Un modello ex vivo di metastasi peritoneali del carcinoma ovarico con omento umano

Sommario

Questo protocollo descrive la creazione di un modello tridimensionale (3D) ex vivo dell'interazione cellula tumorale-omento. Il modello fornisce una piattaforma per chiarire i meccanismi pro-tumorali all'interno della nicchia adiposa e per testare nuove terapie.

Abstract

Il cancro ovarico è il tumore maligno ginecologico più mortale. L'omento svolge un ruolo chiave nel fornire un microambiente di supporto alle cellule di carcinoma ovarico metastatico, nonché segnali immunomodulatori che consentono la tolleranza al tumore. Tuttavia, abbiamo modelli limitati che imitano da vicino l'interazione tra le cellule tumorali ovariche e i tessuti ricchi di adiposo. Per comprendere ulteriormente i meccanismi cellulari e molecolari attraverso i quali l'omento fornisce un microambiente pro-tumorale, abbiamo sviluppato un modello 3D ex vivo unico dell'interazione cellula tumorale-omento. Utilizzando l'omento umano, siamo in grado di far crescere cellule tumorali ovariche all'interno di questo microambiente ricco di adiposi e monitorare i fattori responsabili della crescita del tumore e della regolazione immunitaria. Oltre a fornire una piattaforma per lo studio di questo microambiente tumorale ricco di adiposi, il modello fornisce un'eccellente piattaforma per lo sviluppo e la valutazione di nuovi approcci terapeutici per colpire le cellule tumorali metastatiche in questa nicchia. Il modello proposto è facile da generare, poco costoso e applicabile alle indagini traslazionali.

Introduzione

Il carcinoma ovarico è la neoplasia ginecologica più letale al mondo¹. Il rischio di sviluppare questo tumore nel corso della vita è di circa 1 su 70, con un'età mediana di diagnosi di 63 anni². Le neoplasie ovariche primarie sono classificate istologicamente come epiteliali o non epiteliali. I tumori ovarici epiteliali (EOC) rappresentano oltre il 90% dei tumori e il sottotipo più comune è il carcinoma sieroso di alto grado (HGSC), che rappresenta circa il 70%-80% degli EOC. Attualmente, non esistono metodi di screening efficaci per rilevare precocemente la malattia. Quindi la maggior parte dei pazienti viene diagnosticata in uno stadio avanzato (cioè Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO] stadio III o IV) dopo che il cancro si è diffuso in tutta la cavità peritoneale².

Il trattamento standard di prima linea è la chirurgia citoriduttiva per rimuovere tutta la malattia macroscopica visibile, seguita da chemioterapia adiuvante a base di platino per distruggere qualsiasi malattia microscopica residua. Sebbene ci siano stati molti progressi nel trattamento del cancro ovarico negli ultimi due decenni, circa il 70% delle pazienti con malattia avanzata avrà una recidiva entro 3 anni dal trattamento³. Data la prognosi complessivamente sfavorevole di questi pazienti, gli sforzi di ricerca traslazionale in corso e futuri nell'EOC mirano a identificare biomarcatori per la diagnosi precoce, prevenire le metastasi, migliorare le terapie attuali per eludere la resistenza e sviluppare nuovi trattamenti personalizzati per il cancro.

