questa ricerca è stata realizzata con il contributo di "Fondazione CR Firenze". Il contenuto di questo lavoro è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,2'-tiodietanoloMerck Life Science S.R.L.
acetammide >= 99,0% (GC)Merck Life Science S.R.L.160
Agarosio Alto EEOMerck Life Science S.R.L.A9793
Acido boricoMerck Life Science S.R.L.B7901
Compressome VF-900-0Z MicrotomoPrecisione/
Vetrini coprioggettiLaserOptex/personalizzato
Acido etilendiamminotetraacetico sale disodico diidratoMerck Life Science S.R.L.E5134
GlutaraldeideMerck Life Science S.R.L.G7651
GlicinaSanta Cruz BiotechnologySC_29096
Perossido di idrogeno 30%Merck Life Science S.R.L.
Incubatrice ISS-4075Compagno di laboratorio /
Microscopia a fluorescenza a foglio ottico (LSFM)//su misura
Loctite AttakHenkel Italia srl/
Vetrini per microscopioLaborchimica/pastiglia salina tampone fosfato su misura
Merck Life Science S.R.L.P4417
Picodent TwinsilPicodent13005002fuori produzione
Potassio Idrogeno FtalatoMerck Life Science S.R.L.P1088
Sodio Azide MerckLife Science S.R.L.S2002
Sodio Dodecil Solfato MerckLife Science S.R.L.L3771
Solfito di sodioMerck Life Science S.R.L.S0505
DistanziatoriMicrolaser srlContenitori per
Espettorato personalizzati (piatti con coperchi a vite)Paul Boettger GmbH & Co. KG07.061.2000
Tris BasePanReac AppliChem (reagenti ITW)A4577,0500
Triton X-100Merck Life Science S.R.L.Tubi T8787
Sarstedt62 547254
Tween 20Merck Life Science S.R.L.P9416
Vibratomo VT1000SLeica Biosystem/
Bagno d'acqua MemmertWNB 7-45<
strong>Anticorpi e coloranti
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-545-215Diluizione utilizzata, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch805-545-180Diluizione utilizzata, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-605-215Diluizione utilizzata, 1:200
Anticorpo Anti-NeuNMerck Life Science S.R.L.ABN91Diluizione utilizzata, 1:100
Anticorpo anti-parvalbumina (PV)Abcamab32895Diluizione utilizzata, 1:200
Anticorpo anti-vimentina [V9] - Citoscheletro Marker (VIM)Abcamab8069Diluizione utilizzata, 1:200
Calretinina Anticorpo policlonaleProteinTech12278_1_APDiluizione utilizzata, 1:200
DAPIThermoFisherD3571Diluizione usato, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H& L (Alexa Fluor 568)Abcamab175700Diluizione utilizzata, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H& L (Alexa Fluor 647)Abcamab150107Diluizione utilizzata, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H& L (Alexa Fluor 568)Abcamab175470Diluizione utilizzata, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H& L (Alexa Fluor 568) Abcamab175475preadsorbito Diluizione utilizzata, 1:200
IgY Anti-Pollo di capra H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Diluizione usata, 1:500
IgY Anti-Pollo di capra H& L (Alexa Fluor 568)Abcamab175711Diluizione utilizzata, 1:500
IgY Anti-Pollo di capra H& L (Alexa Fluor 647)Abcamab150171Diluizione utilizzata, 1:500
IgG anti-coniglio di capra H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077Diluizione utilizzata, 1:200
Ricombinante Alexa Fluor 488 Anticorpo anti-GFAPAbcamab194324Diluizione utilizzata, 1:200
Anticorpo somatostatina YC7Santa Cruz Biotechnologysc-47706Diluizione utilizzata, 1:200
Peptide intestinale vasoattivo (VIP)ProteinTech16233-1-APDiluizione utilizzata, 1:200
166782

References

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