Utilizzo dell'imaging dal vivo ex vivo per studiare le divisioni e i movimenti cellulari durante il rinnovamento dentale del topo

Negli ultimi due decenni, l'incisivo di topo è emerso come una piattaforma inestimabile per studiare i principi della regolazione delle cellule staminali adulte e della rigenerazione dei denti ^1,2. L'incisivo del topo cresce continuamente e si rinnova per tutta la vita dell'animale. Lo fa mantenendo sia le cellule staminali epiteliali che quelle mesenchimali, che possono auto-rinnovarsi e differenziarsi in diversi tipi di cellule del dente ^1,2. Mentre le cellule staminali epiteliali dentali danno origine ad ameloblasti, che secernono la matrice dello smalto, le cellule staminali mesenchimali dentali danno origine a odontoblasti, cementoblasti e fibroblasti, che formano dentina, cemento e legamento parodontale, rispettivamente 3,4,5,6. Questo apporto costante di nuove cellule mantiene l'omeostasi dei tessuti e consente la sostituzione delle vecchie cellule perse a causa dell'usura masticatoria o delle lesioni ^7,8. Chiarire i meccanismi cellulari e molecolari che regolano il mantenimento e la differenziazione delle cellule staminali dentali è quindi fondamentale per comprendere la rigenerazione dentale, un'area di crescente interesse.

Anatomicamente, gran parte dell'incisivo del topo adulto è racchiuso nell'osso mascellare. Mentre il bordo incisale del dente è esposto, l'estremità apicale dell'incisivo si inserisce all'interno di una presa ed è saldamente attaccata all'osso circostante attraverso i legamenti parodontali e i tessuti connettivi (Figura 1A,B). L'estremità apicale dell'incisivo è anche la regione di crescita del dente e mantiene le cellule staminali dentali e progenitrici sia nello strato epiteliale che nella polpa mesenchimale 9,10,11,12,13. In particolare, le cellule staminali epiteliali dentali sono mantenute all'estremità bulbosa dell'epitelio, nota come gemma apicale, nota anche come ansa cervicale labiale (Figura 1C). Analogamente all'epitelio intestinale e all'epidermide, il rinnovamento epiteliale nell'incisivo è supportato principalmente dalle cellule staminali a ciclo attivo e dai loro discendenti intermedi altamente proliferativi, chiamati cellule di amplificazione del transito 14,15,16,17, entrambe residenti nella parte interna dell'ansa cervicale. Tuttavia, resta da determinare se l'epitelio incisivo contenga e utilizzi cellule staminali quiescenti durante la rigenerazione. Al contrario, nella polpa apicale sono state identificate cellule staminali mesenchimali dentali attive e quiescenti e le cellule staminali quiescenti funzionano come una popolazione di riserva che si attiva durante la riparazione della lesione^13,18.

Molte delle scoperte sulla biologia del rinnovamento e della rigenerazione degli incisivi del topo sono il risultato di indagini istologiche, in cui i campioni vengono ottenuti in giunture temporali distinte, fissati, processati e quindi sezionati in fette sottili come un micron lungo un particolare piano. Attraverso un'analisi dettagliata delle sezioni istologiche di diversi modelli murini che consentono il tracciamento del lignaggio o delle perturbazioni genetiche, gli scienziati hanno identificato i lignaggi cellulari di diverse popolazioni di progenitori, nonché le vie genetiche e di segnalazione che controllano l'omeostasi degli incisivi e la riparazione delle lesioni 19,20,21. Tuttavia, le immagini statiche bidimensionali (2D) di cellule non vitali in sezioni non possono catturare l'intero spettro dei comportamenti cellulari e delle organizzazioni spaziali nei tessuti viventi, come i cambiamenti di forma delle cellule, i movimenti e la cinetica cellulare. Rilevare e misurare questi rapidi cambiamenti cellulari, che si verificano su una scala temporale che non è risolvibile attraverso il sezionamento dei tessuti, richiede una strategia diversa. Inoltre, l'acquisizione di tali informazioni è fondamentale anche per comprendere come le cellule dentali interagiscono tra loro, reagiscono a diversi stimoli di segnalazione e si auto-organizzano per mantenere le strutture e le funzioni dei tessuti.

