Dimostrazione della coltura di fogli cellulari autoassemblati e generazione manuale di un organoide 3D simile a tendine/legamento mediante l'utilizzo di fibroblasti dermici umani

Tendini e legamenti (T/L) sono componenti vitali del sistema muscolo-scheletrico che forniscono supporto e stabilità essenziali al corpo. Nonostante il loro ruolo critico, questi tessuti connettivi sono soggetti a degenerazione e lesioni, causando dolore e compromissione della mobilità¹. Inoltre, il loro limitato apporto di sangue e la lenta capacità di guarigione possono portare a lesioni croniche, mentre fattori come l'invecchiamento, il movimento ripetitivo e la riabilitazione impropria aumentano ulteriormente il rischio di degenerazione e lesioni². I trattamenti convenzionali, come il riposo, la terapia fisica e gli interventi chirurgici, non sono in grado di ripristinare completamente la struttura e la funzione T/L. Negli ultimi anni, i ricercatori si sono sforzati di comprendere meglio la natura intricata del T/L al fine di cercare trattamenti efficaci per i disturbi T/L ^3,4,5. I T/L si distinguono per una struttura gerarchicamente organizzata, dominata dalla matrice extracellulare (ECM), composta principalmente da fibre di collagene di tipo I e proteoglicani, una caratteristica difficile da replicare in vitro⁶. I tradizionali modelli di coltura cellulare bidimensionale (2D) non riescono a catturare la caratteristica organizzazione tridimensionale (3D) dei tessuti T/L, limitando il loro potenziale traduzionale e ostacolando il progresso innovativo nel campo della rigenerazione T/L.

Recentemente, lo sviluppo di modelli 3D di organoidi ha offerto nuove possibilità per far progredire la ricerca di base e l'ingegneria tissutale senza scaffold di vari tipi di tessuto 7,8,9,10,11,12,13. Ad esempio, per studiare la giunzione miotendinea, Larkin et al. 2006 hanno sviluppato costrutti muscolari scheletrici 3D insieme a segmenti tendinei auto-organizzati derivati dal tendine della coda di ratto¹⁰. Inoltre, Schiele et al. 2013, utilizzando canali di crescita rivestiti di fibronectina microlavorati, ha diretto l'autoassemblaggio dei fibroblasti dermici umani per formare fibre cellulari senza l'assistenza di scaffold 3D, un approccio che può catturare i tratti chiave dello sviluppo del tendine embrionale¹¹. Nello studio di Florida et al. 2016, le cellule stromali del midollo osseo sono state prima espanse in linee ossee e legamentose, successivamente utilizzate per generare fogli cellulari monostrato autoassemblati, che sono stati poi implementati per creare un costrutto osseo-legamento-osso multifasico che imita il legamento crociato anteriore nativo, un modello che mira a migliorare la comprensione della rigenerazione dei legamenti¹². Per chiarire i processi di meccanotrasduzione tendinea, Mubyana et al. 2018 hanno utilizzato una metodologia senza scaffold mediante la quale sono state create singole fibre tendinee e sottoposte al protocollo di carico meccanico¹³. Gli organoidi sono strutture 3D auto-organizzate che imitano l'architettura nativa, il microambiente e la funzionalità dei tessuti. Le colture di organoidi 3D forniscono un modello fisiologicamente più rilevante per lo studio della biologia dei tessuti e degli organi, nonché della fisiopatologia. Tali modelli possono anche essere utilizzati per indurre la differenziazione tessuto-specifica di diversi tipi di cellule staminali/progenitrici^14,15. Pertanto, l'implementazione di modelli 3D di organoidi nel campo della biologia T/L e dell'ingegneria tissutale diventa un approccio molto interessante ^9,16. Fonti cellulari alternative possono essere implementate per l'assemblaggio degli organoidi e stimolate verso la differenziazione tenogenica. Un tipo di cellula rilevante utilizzato per la dimostrazione in questo studio sono i fibroblasti dermici ^7,17,18. Queste cellule sono facilmente accessibili attraverso una procedura di biopsia cutanea, che è meno invasiva rispetto alla puntura del midollo osseo o alla liposuzione e può essere moltiplicata abbastanza rapidamente in grandi numeri grazie alla loro buona capacità proliferativa. Al contrario, i tipi di cellule più specializzati, come i fibroblasti residenti in T/L, sono più difficili da isolare ed espandere. Pertanto, i fibroblasti dermici sono stati utilizzati anche come punto di partenza per le tecnologie di riprogrammazione cellulare verso cellule staminali embrionali pluripotenti indotte¹⁹. Sottoporre i fibroblasti dermici a specifiche condizioni di coltura 3D e segnali di segnalazione, come il fattore di crescita trasformante-beta 3 (TGFß3), che è stato riportato agire come regolatore chiave di vari processi cellulari, tra cui la formazione e il mantenimento di T/L, può potenziare la loro differenziazione tenogenica in vitro portando all'espressione di geni tendinei specifici e alla deposizione di ECM²⁰ T/L-tipica^{, 21}.