Le metastasi generalizzate all'interno della cavità peritoneale e la chemioresistenza associata sono due delle principali limitazioni per il miglioramento del trattamento delle pazienti con carcinoma ovarico ^4,5. L'omento, una struttura grassa simile a un grembiule che pende dallo stomaco sopra l'intestino, è una delle principali sedi di metastasi del cancro ovarico ^6,7. Oltre alla sua funzione di barriera fisica, è stato dimostrato che l'omento ha capacità rigenerative e angiogeniche e possiede attività immunitarie, che insieme promuovono la vascolarizzazione, accelerano la guarigione delle ferite e limitano le infezioni⁸. Contiene un'alta concentrazione di cellule staminali che possono differenziarsi in vari tipi di cellule e possono aiutare a riparare i tessuti danneggiati. L'omento può infiammarsi in risposta a lesioni o infezioni, che innescano la migrazione delle cellule immunitarie verso il sito della lesione⁹. Queste cellule immunitarie rilasciano fattori di crescita e altre molecole che aiutano a promuovere la riparazione e la rigenerazione dei tessuti danneggiati. Le cellule immunitarie, come macrofagi, linfociti e plasmacellule, localizzate nell'omento sono strutture note come "macchie lattiginose", responsabili del rilevamento e dell'attacco degli agenti patogeni e della regolazione dell'immunità peritoneale. È stato anche dimostrato che l'omento svolge un ruolo nell'indurre la tolleranza immunitaria¹⁰, che è la capacità del sistema immunitario di tollerare gli autoantigeni e non attaccare i tessuti sani. Tuttavia, le stesse attività immuno-correlate sono coinvolte anche nelle risposte patologiche, come la crescita di tumori omentali, le metastasi e la fuga dalla sorveglianza immunitaria ^9,11. Precedenti studi del nostro laboratorio e di altri hanno dimostrato un ruolo unico e attivo del microambiente adiposo nell'inibizione delle risposte immunitarie antitumorali e nell'acquisizione della chemioresistenza^12,13,14. Purtroppo, abbiamo informazioni limitate sui meccanismi cellulari e molecolari attraverso i quali l'omento fornisce un microambiente pro-tumorale.

Per comprendere meglio le interazioni tra le cellule tumorali e l'omento, è stato sviluppato un sistema di coltura 3D costituito da cellule di cancro ovarico umano ed espianti di omento derivati da pazienti. Il protocollo qui descritto rappresenta un nuovo modello ex vivo di carcinosi peritoneale. Questo modello imita la progressione naturale della tumorigenesi del cancro ovarico in questo tessuto ricco di adiposi. Il modello proposto è facile da generare, poco costoso e potenzialmente applicabile alle indagini traslazionali nella ricerca sul cancro ovarico.

Protocollo

Il seguente protocollo di ricerca è stato esaminato e approvato dal Wayne State University Institutional Review Board (IRB). Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti prima dell'intervento chirurgico. La Figura 1 illustra i tre passaggi generali di questo protocollo.

1. Preparazione del tessuto di omento umano

1. Preparare il terreno di coltura dell'omento (DMEM/F12 + 10% siero fetale bovino + 1% penicillina-streptomicina) e conservare a 4 °C. Aliquotare 30-40 mL di questo terreno in una provetta conica sterile da 50 mL o in un contenitore per campioni chirurgici.
2. Ottenere campioni chirurgici da un intervento di biopsia omentale o omentectomia. Immergere il campione sterile in terreni di coltura dell'omento subito dopo la rimozione in sala operatoria. Se il flusso di lavoro non lo consente, posizionare il campione nel terreno di coltura dell'omento il prima possibile. Trasferire il campione mettendolo su ghiaccio e conservarlo a 4 °C fino al trattamento.
   NOTA: La dimensione del campione di omento rimosso determinerà la quantità di tessuto lavorabile.
3. Processare il campione di omento entro 1-2 ore dalla raccolta utilizzando una cappa a flusso laminare. Assicurarsi che tutti i materiali e gli strumenti siano sterili o sterilizzati.
4. Rimuovere l'omento dal contenitore di raccolta e trasferirlo in un piatto di coltura da 100 mm. Immergere il campione in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS) e lavare delicatamente il campione per rimuovere eventuali coaguli di sangue o detriti.
5. Tagliare il tessuto in pezzi (0,5 cm x 0,5 cm o 100-200 mg; Figura 2A) utilizzando piccole forbici chirurgiche o un bisturi da 10-15 mm. Utilizzare piccole pinze chirurgiche per aiutare a manipolare il tessuto ed evitare di schiacciare l'omento. Se è stato utilizzato un dispositivo energetico per rimuovere chirurgicamente il campione di omento, evitare di utilizzare il tessuto distorto sul bordo sigillato.
6. Posizionare ogni pezzo di omento tagliato in singoli pozzetti di una piastra di coltura a 24 pozzetti e riempire i pozzetti con 500 μL di terreno di coltura per omento o fino a un volume sufficiente a coprire l'omento senza consentire al pezzo di omento di galleggiare sopra il pavimento del pozzetto (Figura 2B).
7. Conservare i pezzi di omento in terreni di coltura freschi a 4 °C fino al momento dell'iniezione.