L'avvento dell'imaging dei tessuti profondi a quattro dimensioni (4D) utilizzando la microscopia a due fotoni²², una tecnologia che integra tre dimensioni spaziali con la risoluzione temporale, supera i limiti intrinseci dell'analisi istologica consentendo l'esame spazio-temporale di espianti di tessuti in coltura, organoidi o persino tessuti in situ 23,24,25,26 . Ad esempio, l'imaging dal vivo 4D dell'epitelio dentale in via di sviluppo ha svelato i modelli spazio-temporali delle divisioni e delle migrazioni cellulari che coordinano la crescita dei tessuti, la formazione del centro di segnalazione e la morfogenesi dell'epitelio dentale 27,28,29,30,31,32. Nell'incisivo di topo adulto, l'imaging 4D è stato recentemente adattato per studiare i comportamenti cellulari durante la riparazione del danno epiteliale dentale. L'imaging dal vivo ha rivelato che le cellule intermedie dello strato soprabasale possono essere convertite direttamente in ameloblasti nello strato basale per rigenerare l'epitelio danneggiato, sfidando il paradigma tradizionale della riparazione del danno epiteliale¹⁵.

Qui, descriviamo la dissezione, la coltura e l'imaging dell'incisivo di topo adulto, concentrandoci sulle cellule epiteliali nell'ansa cervicale labiale (Figura 1). Questa tecnica preserva la vitalità delle cellule dentali per più di 12 ore e consente il monitoraggio in tempo reale delle cellule marcate con fluorescenza con una risoluzione a singola cellula. Questo approccio consente di studiare il movimento e la migrazione delle cellule, nonché i cambiamenti dinamici nella forma delle cellule e nell'orientamento della divisione in condizioni di coltura normali o in risposta a perturbazioni genetiche, fisiche e chimiche.

Tutti i topi sono stati mantenuti in strutture per animali prive di agenti patogeni presso l'Università della California di Los Angeles (UCLA) o l'Università Ebraica di Gerusalemme (HUJI). Tutti gli esperimenti che hanno coinvolto i topi sono stati eseguiti secondo le normative e i protocolli approvati dal rispettivo Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) o (MD-23-17184-3; HUJI). Un flusso di lavoro generale delle fasi sperimentali è mostrato nella Figura 2A. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti gli strumenti, i reagenti e i materiali utilizzati in questo protocollo.

1. Preparazione di soluzioni e gel

1. Terreno di dissezione: Preparare DMEM/F12 fresco con lo 0,5% di glucosio e tenerlo in caldo a 37 °C fino al momento del passaggio 2.4.
   NOTA: Utilizziamo DMEM/F12 senza rosso fenolo per ridurre l'autofluorescenza durante l'imaging dal vivo.
2. 1x terreno di coltura: preparare terreno fresco utilizzando il 50% di DMEM/F12, il 50% di siero di ratto, 1 sostituto della glutammina, 1 aminoacidi non essenziali MEM, 1% di glucosio, 0,1 mg/mL di acido L-ascorbico e 0,5% di penicillina-streptomicina. Tenerlo in caldo a 37 °C fino al momento 5.5. Questo terreno viene utilizzato per la coltura di espianti di incisivi durante l'imaging dal vivo.
   NOTA: Il siero di ratto deve essere di alta qualità e appositamente preparato per la coltura di tessuti interi da ricercatori o da una fonte commerciale. In particolare, il sangue deve essere centrifugato (per 5 minuti a 1.200 × g a temperatura ambiente) prima che inizi a formarsi la coagulazione. Dopo la centrifugazione, il coagulo di fibrina risultante deve essere spremuto e scartato³³.
3. Gel di coltura: lo scopo del gel è quello di immobilizzare i campioni durante l'imaging e viene preparato fresco.
   1. Preparare un gel al 2% in DMEM/F12 sciogliendo 200 mg di agarosio a basso punto di fusione in 10 mL di DMEM/F12 utilizzando un forno a microonde. Mantenere il gel al 2% a 37 °C.
   2. Preparare 2 terreni di coltura (senza DMEM/F12) mescolando il 50% di siero di ratto, 1 sostituto della glutammina, 1 aminoacidi non essenziali MEM, 1% di glucosio, 0,1 mg/mL di acido L-ascorbico e 0,5% di penicillina-streptomicina. Riscaldare il terreno di coltura 2x (senza DMEM/F12) a 37 °C.
   3. Preparare un gel di coltura all'1% mescolando volumi uguali di gel al 2% e 2 terreni di coltura (senza DMEM/F12). Mantenere il gel di coltura all'1% a 37 °C fino al momento del passaggio 5.1.
      NOTA: Assicurarsi che tutte le soluzioni siano calde prima di mescolarle per evitare che gelifichino. Abbiamo trovato che il gel all'1% è adatto per la coltura dell'incisivo di topo adulto. La percentuale di gel deve essere determinata empiricamente se devono essere coltivati altri tessuti.

