Articolo metodologico

Estrazione del veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale

DOI:

10.3791/66032

⸱

6 ottobre 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Nanjing Agricultural University, 2Key Laboratory of Integrated Pest Management of Crop of East China, Ministry of Agriculture, 3Sanya Institute of Nanjing Agricultural University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui presentiamo un protocollo per l'estrazione del veleno da Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale creato con film di polietilene e soluzione di amminoacidi.

Abstract

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Le vespe parassitoidi sono un gruppo eterogeneo di insetti imenotteri che fungono da risorse inestimabili per il biocontrollo dei parassiti. Per garantire il successo del parassitismo, le vespe parassitoidi iniettano veleno nei loro ospiti per sopprimere l'immunità dei loro ospiti, modulare lo sviluppo, il metabolismo e persino il comportamento degli ospiti. Con oltre 600.000 specie stimate, la diversità delle vespe parassitoidi supera quella di altri animali velenosi, come serpenti, lumache a cono e ragni. Il veleno di vespa parassitoide è una fonte poco esplorata di molecole bioattive con potenziali applicazioni nel controllo dei parassiti e nella medicina. Tuttavia, la raccolta del veleno parassitoide è impegnativa a causa dell'impossibilità di utilizzare la stimolazione diretta o elettrica e della difficoltà di dissezione a causa delle loro piccole dimensioni. Trichogramma è un genere di vespe parassitoidi di minuscole (~0,5 mm) uova ampiamente utilizzate per il controllo biologico dei parassiti lepidotteri sia in agricoltura che nelle foreste. Riportiamo qui un metodo per estrarre il veleno da T. dendrolimi utilizzando ospiti artificiali. Questi ospiti artificiali vengono creati con film di polietilene e soluzioni di amminoacidi e poi inoculati con vespe Trichogramma per il parassitismo. Il veleno è stato successivamente raccolto e concentrato. Questo metodo consente l'estrazione di grandi quantità di veleno di Trichogramma evitando la contaminazione da altri tessuti causata dalla dissezione, un problema comune nei protocolli di dissezione del serbatoio del veleno. Questo approccio innovativo facilita lo studio del veleno di Trichogramma , aprendo la strada a nuove ricerche e potenziali applicazioni.

Introduzione

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Le vespe parassitoidi sono insetti imenotteri parassiti che rappresentano importanti risorse per la lotta biologica1. Esiste un'ampia varietà di vespe parassitoidi, con oltre 600.000 specie stimate2. La diversità delle vespe parassitoidi supera di gran lunga quella di altri artropodi velenosi, come serpenti, lumache a cono, ragni, scorpioni e api. Il veleno è un importante fattore parassitario nelle vespe parassitoidi. Per il successo del parassitismo, il veleno viene iniettato nell'ospite, modulando il comportamento, l'immunità, lo sviluppo e il metabolismodell'ospite 3. Inoltre, il veleno delle vespe parassitoidi mostra una notevole diversità nelle sue strutture molecolari, nei suoi bersagli e nelle sue funzioni, riflettendo la complessa coevoluzione con i loro ospiti. Pertanto, il veleno parassitoide è una risorsa preziosa e sottovalutata di molecole attive per scopi insetticidi o medici4. A differenza del veleno di serpenti, lumache, ragni, scorpioni e api, il veleno di vespe parassitoidi non può essere raccolto mediante stimolazione diretta o elettrostimolazione5. L'attuale metodo di estrazione del veleno di vespa parassitoide consiste nel sezionare il serbatoio del veleno. Tuttavia, le vespe parassitoidi sono spesso piccole e la dissezione delle vespe parassitoidi richiede elevate competenze tecniche. Pertanto, se riusciamo a trovare un modo per raccogliere il veleno delle vespe parassitoidi in modo efficiente e conveniente, sarà di grande aiuto ricercare il veleno delle vespe parassitoidi.

Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) è un genere di minuscole vespe parassitoidi (lunghe ~0,5 mm)6. Queste vespe sono tra gli agenti di biocontrollo più utilizzati, in particolare per le uova di vari parassiti lepidotteri sia in agricoltura che nelle foreste. Ad esempio, T. dendrolimi, una delle specie di Trichogramma più utilizzate in Cina, è stata ampiamente applicata per controllare una varietà di parassiti agricoli e forestali, come Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis e Chilo suppressalis. Studi precedenti hanno dimostrato che le vespe Trichogramma potevano iniettare le loro uova in ospiti artificiali7. Gli ospiti artificiali possono essere creati utilizzando materiali come cera8, agar9, Parafilm10 e film plastico11. La soluzione in ospiti artificiali che induce un'ovideposizione sufficiente per Trichogramma può essere semplice, come amminoacidi o sali inorganici12. Sulla base della caratteristica che T. dendrolimi può parassitare gli ospiti artificiali, questo studio fornisce un nuovo metodo per estrarre il veleno dalle vespe parassitoidi utilizzando ospiti artificiali. Questo approccio mira ad affrontare le carenze di bassa resa, bassa purezza e suscettibilità alla contaminazione nelle attuali tecniche di estrazione. Utilizzando questo metodo, è possibile estrarre una grande quantità di veleno ad alta purezza da T. dendrolimi , che soddisfa le esigenze della ricerca scientifica e dello screening di molecole bioattive per scopi insetticidi o medici.

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Protocollo

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1. Allevamento di insetti

  1. Somministrare Corcyra cephalonica con farina di mais ad una temperatura di 26 ± 1°C e un'umidità relativa del 40% ± 10%.
  2. Allevare il ceppo di T. dendrolimi dell'insetto Jilin indoor utilizzando le uova di Corcyra cephalonica come ospiti. Nutrire gli adulti di vespe con acqua di saccarosio al 10% in provette di Drosophila a una temperatura di 26 ± 1 °C, umidità relativa del 70% ± 10%, luce (L): buio (D) periodo di 14 h: 10 h.

2. Preparazione delle carte uovo in film plastico di polietilene

  1. Prendi una pellicola di plastica in polietilene con una lunghezza di 16 cm, una larghezza di 12 cm e uno spessore di 20 μm. Pressare 30 sporgenze semicircolari con un diametro di 2-3 mm e un'altezza di circa 3 mm utilizzando un'asta di molatura del vetro secondo la disposizione standard della piastra PCR di 96 fori.
    NOTA: Il processo di pressatura di 30 sporgenze semicircolari utilizzando un'asta di macinazione del vetro deve essere eseguito prestando attenzione alla pressione perché una pressa troppo dura perforerà la plastica e contaminerà l'asta di macinazione senza veleno estratta.
  2. Disinfettare il film plastico di polietilene pressato esponendo entrambi i lati alla luce ultravioletta (UV) per 1 ora.
  3. Aggiungere una piccola quantità di alcol polivinilico al 10% sulla superficie semicircolare.

3. Parassitismo di Trichogramma dendrolimi

  1. Dopo l'anestesia CO2 , posizionare le vespe femmine di T. dendrolimi in una scatola di raccolta e il numero di vespe era ~ 3000.
  2. Posizionare il lato convesso della carta uovo in pellicola verso la scatola di raccolta e fissare i bordi con un elastico.
  3. Aggiungere 4 μL di soluzione aminoacidica (6 g/L di leucina, 4 g/L di fenilalanina, 4,25 g/L di istidina) a ciascuna protrusione semicircolare. Copritela con una pellicola di plastica piatta in polietilene lunga 16 cm e larga 12 cm. Utilizzare un elastico per coprire ermeticamente il contenitore di raccolta con due fogli di plastica.
  4. Lasciare che le vespe T. dendrolimi parassitino liberamente per 4-8 ore e forniscano il 10% di acqua di saccarosio attraverso il cotone bagnato.

4. Raccolta del veleno di T. dendrolimi

  1. Ottenere la soluzione di amminoacidi parassitati dalla sporgenza interna della scheda uovo artificiale e trasferirla nel tappo delle provette da 1,5 mL.
  2. Coprire il tappo della provetta con una rete di nylon da 10 μm di diametro 25 mm, fissare saldamente la rete di nylon e la provetta da centrifuga. Posizionare la provetta da centrifuga in posizione verticale per una centrifugazione breve utilizzando una minicentrifuga (1360 x g) per 10 secondi e raccogliere la soluzione filtrata (~100 μL di veleno di T. dendrolimi ).
  3. Misurare la concentrazione del veleno di T. dendrolimi raccolto utilizzando un kit per il dosaggio dell'acido bicinchoninico (BCA) (Tabella dei materiali).
  4. Conservare il veleno a -80 °C per ulteriori analisi.