2. Preparazione delle cellule tumorali ovariche

1. Colture di cellule di carcinoma ovarico umano in un matraccio da 75 cm 2 a 37 °C e 5% di CO₂ ad almeno il 75% di confluenza entro il giorno della raccolta dell'omento.
   NOTA: Questo protocollo utilizza cellule di carcinoma ovarico umano OCSC1-F2 mCherry-positive precedentemente descritte^15,16,17,18. Può essere modificato in qualsiasi linea cellulare tumorale marcata con un segnale di fluorescenza.
2. Preparare le cellule all'interno di una cappa a flusso laminare subito dopo la raccolta del campione di omento. Assicurarsi che tutti i materiali e gli strumenti siano sterili o sterilizzati.
3. Aggiungere 10 ml di PBS sterile 1x al pallone di coltura e lavare le cellule facendo oscillare delicatamente il pallone. Rimuovere 1x PBS e quindi aggiungere 3 mL di tripsina-EDTA allo 0,05%.
4. Agitare delicatamente il pallone di coltura per rivestire tutte le cellule, quindi porre il pallone in un incubatore (37 °C e 5% di CO₂ ) per non più di 5 minuti. Picchiettare il pallone di coltura per staccare completamente le cellule, quindi neutralizzare la tripsina aggiungendo 3 mL di terreno di coltura dell'omento.
5. Miscelare la sospensione cellulare mediante pipettaggio, quindi trasferire la sospensione in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare la sospensione per 5 minuti a 1.200 x g a 24 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 6 mL di terreno di coltura fresco per omento.
6. Conta le cellule usando un ematotometro. Diluire la sospensione cellulare ad almeno 100.000 cellule per 100-200 μL di sospensione. Questo è il volume di iniezione in ogni pezzo tagliato di omento.
7. Trasferire un numero appropriato di cellule in un nuovo matraccio di coltura per continuare il passaggio cellulare.

3. Iniezione di cellule tumorali ovariche

1. Utilizzare una siringa da 1 mL per aspirare la sospensione cellulare, quindi inserire un ago da 26 G. Non aspirare la sospensione cellulare con l'ago, poiché ciò può frammentare le cellule.
2. Usa piccole pinze chirurgiche per raccogliere un pezzo di omento tagliato. Trasferire l'omento in una capsula sterile separata per facilitare l'iniezione. Perforare delicatamente l'omento con la punta dell'ago e iniettare un piccolo volume di sospensione cellulare nel tessuto (Figura 2C).
3. Ripetere l'iniezione su diverse aree di omento fino a un volume totale di almeno 100 μL o 100.000 cellule. Si noti che gran parte della sospensione cellulare può sembrare ristagnare intorno al campione. In caso di dubbi sulla qualità dell'iniezione, ripetere l'iniezione o iniettare un volume maggiore di sospensione cellulare nel campione.
4. Restituire i campioni di omento iniettati in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 24 pozzetti. Si noti che il volume dei terreni di coltura dell'omento è a un livello tale da coprire l'omento senza lasciarlo galleggiare. Maneggiare con cura la piastra e posizionarla all'interno di un'incubatrice (37 °C e 5% di CO₂ ).
5. OPZIONALE: Utilizzare Matrigel (matrice di membrana basale) per sospendere il tessuto dell'omento in una matrice solida per consentire un'iniezione più facile e una somministrazione di sospensione cellulare più concentrata.
   1. Scongelare la matrice di membrana basale a 4 °C e miscelare in rapporto 1:1 con terreni di coltura per omento immediatamente prima dell'uso. Conservare la miscela di matrice di membrana basale su ghiaccio o a 4 °C fino all'iniezione. Riempire i pozzetti vuoti con una quantità sufficiente di miscela di matrice di membrana basale per immergere un pezzo tagliato di omento.
   2. Posizionare i campioni nella miscela di matrice della membrana basale e quindi posizionare la piastra di coltura a 24 pozzetti in un incubatore (37 °C e 5% di CO₂ ) per 20 minuti. Una volta che la miscela si è solidificata, continuare con l'iniezione come descritto sopra.
6. Confermare l'avvenuta iniezione utilizzando l'imaging fluorescente. Assicurarsi che venga visualizzata una striscia di segnale fluorescente nei siti di iniezione (Figura 2D). Si noti che il numero effettivo di cellule attaccate all'omento dopo l'iniezione è imprevedibile.