2. Estrazione delle mandibole di topo adulto

1. Sopprimere i topi all'età desiderata utilizzando procedure standard approvate dalla IACUC.
   NOTA: Qui usiamo l'asfissia da CO₂ seguita da lussazione cervicale. Le normative per l'eutanasia degli animali possono variare nelle diverse regioni. I ricercatori dovrebbero ottenere la necessaria approvazione istituzionale prima di eseguire esperimenti e garantire il rispetto delle normative locali sulla cura degli animali.
2. Disinfettare il topo con etanolo al 70%.
3. Decapita il topo ed estrai le mandibole sinistra e destra.
   1. Appoggia il mouse sulla pancia, quindi usa una lama di rasoio industriale a filo singolo #9 per tagliare la regione del collo e separare la testa del mouse dal resto del corpo.
      NOTA: Se devono essere prelevati anche tessuti della faringe o della regione del collo, la decapitazione non deve essere eseguita e si può procedere direttamente al passaggio 2.3.2.
   2. Capovolgi il mouse in modo che il suo lato ventrale sia rivolto verso l'alto e le mandibole siano facilmente accessibili.
   3. Fissa la testa dell'animale tenendola delicatamente tra il pollice e l'indice.
   4. Usa la lama del rasoio per praticare un'incisione sagittale a metà che taglia la pelle della mascella inferiore dal labbro inferiore verso la scollatura.
      NOTA: Una lama chirurgica #15 può essere utilizzata anche per eseguire l'incisione e le successive dissezioni (passaggi 2.3.6-2.3.9).
   5. Mentre viene praticata l'incisione, aprire la pelle tagliata usando il pollice e l'indice per esporre i muscoli e l'osso mascellare sottostante.
   6. Usa la lama del rasoio per recidere i muscoli massetere sul lato vestibolare della mascella inferiore, in modo tale che l'esterno degli emimandiboli sinistro e destro sia ora libero da attacchi muscolari.
   7. Recidere i muscoli miloioidei lungo il lato interno della mandibola per rimuovere gli attacchi muscolari lì.
   8. Praticare un'altra incisione sulla sinfisi mandibolare che collega le due emimandibili. Una volta tagliata, la mandibola verrà separata nelle metà sinistra e destra.
   9. Incuneare la lama del rasoio tra il condilo mandibolare e l'articolazione mandibolare temporale e sezionare con cura l'emimandibile dal resto della testa.
      NOTA: Abbiamo trovato utile tirare delicatamente contemporaneamente l'incisivo durante il taglio. Bisogna fare attenzione per evitare di rompere la mandibola e danneggiare i tessuti molli all'interno.
4. Trasferire immediatamente le mandibole sezionate in una capsula di Petri con il terreno di dissezione preriscaldato (passaggio 1.1) e rimuovere i tessuti muscolari rimanenti utilizzando una lama chirurgica #15.
   NOTA: La conservazione dei campioni in terreni freddi rallenta l'attività cellulare, con conseguente ritardo o addirittura mancato recupero di alcune attività cellulari, come la proliferazione o il movimento cellulare, durante l'imaging dal vivo.

3. Isolamento dell'intero incisivo del topo

NOTA: L'ulteriore isolamento dell'incisivo viene eseguito al microscopio a dissezione in campo chiaro.