5. Analisi SDS-PAGE

  1. Aggiungere 30 μL di veleno di T. dendrolimi a 10 μL di tampone di caricamento del campione su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) (Tabella dei materiali) e riscaldare a 95 °C per 10 min.
  2. Eseguire il ciclo del gel SDS-PAGE a 130 V per 120 min.
  3. Colorare e decolorare il gel SDS-PAGE utilizzando l'apparato di colorazione delle proteine (Tabella dei materiali).

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Risultati

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La concentrazione proteica di campioni di veleno rappresentativi è stata misurata utilizzando il kit di analisi delle proteine, con i risultati presentati nella Tabella 1. I risultati hanno mostrato che la concentrazione di proteine del veleno raccolte con questo metodo variava da 0,35 μg/μL a 0,46 μg/μL, mentre il controllo negativo della soluzione di amminoacidi aveva solo una concentrazione proteica compresa tra 0,03 μg/μL e 0,05 μg/μL. La concentrazione di proteine del veleno raccolte con questo meto...

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Discussione

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Qui, presentiamo un metodo per estrarre il veleno da T. dendrolimi utilizzando ospiti artificiali. I punti chiave dell'esperimento di raccolta del veleno sono i seguenti. (1) Durante la preparazione, T. dendrolimi deve essere anestetizzato rapidamente con un'adeguata concentrazione di CO2 . Se la concentrazione di CO2 è troppo bassa, sarà insufficiente per anestetizzare rapidamente il Trichogramma . Al contrario, se la concentrazione è troppo alta, i Trichogramma ...

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Dichiarazioni

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L'autore non ha nulla da rivelare e non ha interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Riconosciamo il sostegno finanziario della Fondazione per le Scienze Naturali della Provincia di Hainan (Sovvenzione n. 323QN262), della Fondazione Nazionale per le Scienze Naturali della Cina (Sovvenzione n. 31701843 e 32172483), del Fondo per l'Innovazione Scientifica e Tecnologica dell'Agricoltura del Jiangsu (Sovvenzione n. CX(22)3012 e CX(21)3008), la Fondazione "Shuangchuang Doctor" della provincia di Jiangsu (sovvenzione n. 202030472) e il fondo di avvio dell'Università agraria di Nanchino (sovvenzione n. 804018).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10 μ m Rete di nylonMilliporeNY1002500Per filtrare le uova
10% Alcool polivinilicoAladinoP139533Per attirare  T. dendrolimi  per deporre le uova
10% Acqua di saccarosioSinopharm Reagente chimico 10021463Feed Trichogramma dendrolimi
4x LDS buffer di caricamentoAce HardwareB23010301SDS-PAGE
Scatola di raccoltaDeli8555Contenitore per T. dendrolimi parassitismo
Futuro PAGE  4– 12% (12 pozzetti)AceHardwareJ70236502XSDS-PAGE
GenScript eStain L1 apparato di colorazione delle proteineGenScriptL00753SDS-PAGE
Asta di macinazione in vetro   Applygentb6268Sporgenze semicircolari 
L- LeucinaSolarbioL0011Componenti dell'ospite artificiale
L-IstidinaAladinoA2219458Componenti dell'ospite artificiale
L-FenilalaninaSolarbioP0010Componenti dell'ospite artificiale
Mini-CentrifugheScilogexD1008Centrifuga
MOPS-SDS buffer di funzionamentoAce HardwareB23021SDS-PAGE
Kit per il dosaggio istantaneo delle proteine BCA Omni-EasyShanghai Yamay Biomedical Technology ZJ102Per l'esimazione della concentrazione proteica del veleno
Layout della piastra PCR di 96 foriThermo FisherAB1400LProtrusioni semicircolari 
Film plastico in polietileneSuzhou Aopang Trading  001c5427Carta dell'uovo artificiale
Marcatore proteico di colore prestained (10– 180 kDa)YiFeiXue BiotechYWB007SDS-PAGE
ElasticoGuangzhou qianrui biologia scienza e tecnologia009Stringere il film plastico e la scatola di raccolta
Tappetino per setti in gomma siliconica, 96 pozzetti, foro rotondoSangon BiotechF504416-0001Sporgenze semicircolari 

Riferimenti

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  1. Pennacchio, F., Strand, M. R. Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera. Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).
  2. Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps. Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).
  3. Asgari, S., Rivers, D. B. Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions. Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).
  4. Moreau, S. J. M., Guillot, S. Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).
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  15. Moreau, S. J. M., Asgari, S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function. Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).

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