Articolo metodologico

Doppie registrazioni extracellulari nell'ippocampo del topo e nella corteccia prefrontale

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DOI:

10.3791/66003

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16 febbraio 2024

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1Neural Dynamics Laboratory, Department of Medicine, The University of Melbourne, 2Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Melbourne

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo delinea l'uso di un dispositivo di registrazione progettato su misura ed elettrodi per registrare i potenziali di campo locali e studiare il flusso di informazioni nell'ippocampo del topo e nella corteccia prefrontale.

Abstract

La tecnica di registrazione dei potenziali di campo locali (LFP) è un metodo elettrofisiologico utilizzato per misurare l'attività elettrica di popolazioni neuronali localizzate. Serve come strumento cruciale nella ricerca cognitiva, in particolare nelle regioni del cervello come l'ippocampo e la corteccia prefrontale. Le doppie registrazioni LFP tra queste aree sono di particolare interesse in quanto consentono l'esplorazione della comunicazione del segnale interregionale. Tuttavia, i metodi per eseguire queste registrazioni sono raramente descritti e la maggior parte dei dispositivi di registrazione commerciali sono costosi o mancano di adattabilità per adattarsi a specifici disegni sperimentali. Questo studio presenta un protocollo completo per l'esecuzione di registrazioni LFP a doppio elettrodo nell'ippocampo del topo e nella corteccia prefrontale per studiare gli effetti dei farmaci antipsicotici e dei modulatori dei canali del potassio sulle proprietà LFP in queste aree. La tecnica consente la misurazione delle proprietà LFP, compresi gli spettri di potenza all'interno di ciascuna regione del cervello e la coerenza tra i due. Inoltre, per questi esperimenti è stato sviluppato un dispositivo di registrazione a basso costo e progettato su misura. In sintesi, questo protocollo fornisce un mezzo per registrare segnali con elevati rapporti segnale-rumore in diverse regioni del cervello, facilitando l'indagine della comunicazione di informazioni interregionali all'interno del cervello.

Introduzione

I potenziali di campo locali (LFP) si riferiscono all'attività elettrica registrata dallo spazio extracellulare, che riflette l'attività collettiva di un gruppo localizzato di neuroni. Presentano una vasta gamma di frequenze, che vanno dalle onde lente a 1 Hz alle oscillazioni veloci a 100 Hz o 200 Hz. Bande di frequenza specifiche sono state associate a funzioni cognitive come l'apprendimento, la memoria e il processo decisionale 1,2. I cambiamenti nelle proprietà LFP sono stati utilizzati come biomarcatori per vari disturbi neurologici, tra cui demenza e schizofrenia 3,4. L'analisi delle registrazioni LFP può offrire preziose informazioni sui meccanismi patologici sottostanti associati a queste condizioni e sulle potenziali strategie terapeutiche.

La doppia registrazione LFP è una tecnica utilizzata per misurare l'attività elettrica localizzata all'interno e tra due specifiche regioni del cervello. Questa tecnica offre una preziosa opportunità per studiare le intricate dinamiche neurali e la comunicazione del segnale che si verificano all'interno e tra regioni cerebrali distinte. Studi precedenti hanno rivelato che rilevare alterazioni nelle proprietà neuronali delle singole regioni cerebrali può essere complesso, ma si possono osservare cambiamenti nella comunicazione corticale interregionale 5,6. Pertanto, l'utilizzo della doppia registrazione LFP offre un potente mezzo per affrontare questo problema.

La connettività ippocampo-prefrontale svolge un ruolo cruciale nella modulazione delle funzioni cognitive e la disfunzione è stata collegata a vari disturbi neurologici 7,8. Le registrazioni a doppio elettrodo di queste regioni possono fornire informazioni su queste interazioni. Sfortunatamente, ci sono informazioni limitate disponibili sui metodi per eseguire registrazioni LFP a doppio elettrodo tra queste aree. Inoltre, i dispositivi di registrazione disponibili in commercio sono generalmente costosi e mancano di adattabilità a specifici disegni sperimentali. Il metodo convenzionale per la registrazione degli LFP prevede l'utilizzo di un cavo schermato per collegare il dispositivo di registrazione agli elettrodi impiantati nel cervello di un animale. Tuttavia, questo approccio è suscettibile di artefatti di movimento e rumore ambientale, con un impatto sulla qualità e sull'affidabilità dei segnali registrati.