1. Identifica visivamente la regione ovale della mandibola che copre l'incavo dell'incisivo e ospita la porzione apicale dell'incisivo.
2. Posizionare la mandibola in modo che la superficie interna (linguale) sia rivolta verso l'alto.
3. Tenendo la mandibola in posizione con un paio di pinze seghettate, generare una finestra nella regione ovale radendo l'osso della membrana sovrastante utilizzando una lama chirurgica #15, in una direzione che va dal condilo verso i molari. Questo espone il tessuto molle dell'incisivo apicale sulla superficie interna.
4. Capovolgi la mandibola in modo che la superficie esterna (buccale) sia rivolta verso l'alto.
5. Generare una finestra nella regione ovale della mandibola esterna come descritto nel passaggio 3.3 e utilizzare la punta del bisturi per rimuovere eventuali frammenti ossei rimanenti sul bordo. Assicurarsi che l'estremità apicale del dente sia visibile da entrambi i lati.
   NOTA: Evitare una pressione eccessiva durante la rasatura delle ossa per evitare danni ai tessuti molli sottostanti.
6. Tagliare sistematicamente le ossa che circondano l'incisivo per isolare l'intero dente.
   1. Eseguire un taglio netto su un piano immediatamente adiacente all'incisivo apicale per rimuovere prima il processo condilare.
      NOTA: Fare attenzione a non tagliare l'incisivo.
   2. Eseguire un secondo taglio appena posteriore al 3° molare, ma dorsale all'incisivo senza danneggiare il dente. Questo rimuove l'osso che include il processo coronoideo.
   3. Tagliare in serie dalla punta del processo angolare verso l'incisivo per rimuovere gradualmente la mandibola ventrale in modo graduale.
      NOTA: L'epitelio dentale e i tessuti parodontali associati sono spesso attaccati all'osso e facilmente strappati se un'ampia porzione dell'osso ventrale viene tagliata contemporaneamente. Per separare l'osso dal tessuto molle dell'incisivo, si può inserire il bisturi (o un paio di pinze affilate non seghettate) tra i due tessuti all'estremità apicale dell'incisivo e far scorrere delicatamente lo strumento in avanti.
   4. Tagliare l'osso alveolare con i molari e le eventuali ossa rimanenti che sono ancora attaccate all'incisivo.
   5. L'intero incisivo è ora isolato. Trasferire l'incisivo completamente sezionato in un piatto con terreno di dissezione caldo e pulito (passaggio 1.1).
7. Ripetere i passaggi 3.2-3.6 per isolare altri incisivi come richiesto.
   NOTA: Gli incisivi mascellari/superiori del topo mantengono anche le cellule staminali adulte e possono essere utilizzati per studiare la rigenerazione dei denti³⁴. I ricercatori dentali in genere si concentrano sugli incisivi inferiori perché sono più accessibili e possono essere sezionati più facilmente rispetto agli incisivi superiori. Le differenze tra le cellule progenitrici degli incisivi mandibolari e mascellari rimangono da determinare.

4. Rimozione dei tessuti parodontali per esporre l'ansa cervicale epiteliale incisiva

1. Con l'intero incisivo sdraiato sul lato linguale e tenendo il dente in posizione con un paio di pinze seghettate, utilizzare un paio di pinze sottili #5 per iniziare a rimboccare i tessuti parodontali che coprono l'incisivo apicale e la regione dell'ansa cervicale.
2. Staccare con cautela il tessuto parodontale dalla gemma apicale, in modo tale che il lato laterale dell'ansa cervicale (o altre regioni di interesse) diventi visibile sotto l'endoscopio.
   NOTA: Prestare attenzione per evitare di danneggiare l'epitelio dentale o di staccarlo dal mesenchima. Se l'incisivo ha segnali di fluorescenza nella regione di interesse ed è disponibile un microscopio di dissezione fluorescente, i segnali di fluorescenza possono essere utilizzati per aiutare a distinguere tra i tipi di tessuto e aiutare le dissezioni. È importante eseguire in modo efficiente le sezioni 2-4 in modo che i campioni possano essere trasferiti rapidamente nei terreni di coltura e mantenuti adeguatamente attraverso la coltura dell'espianto (vedi sotto).