4. Co-coltura di cellule tumorali umane e tumorali ovariche

1. Cambiare terreno ogni 48-72 ore aggiungendo 500-2000 μL di terreno di coltura fresco per omento. Non pipettare il terreno direttamente sopra il tessuto dell'omento, poiché ciò potrebbe spostare le cellule tumorali. Si noti che se il colore del supporto diventa giallo, cambiare il supporto.
   NOTA: La frequenza di sostituzione del terreno dipenderà dal volume del terreno utilizzato e dalla traiettoria di crescita delle cellule tumorali. Una volta che le cellule tumorali hanno seminato l'omento, non è più importante se il pezzo di omento galleggia o meno.
2. OPZIONALE: Se è stata utilizzata una matrice di membrana basale, la matrice verrebbe in genere dissolta al momento del primo cambio di fluido.
3. Monitorare la crescita dei tumori del cancro ovarico utilizzando l'imaging fluorescente. La frequenza dell'imaging è a discrezione dello sperimentatore. Anticipare l'evidenza di tumori di piccole dimensioni di circa 14 giorni (Figura 3A-C). I risultati possono variare a seconda della qualità dell'iniezione.
4. Terminare l'esperimento in base all'endpoint dell'esperimento.
   NOTA: La crescita del tumore e l'integrità del tessuto omentoso sono state osservate negli ultimi 50 giorni.

Risultati

L'insediamento riuscito delle cellule di carcinoma ovarico in campioni di omento è stato evidente intorno al giorno 14 (Figura 3A-C). Almeno 24 repliche sono state preparate e iniettate per ogni campione raccolto per consentire ulteriori esperimenti. La crescita del tumore è stata monitorata scattando immagini fluorescenti (Figura 3D,E). Le immagini dovevano essere attentamente interpretate poiché un monostrato ...

Discussione

Utilizzando questo protocollo, è stato sviluppato un modello preclinico di carcinosi peritoneale per il carcinoma ovarico utilizzando una combinazione di tecniche di base in vitro ed ex vivo. Una crescita progressiva del tumore è stata osservata in 50 giorni di co-coltura dopo aver seminato campioni di omento con cellule di carcinoma ovarico umano mCherry+ OCSC1-F2. Questo metodo è stato sviluppato e ottimizzato in diverse prove sperimentali utilizzando diversi campioni di omento. Il successo della cres...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,05% Tripsina-EDTA (1x)	Gibco	25300054
Siringa da insulina da 1 ml con ago staccabile da 26 G	BD	329652
Pipette sierologiche da 10 ml	CELLTREAT	229010B
Piatto per coltura tissutale da 100 mm	Fisherbrand	FB012924
Tubo da centrifuga da 15 mL	CELLTREAT	229411
24 pozzetti Piastra di coltura	Costar	3524
Provetta da centrifuga da 50 mL	CELLTREAT	229421
75 cm2 Pallone per coltura tissutale	CELLTREAT	229341
Corning Cell Counter Corning		9819000
Cytation 5 imager	Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutammina, +2.438 g/L di sodio Gibco bicarbonato		11320033
siero fetale bovino, qualificato	Gibco	1043028
Matrigel	Corning	356230	Matrice a membrana basale
n. 10 Bisturi monouso in acciaio inossidabile	Integra-Miltex	4410
Penicillina Streptomicina	Gibco	15140122
salina tamponata con fosfato, pH 7,4 ( 1x)	Microscopio Gibco	10010023
Revolve	Echo

soluzione