Questo protocollo descrive una procedura completa per l'esecuzione di registrazioni LFP a doppio elettrodo nell'ippocampo del topo e nella corteccia prefrontale, utilizzando un headstage a basso costo progettato su misura che può essere posizionato sulla testa dell'animale. Questi metodi consentono ai ricercatori di studiare i modelli oscillatori specifici della regione all'interno di due regioni cerebrali discrete ed esplorare lo scambio di informazioni interregionali e la connettività tra queste aree.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Florey Animal Ethics Committee (Università di Melbourne, n. 22-025UM) in conformità con il codice australiano per la cura e l'uso degli animali per scopi scientifici. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6 (8 settimane), ottenuti dall'Animal Resources Centre (Australia).

1. Progettazione e fabbricazione dell'headstage

NOTA: La scheda PCB headstage è una scheda compatta a quattro strati da 14 mm x 12 mm progettata per essere posizionata direttamente sulla testa dell'animale. Utilizza un chip amplificatore commerciale (vedi Tabella dei materiali) e tutti i file di progettazione e Gerber sono disponibili online (link GitHub: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).

  1. Fornire le seguenti specifiche al produttore: Spessore del pannello: 0,6 mm; Tracciamento/spaziatura minima: 4 mil; Dimensione minima del foro: 0,2 mm.
  2. Durante il processo di assemblaggio del PCB, seguire questo ordine:
    1. Saldare il chip dell'amplificatore sulla scheda utilizzando una pistola ad aria calda impostata a 350 °C.
    2. Saldare i componenti passivi.
    3. Saldare il connettore SPI e il connettore dell'elettrodo (vedi Tabella dei materiali).
  3. Ispezionare la saldatura al microscopio per garantire la qualità. Fissare il connettore SPI in posizione utilizzando resina epossidica per una maggiore stabilità.
  4. Utilizzare un software di registrazione di terze parti e una scheda di controllo (vedere Tabella dei materiali) per l'acquisizione del segnale. Fare riferimento alla guida per l'utente del software per istruzioni dettagliate.
  5. L'headstage progettato supporta 8 canali. Nel software, abilitare i canali 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 e 23 per la registrazione.

2. Fabbricazione di elettrodi

  1. Tagliare i fili di tungsteno rivestiti in PFA (vedere la Tabella dei materiali) a lunghezze specifiche per diversi tipi di elettrodi: elettrodo della corteccia prefrontale (12 mm), elettrodo dell'ippocampo (10 mm) ed elettrodo di terra (6 mm).
  2. Tagliare il tubo di ottone (vedi Tabella dei materiali) in segmenti di 3 mm.
  3. Rimuovere 2 mm di rivestimento all'estremità di ciascun filo utilizzando un accendino, quindi saldare saldamente il filo dell'elettrodo al tubo di ottone. Il tubo in ottone ha un diametro interno di 0,45 mm e un diametro esterno di 0,60 mm.
  4. Per l'elettrodo di terra, saldare una vite in acciaio inossidabile M1.2 (vedere la tabella dei materiali) all'elettrodo. Applicare un flusso a base di acido fosforico alla vite per migliorare la saldatura. Dopo la saldatura, pulire la vite con alcool.
    NOTA: Indossare guanti per proteggersi durante il processo di saldatura.