5. Inclusione di tessuti per coltura di espianto

1. Aggiungere 500 μL di gel di coltura caldo e non solidificato in un pozzetto in una piastra da 24 pozzetti e trasferire rapidamente gli incisivi interi sezionati nel pozzetto. Agitare la piastra un paio di volte per sciacquare gli incisivi.
2. Aggiungere 400 μL di gel di coltura caldo e non solidificato in una piastra di coltura e trasferire gli incisivi sciacquati nella capsa.
   NOTA: Utilizziamo una piastra di coltura disponibile in commercio compatibile con la configurazione di perfusione. Vedere il passaggio 6.4 per le opzioni alternative.
3. Orientare l'incisivo per posizionare la regione dell'ansa cervicale (o altre regioni di interesse) al centro della placca (Figura 2A,B) e regolare l'inclinazione dell'incisivo apicale per il piano di imaging desiderato.
   NOTA: L'orientamento del tessuto deve essere eseguito rapidamente prima della completa gelificazione.
4. Dopo che il gel è stato fissato, utilizzare un paio di pinze sottili per rimuovere il gel sopra la regione di interesse in modo che non sia coperto dal gel.
5. Aggiungere un volume sufficiente di terreno di coltura caldo pipettandolo lentamente contro il bordo della piastra per coprire appena il campione (~150 μL).
6. Spostare la coltura di espianto in un incubatore per colture cellulari a 37 °C per consentire la sedimentazione del tessuto e l'adattamento alle condizioni di coltura per 1 ora.

6. Microscopia timelapse degli espianti incisivi

NOTA: In questo esperimento, abbiamo utilizzato un microscopio verticale dotato di un obiettivo 25x per immergere l'acqua che ha un'apertura numerica di 1. In generale, una lente per immersione in acqua con un'elevata apertura numerica è più adatta per l'imaging dei tessuti profondi.

1. Accendere il microscopio e il laser a due fotoni.
2. Fissare la piastra di coltura all'adattatore del tavolino e montare l'anello dell'adattatore di perfusione sulla parte superiore (Figura 2C).
3. Collegare l'adattatore del tavolino a un regolatore di temperatura impostato per mantenere la coltura a 37 °C.
4. Collegare l'ingresso e l'uscita dell'anello adattatore a una pompa di microperfusione e iniziare la perfusione del terreno di coltura, con la velocità di perfusione impostata a 20 sulla pompa. Questo genera un flusso lento (~5 mL/h) del terreno di coltura sopra i campioni (Figura 2C).
   NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli sul sistema per mantenere il tessuto in un ambiente controllato in modo stabile. Possono essere utilizzati anche altri sistemi. È inoltre possibile utilizzare una combinazione di una piastra riscaldante a 37 °C e una piastra di coltura per perfusione fatta in casa (figura supplementare S1) con un ingresso e un'uscita collegati a pompe a siringa.
5. Posizionare un anello barriera per il controllo atmosferico (ACBR) sopra l'anello adattatore e abbassare l'obiettivo attraverso l'ACBR per entrare in contatto con il terreno di coltura (Figura 2D).
6. Regolare la lunghezza d'onda del laser a 920 nm per visualizzare sia i segnali GFP che quelli di fluorescenza rossa (ad es. tdTomato).
7. Localizzare i campioni attraverso gli oculari e poi sul software del microscopio.
8. Configura gli stack Z, l'imaging multiposizione e gli intervalli di tempo utilizzando il software. Per seguire questo protocollo, utilizzare una dimensione dello z-step di 4 μm e un intervallo di tempo di 5 min per 14 ore.
   NOTA: Abbiamo scoperto che un intervallo di tempo superiore a 5 minuti è spesso insufficiente per catturare movimenti e divisioni cellulari fluidi.
9. Avviare l'imaging timelapse.
   NOTA: La posizione del campione potrebbe cambiare durante la prima ora e potrebbero essere necessarie ulteriori regolazioni.
10. Salva i file per l'elaborazione e l'analisi dei dati a valle.

La regione apicale dell'incisivo del topo adulto è racchiusa all'interno della mandibola (Figura 1) e quindi non è direttamente accessibile per visualizzare e seguire in tempo reale le cellule progenitrici che risiedono all'interno della regione di crescita. Pertanto, abbiamo sviluppato un metodo per estrarre l'intero incisivo dall'osso mascellare e mantenerlo in un sistema di coltura di espianto per la microscopia timelapse a due fotoni (Figura 2). Qui descriviamo risultati rappresentativi che catturano il processo dinamico di proliferazione e movimento cellulare nella regione dell'ansa cervicale labiale dell'epitelio dentale.