3. Procedura chirurgica

  1. Anestetizzare il topo in una camera di anestesia con isoflurano al 3% e flusso di ossigeno di 1 L/min.
  2. Posizionare il mouse anestetizzato su un termoforo e fissarlo in una cornice stereotassica (vedere Tabella dei materiali).
  3. Regolare il tasso di mantenimento dell'isoflurano al 2,5-3% e ridurre il flusso di ossigeno a 500 ml/min. Usando il pizzico per le dita dei piedi, verifica se l'animale è ancora in anestesia profonda.
  4. Iniettare per via sottocutanea carprofene a 0,5 mg/kg e applicare un unguento oculare per la protezione degli occhi.
  5. Radere e sterilizzare la testa del topo utilizzando iodio povidone ed etanolo all'80%.
  6. Praticare un'incisione di 8 mm lungo la linea mediana del cuoio capelluto, rimuovendo il tessuto connettivo nell'area dell'incisione.
  7. Applicare acqua ossigenata per pulire la superficie del cranio, facendo attenzione a non toccare la pelle circostante.
  8. Allineare i punti di riferimento bregma e lambda allo stesso livello per un posizionamento accurato degli elettrodi (bregma e lambda sono il punto in cui la sutura sagittale interseca le suture coronali e lambdoidi).
  9. Praticare i fori per l'elettrodo di riferimento/rettificato, le viti di ancoraggio (fresa da 0.9 mm) e gli elettrodi attivi (fresa da 0.3 mm) alle coordinate specificate.
  10. Collegare l'elettrodo su misura (passaggio 2) al braccio del telaio stereotassico e assicurarsi che sia perpendicolare al cervello.
  11. Impiantare l'elettrodo nell'area CA1 dell'ippocampo (AP - 1,8 mm, ML - 1,3 mm, DV - 1,4 mm).
    NOTA: AP, anteroposteriore; ML, mediolaterale; DV, dorso-ventrale.
  12. Impianto ripetuto di elettrodi nella corteccia prefrontale (AP - 2,0 mm, ML - 0,3 mm, DV - 1,7 mm).
  13. Fissare gli elettrodi con un adesivo potente disponibile in commercio e cemento dentale (vedere la tabella dei materiali).
  14. Impianto di due viti di ancoraggio da 1,2 mm (AP - 1,8 mm, ML -1,6 mm) per impedirne il movimento.
  15. Posizionare l'elettrodo di riferimento/massa a diretto contatto con la dura madre, 2 mm posteriormente e 2 mm unilateralmente al punto di riferimento lambda.
  16. Collegare il lato del tubo di ottone degli elettrodi a un connettore femmina multicanale (vedi Tabella dei materiali) con l'elettrodo di terra al centro.
  17. Utilizzare una guaina termorestringente da 0,8 mm all'esterno del perno centrale per l'isolamento.
  18. Fissare gli elettrodi, le viti di ancoraggio e il connettore con adesivo e cemento dentale.

4. Assistenza postoperatoria

  1. Per alleviare il dolore postoperatorio, iniettare carprofene alla dose di 5-10 mg/kg per via sottocutanea ogni 12-24 ore sulla base di una valutazione del dolore per un periodo di tre giorni.
  2. Fornire all'animale un periodo di recupero di una settimana prima di iniziare qualsiasi registrazione o procedura sperimentale.

5. Procedura di registrazione

  1. Maneggiare l'animale per 15 minuti, due volte al giorno, per tre giorni consecutivi.
  2. Prendi i topi chiudendo delicatamente la mano intorno a loro senza applicare una pressione eccessiva.
  3. Posiziona la tavola headstage sulla testa dell'animale per 30 minuti una volta al giorno per tre giorni consecutivi.
  4. Il giorno della registrazione, acclimata l'animale nella sala di registrazione per 30 minuti.
  5. Posizionare l'animale in una piccola camera di registrazione all'interno di una gabbia di Faraday per ridurre le interferenze elettriche esterne. Allega l'headstage personalizzato per la registrazione.
  6. Aprire il software di registrazione e selezionare una frequenza di campionamento di 2,00 kHz. Disabilita tutti i canali tranne 13 e 20 selezionando ciascun canale e premendo la barra spaziatrice.
  7. Nella finestra della larghezza di banda hardware, impostare la larghezza di banda inferiore su 2 Hz e la larghezza di banda superiore su 100 Hz.
  8. Nella finestra di filtraggio del software, regolare il filtro passa-basso su 100 Hz e il filtro passa-alto su 2 Hz.
  9. Scegliere il percorso di archiviazione facendo clic su Seleziona nome file, quindi fare clic su Registra.
  10. Iniziare ogni sessione di registrazione con un periodo di assuefazione di 10 minuti seguito da una registrazione EEG di base di 15 minuti.
  11. Dopo la registrazione di base, somministrare il farmaco tramite iniezione intraperitoneale e continuare la registrazione per altri 30 minuti senza indugio.
    NOTA: Vedere la sezione Risultati per i dettagli sui farmaci utilizzati.