Per dimostrare le procedure sperimentali, abbiamo utilizzato due diversi modelli murini che esprimono la fluorescenza verde nell'epitelio dentale. La prima linea del mouse è K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP, dove K14Cre (MGI:2680713) esprime la ricombinasi Cre da un promotore della cheratina 1435 e attiva l'espressione del transattivatore controllato dalla tetraciclina inversa nell'epitelio dall'allele R26rtTA 36 (MGI:3584524). Dopo la somministrazione di doxiciclina, rtTA induce l'espressione dell'istone H2B-GFP dall'allele tetO-H2B-GFP 37 (MGI:3043783) e marca i nuclei delle cellule epiteliali con fluorescenza verde. Ciò è particolarmente utile per il monitoraggio delle cellule e per rilevare le divisioni cellulari. In questo esperimento, abbiamo nutrito gli animali con cibo a base di doxiciclina per 24 ore prima del sacrificio per attivare l'espressione di H2B-GFP. La seconda linea del mouse è K14Cre; R26mT/mG, in cui R26mT/mG (MGI:3803814) è un Cre-reporter38. In assenza di attività di Cre, le cellule esprimono tdTomato (mT) localizzato sulla membrana con fluorescenza rossa. In seguito alla ricombinazione mediata da Cre, le cellule esprimono GFP di membrana (mG). K14Cre; R26mT/mG marca quindi le membrane cellulari epiteliali con fluorescenza verde, lasciando rosse le cellule non epiteliali. Ciò consente una facile visualizzazione delle forme, delle divisioni e dei movimenti delle cellule.

Abbiamo iniziato la procedura sezionando le mandibole (Figura 3A) e poi rimuovendo sistematicamente tutte le ossa che circondano l'incisivo (Figura 3B-G). In questo modo si sono ottenuti incisivi interi con epitelio intatto (Figura 3H). Abbiamo confermato l'integrità dell'epitelio dentale ispezionando la fluorescenza verde nel K14 Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP e K14Cre; TopiR26 mT/mG (Figura 4A,B,E,F). In questa fase, i tessuti parodontali opachi coprono ancora l'incisivo apicale e l'ansa cervicale appare quindi sfocata a causa della dispersione della luce, che ostacolerebbe allo stesso modo l'imaging timelapse a valle (Figura 4C,G). Abbiamo quindi rimosso con cura i tessuti parodontali, in modo che l'epitelio dentale con l'ansa cervicale potesse essere individuato in ciascun incisivo (Figura 4D,H).

Gli incisivi sono stati quindi incorporati in agarosio a basso punto di fusione e coltivati in una configurazione di perfusione per l'imaging dal vivo a due fotoni, come illustrato nella Figura 2. Per questo esercizio, ci siamo concentrati sulla regione dell'ansa cervicale dell'epitelio dentale e abbiamo catturato immagini z-stack a intervalli di 4 μm ogni 5 minuti per una durata di 14 ore (Figura 5A). In particolare, i segnali H2B-GFP sono stati osservati principalmente nella regione di amplificazione del transito dell'ansa cervicale, dove sono presenti divisioni cellulari attive (Figura 5B). Ciò è probabilmente dovuto al fatto che c'è un maggiore scambio H2B-GFP a livello delle cromatine aperte e l'incorporazione nei nucleosomi a seguito della replicazione del DNA in queste cellule attive39.

Successivamente abbiamo esaminato le immagini timelapse utilizzando ImageJ e, sulla base della separazione dei segnali H2B-GFP40, siamo stati in grado di osservare numerose divisioni cellulari durante il periodo di imaging (Supplemental Video S1 e Supplemental Video S2). Ciò ha indicato che i tessuti erano adeguatamente mantenuti nella coltura dell'espianto e che le cellule erano attive. In particolare, siamo stati in grado di osservare la condensazione e l'allineamento dei cromosomi alla piastra di metafase nelle cellule mitotiche, seguita dalla loro segregazione in due cellule figlie durante l'anafase (Figura 5C-N, tracciata manualmente utilizzando il plugin ImageJ TrackMate). La maggior parte di queste divisioni erano perpendicolari o ad un angolo obliquo rispetto alla membrana basale (Figura 5C-K e Video supplementare S1). È stato anche possibile rilevare divisioni orizzontali parallele alla membrana basale, anche se si verificano meno frequentemente (Figura 5L-N e Video supplementare S2). È importante sottolineare che la citochinesi nell'epitelio dentale spesso avviene rapidamente, entro 5-10 minuti. Di conseguenza, intervalli di timelapse superiori a 5 minuti potrebbero perdere alcune di queste divisioni.