Risultati

I risultati qui mostrati dimostrano gli effetti di diversi farmaci sulle proprietà dei potenziali di campo locali (LFP) testati in quattro coorti di topi maschi C57BL/6 (n = 8 per ogni coorte; età: 8 settimane; peso: 24,0 ± 0,42 g). I farmaci testati includevano il farmaco antipsicotico clozapina, i modulatori dei canali del potassio 4-aminopiridina (4-AP) e la retigabina, nonché la soluzione salina del veicolo di controllo.

Come mostrato nella Figura 1, il topo è stato posizionato in una piccola camera di registrazione e le LFP sono state raccolte dall'ippocampo (HIP) e dalla corteccia prefrontale (PFC) utilizzando un headstage progettato su misura. Poiché questo studio si è concentrato principalmente sull'esame delle bande di frequenza theta e gamma, il segnale registrato è stato prima sottoposto a filtraggio passa-banda iniziale entro un intervallo di frequenza di 2-100 Hz, seguito da campionamento a 2000 Hz. Il segnale è stato quindi sezionato in diverse epoche di 2 s. Tutte le epoche che mostravano artefatti di movimento pronunciati sono state identificate e successivamente escluse dai successivi processi di analisi. Gli spettri di potenza degli LFP sia nell'HIP che nel PFC, nonché la coerenza HIP-PFC, sono stati misurati utilizzando un metodo di analisi basato su più coni9. L'analisi ha utilizzato cinque coni di Slepian e la larghezza di banda temporale è stata impostata su tre per ottenere la concentrazione spettrale ottimale. Una finestra scorrevole di 1 s e una dimensione del passo di 100 ms sono stati utilizzati per generare gli spettrogrammi tempo-frequenza e l'andamento temporale della coerenza HIP-PFC.

Come mostrato nelle Figure 2 e 3, la somministrazione di soluzione salina non ha prodotto alcun effetto percepibile sugli spettri di potenza degli LFP in HIP e PFC, né sulla coerenza HIP-PFC. Sia la retigabina che la clozapina hanno dimostrato chiare riduzioni della potenza della banda gamma (30-100 Hz) nell'HIP e nella PFC, nonché della coerenza HIP-PFC della banda gamma. Al contrario, 4-AP ha mostrato gli effetti opposti, caratterizzati da una maggiore potenza della banda gamma in HIP e PFC, insieme a una maggiore coerenza all'interno della banda gamma tra HIP e PFC.

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Figura 1: Schema della configurazione sperimentale. Gli elettrodi sono stati impiantati nell'ippocampo (HIP) e nella corteccia prefrontale (PFC) per registrare i potenziali di campo locali. L'animale è stato collocato in una piccola camera di registrazione e un headstage progettato su misura è stato collegato al connettore dell'elettrodo. Ogni sessione di registrazione è iniziata con una sessione di base di 10 minuti, seguita da una sessione di droga di 30 minuti. Sono stati testati gli effetti di soluzione salina, clozapina, 4-AP e retigabina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: L'impatto dei farmaci antipsicotici e dei modulatori dei canali del potassio sull'attività elettrofisiologica in corso nell'ippocampo (HIP) e nella corteccia prefrontale (PFC). Lo spettrogramma normalizzato dei potenziali di campo locali nell'HIP e nella PFC, insieme alla coerenza HIP-PFC, ha mostrato effetti dipendenti dal tempo per tutti i farmaci studiati. I farmaci sono stati somministrati tramite iniezione intraperitoneale al tempo t = 15 min. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: L'impatto dei farmaci antipsicotici e dei modulatori dei canali del potassio sulla densità degli spettri di potenza nell'HIP e nella PFC. 4-AP ha aumentato significativamente la potenza della banda gamma in entrambe le regioni del cervello, mentre la clozapina e la retigabina hanno soppresso la potenza della banda gamma in entrambe le regioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il protocollo qui presentato delinea la procedura per la costruzione di un headstage personalizzato specificamente progettato per la registrazione simultanea di potenziali di campo locali doppi (LFP) nell'ippocampo (HIP) e nella corteccia prefrontale (PFC). I passaggi dettagliati forniti in questo protocollo offrono informazioni sufficienti ai ricercatori per esaminare a fondo la comunicazione del segnale sia all'interno di ciascuna regione che tra HIP e PFC.

L'headstage progettato su misura utilizza un chip amplificatore commerciale. Mentre la configurazione attuale supporta la registrazione di 8 canali, l'headstage può essere facilmente adattato per ospitare l'intera capacità di 32 canali, fornendo così il potenziale per una capacità di canale estesa adatta alla registrazione di array di elettrodi. Considerando il basso costo dell'headstage, un'opzione è quella di fissare in modo permanente la tavola alla testa dell'animale. Questo approccio offre il vantaggio di ridurre al minimo gli artefatti di movimento e di ridurre il livello complessivo di disturbo causato dal movimento.

L'elettrodo su misura dimostra una registrazione stabile a lungo termine degli LFP, mantenendo una buona qualità del segnale per un arco di 3-5 mesi. Un altro approccio praticabile prevede l'impiego di circuiti stampati flessibili a base di poliimmide come array di elettrodi10,11. Questi circuiti stampati flessibili possono essere integrati con l'headstage di registrazione per consentire la registrazione multicanale. Questo metodo offre il vantaggio di semplificare la preparazione degli elettrodi e le procedure chirurgiche. Il peso dell'impianto con e senza headstage è molto leggero, rispettivamente a 0,198 g e 0,812 g, il che lo rende adatto a topi molto giovani.

Una limitazione dell'attuale tecnica di registrazione è la potenziale interferenza causata dal cavo sospeso, che può interferire con il comportamento naturale dell'animale durante gli esperimenti. Per risolvere questo problema, è possibile prendere in considerazione soluzioni alternative come l'utilizzo di una scheda SD per l'archiviazione dei dati o l'implementazione di un modulo trasmettitore di segnale wireless.

Un passaggio essenziale e critico del protocollo riguarda il posizionamento accurato dell'elettrodo. È fondamentale garantire un posizionamento preciso e coerente degli elettrodi per consentire la comparabilità tra gli esperimenti. Per verificare la posizione dell'elettrodo, è necessario eseguire l'istologia12. Una tecnica utile per migliorare il corretto posizionamento dell'elettrodo nell'HPC è quella di registrare mentre l'elettrodo è inserito verticalmente, poiché forti ritmi theta e l'attivazione neuronale indicheranno il posizionamento corretto. Si consiglia di utilizzare topi adulti di età superiore a 8 settimane, poiché la qualità del segnale potrebbe diminuire nel tempo o causare un posizionamento errato con l'avanzare dell'età. Tenere conto di queste considerazioni aiuterà a mantenere l'affidabilità e la validità dei risultati sperimentali.

In conclusione, il protocollo presentato in questo articolo fornisce un quadro per studiare la comunicazione del segnale tra regioni cerebrali distinte. Consente ai ricercatori di esplorare le dinamiche neuronali e le interazioni all'interno e tra queste regioni.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalla Royal Melbourne Hospital Neuroscience Foundation (A2087).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubo di ottone Albion Alloys, USADiametro interno di 0,45 mm
Carprofen Rimadyl, Pfizer Animal Health 
Chip amplificatore commercialeIntantechRHD 2132
Scheda di controllodi registrazioneIntantech
Cemento dentale Paladur
TermorestringentiPanduit0,8 mm di diametro
M1.2 vite in acciaio inossidabileStrumenti per orologiOrologio e vite
Connettore femmina multicanale Harwin, AUpasso 1,27 mm, presa
con fili di tungsteno rivestiti in PFA A-M SYSTEMS, USADiametro interno di 150 µ m 
Flusso a base di acido fosforicoChip QuikCQ4LF-0.5
Software di registrazioneIntantechRHX Software
Stereotactic FrameWorld Precision InstrumentsMouse strumento
Super collaUHUUltra veloce
Sistema RHDper orologiper circuito stampatodi registrazionestereotassico

Riferimenti

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