Eventi di divisione cellulare erano evidenti anche in K14Cre; Anse cervicaliR26 mT/mG, in cui tutte le membrane cellulari epiteliali erano marcate in verde (Figura 6A). Abbiamo potuto identificare le cellule mitotiche dal loro arrotondamento cellulare e quindi dalla citochinesi (Supplemental Video S3), e le divisioni cellulari sia verticali che orizzontali erano osservabili (Figura 6B-G), quindi simili ai risultati ottenuti utilizzando H2B-GFP. Insieme, questi risultati dimostrano che questo protocollo può servire come un potente strumento per studiare i comportamenti cellulari negli espianti di incisivi se combinato con modelli genetici murini che etichettano in modo fluorescente strutture subcellulari distinte.

Figura 1: Schemi della mandibola di topo e dell'ansa cervicale incisiva. (A) Una parte significativa dell'incisivo è incorporata nell'osso mascellare. La regione di crescita si trova all'estremità apicale del dente e ne supporta la crescita continua (freccia verde scuro). (B) Un ingrossamento dell'incisivo apicale, che è circondato da tessuti parodontali. Il dente è composto da smalto e dentina, che sono strutture altamente mineralizzate formate rispettivamente da ameloblasti e odontoblasti. (C) Una sezione sagittale dell'incisivo apicale, che mostra che le cellule progenitrici epiteliali dentali e le cellule che amplificano il transito risiedono nell'ansa cervicale labiale e danno origine ad ameloblasti nell'epitelio più distale (freccia tratteggiata verde scuro). Rispetto all'ansa cervicale labiale, l'ansa cervicale linguale è di dimensioni più piccole e normalmente non forma ameloblasti. Le cellule staminali mesenchimali dentali sono presenti nella polpa dentale (regione viola) e danno origine a odontoblasti. Abbreviazioni: En = smalto; De = dentina; Am = ameloblasto; Od = odontoblasto; TAC = cellule che amplificano il transito; laCL = ansa cervicale labiale; liCL = ansa cervicale linguale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Mantenimento dell'espianto di incisivi di topo per l'imaging dal vivo. (A) Schemi che illustrano le fasi chiave del protocollo, dalla dissezione dell'incisivo all'inclusione del tessuto in agarosio a basso punto di fusione per l'imaging dal vivo. Una configurazione di perfusione viene utilizzata per fornire un apporto costante di sostanze nutritive durante l'imaging e la coltura viene mantenuta a 37 °C. (B-D) Una dimostrazione passo-passo dell'impostazione del piatto di coltura e della camera di perfusione per l'imaging dal vivo. L'ingresso e l'uscita del supporto sono visualizzati rispettivamente come frecce rosa e gialle. Abbreviazione: ACBR = Atmospheric Control Barrier Ring. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Isolamento dell'intero incisivo del topo. (A) Mascella intatta. (B-H) Le ossa sono state gradualmente rimosse per esporre l'intero incisivo. Le linee tratteggiate rosse in B e C mostrano il tessuto molle esposto dell'incisivo apicale dopo la rasatura dell'osso della membrana sovrastante i lati linguale e vestibolare dell'incavo incisivo (passaggi 3.3-3.5 del protocollo). (D-G) Le punte di freccia blu rappresentano i condili, i molari e le ossa alveolari che sono stati rimossi per isolare l'intero dente (passaggio 3.6 del protocollo). Barra della scala = 2 mm (H). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Rimozione di tessuti parodontali per l'imaging dal vivo. (A-H) Campioni rappresentativi di (A-D) K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP e (E-H) K14Cre; Nella nostra dimostrazione del protocollo sono stati utilizzati topiR26 mT/mG. Prima della dissezione, l'espressione di GFP nell'epitelio dentale era visibile attraverso l'osso (A, E, punte di freccia gialle). Linee tratteggiate bianche delineano gli incisivi non sezionati. E' indica il lato linguale. Negli incisivi isolati (B,C,F,G), la fluorescenza GFP è stata inizialmente diffratta dai tessuti parodontali che ricoprono gli incisivi apicali (punte di freccia bianche e rosse). Fluorescenza rossa nelle etichette F e G delle cellule non epiteliali. La rimozione dei tessuti parodontali consente una visione chiara e senza ostacoli delle anse cervicali fluorescenti verdi (D, H, punte di freccia verdi). Barra della scala = 2 mm (A,E); 1,25 mm (B,F); e 300 μm (C,D,G,H). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Microscopia timelapse del K14Cre; R26 rtTA; Ansa cervicale tetO-H2B-GFP. (A) Uno schema che illustra l'impostazione del timelapse. (B) un piano z rappresentativo del K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP ansa cervicale labiale incisiva, che mostra la marcatura nucleare da parte di H2B-GFP principalmente nella regione di amplificazione del transito, dove le cellule si dividono attivamente. Il riquadro giallo rappresenta l'area generale delle immagini ingrandite mostrate di seguito. (C-K) Immagini timelapse che mostrano divisioni cellulari verticali e oblique rispetto al midollo osseo. (L-N) Le immagini timelapse mostrano un esempio di divisione cellulare orizzontale rispetto al midollo osseo. (D,G,J,M) Le cellule in metafase o anafase sono visualizzate nei pannelli centrali. Gli schemi di ciascuna divisione tracciata sono mostrati a destra. Barra della scala in N = 36 μm (B); 5 μm (C-N). Abbreviazione: BM = membrana basale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Microscopia timelapse del K14Cre; Ansa cervicale R 26mT/mG. (A) un piano z rappresentativo del K14Cre; Ansa cervicale labiale incisiva R26mT/mG. Tutte le cellule epiteliali esprimono GFP di membrana. Il riquadro giallo rappresenta l'area di tracciamento delle celle mostrata negli ingrandimenti. (B-G) Immagini timelapse che catturano sia le divisioni cellulari orizzontali (B-D) che quelle verticali (E-G), rispetto al BM. (C,F) I pannelli centrali mostrano l'arrotondamento delle cellule mitotiche. Gli schemi di ciascuna divisione tracciata sono mostrati a destra. Barra della scala = 35 μm (A); 5 μm (B-G). Abbreviazione: BM = membrana basale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare S1: Piatto di perfusione fatto in casa. (A) Una piastra di coltura da 35 mm può essere utilizzata per realizzare una piastra di perfusione. È possibile utilizzare una piastra con fondo di vetro se l'imaging viene eseguito utilizzando un microscopio invertito. (B) Scaldare un chiodo con una fiamma. (C) Vengono create due aperture (punte di freccia bianche) su entrambi i lati del piatto utilizzando il chiodo riscaldato. (D) Fissare due aghi da 16 G con estremità smussata, uno come ingresso del supporto e l'altro come uscita del supporto, attraverso le aperture utilizzando colla epossidica. Se si desidera la perfusione di gas, è possibile aggiungere una terza apertura/ago al piatto. Fare clic qui per scaricare il file.

Video supplementare S1: Immagini dal vivo di un K14Cre; R26rtTA; Ansa cervicale labiale incisiva tetO-H2B-GFP , che mostra divisioni cellulari verticali e oblique. Le cellule vengono tracciate manualmente e punti di colore diverso rappresentano diverse coppie di cellule madre/figlia. Barra della scala = 30 μm (cornice sinistra); 7 μm (fotogramma destro). Clicca qui per scaricare questo video.

Video supplementare S2: Imaging dal vivo di un K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP incisivo ansa cervicale labiale, che mostra un esempio di divisione cellulare orizzontale. La divisione orizzontale avviene al segno di 10 s e viene tracciata manualmente utilizzando punti blu. Barra della scala = 30 μm (cornice sinistra); 7 μm (fotogramma destro). Clicca qui per scaricare questo video.

Video supplementare S3: Imaging dal vivo di un K14Cre; Ansa cervicale labiale incisiva R26mT/mG , che mostra divisioni cellulari sia verticali che orizzontali. Le celle vengono tracciate manualmente e i diversi cerchi colorati rappresentano diverse coppie di cellule madre/figlia. Barra della scala = 30 μm (cornice sinistra); 7 μm (fotogramma destro). Clicca qui per scaricare questo video.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.