Qui, descriviamo e dimostriamo un protocollo di organoidi in 3 fasi (espansione 2D, stimolazione 2D e maturazione 3D) precedentemente stabilito e implementato utilizzando fibroblasti dermici umani adulti normali (NHDF) disponibili in commercio come fonte cellulare, offrendo un modello prezioso per lo studio della tenogenesi in vitro ⁷. Nonostante il fatto che questo modello non sia equivalente al tessuto T/L in vivo, fornisce comunque un sistema fisiologicamente più rilevante che può essere utilizzato per studiare i meccanismi di differenziazione cellulare, imitare la fisiopatologia T/L in vitro e stabilire piattaforme di medicina personalizzata T/L e screening farmacologico. Inoltre, in futuro, gli studi potranno valutare se gli organoidi 3D sono adatti per l'ingegneria T/L senza scaffold mediante un'ulteriore ottimizzazione e utilizzabili per lo sviluppo di costrutti meccanicamente robusti su larga scala che assomigliano molto alle dimensioni e alle proprietà strutturali e biofisiche dei tessuti T/L nativi.

NOTA: Tutte le fasi devono essere eseguite utilizzando tecniche asettiche.

1. Coltura e pre-espansione dei NHDF

1. Scongelare rapidamente la crio-fiala contenente fibroblasti dermici umani normali adulti crioconservati (NHDF, 1 x 10⁶ cellule) a 37 °C fino a quando non si scongelano quasi.
2. Aggiungere lentamente 1 mL di terreno di crescita dei fibroblasti preriscaldato 2 (kit pronto all'uso che include terreno basale, siero fetale di vitello al 2% (FCS), fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF) e insulina) integrato con penicillina/streptomicina all'1% (penna/streptococco) (terreno NHDF), preriscaldato a 37 °C alle cellule.
3. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
4. Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 12 mL di terreno NHDF preriscaldato.
5. Trasferire le cellule in un matraccio T-75 e agitare brevemente in senso trasversale. Collocare il matraccio T-75 a 37 °C in un'incubatrice umidificata al 5% di CO₂ .
6. Cambia il mezzo ogni 2 giorni. Osservare gli NHDF al microscopio fino a raggiungere la confluenza del 70% - 80%.

2. Espansione 2D

1. Estrarre il pallone T-75 dell'incubatrice e rimuovere il mezzo NHDF. Lavare le cellule con soluzione salina tampone fosfato preriscaldata (PBS).
2. Aggiungere 3 ml di tripsina-EDTA allo 0,05% alle cellule. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ fino a quando le cellule non si staccano dal matraccio (circa 3 minuti).
3. Aggiungere 6 ml di terreno NHDF preriscaldato per neutralizzare l'azione della tripsina. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml.
4. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti a RT e rimuovere il surnatante.
5. Risospendere il pellet cellulare in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) a basso contenuto di glucosio integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 1x aminoacidi MEM, 1% penna/streptococco, preriscaldato a 37 °C.
6. Piastra gli NHDF in una piastra di coltura cellulare aderente da 10 cm a una densità di 8 x 10³ NHDF/cm² (in totale, 4,4 x 10⁵ NHDF per piastra da 10 cm). Oscilla delicatamente in modo trasversale.
7. Posizionare la piastra di coltura cellulare da 10 cm a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ . Cambia il mezzo ogni 2 giorni
8. Monitorare le cellule al microscopio fino a raggiungere la confluenza del 100% (ca. 5 giorni).

3. Stimolazione 2D

1. Estrarre dall'incubatore le piastre per colture cellulari da 10 cm contenenti gli NHDF (dai passaggi 2.6 e 2.7). Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS preriscaldato.
2. Aggiungere 10 mL di terreno ad alto contenuto di glucosio DMEM integrato con il 10% di FBS, 50 μg/mL di acido ascorbico e l'1% di penna/streptococco, preriscaldato a 37 °C.
3. Porre la capsula di Petri a 37 °C in atmosfera umidificata al 5% di CO₂ . Cambia il mezzo ogni 2 giorni.
4. Monitorare gli NHDF al microscopio per 14 giorni.

4. 3D maturazione

1. Estrarre la piastra di coltura cellulare da 10 cm dall'incubatore e rimuovere il terreno ad alto contenuto di glucosio DMEM.
2. Staccare delicatamente e rapidamente il foglio cellulare formato dal piatto con un raschietto cellulare. Durante il distacco, arrotolare contemporaneamente il foglio cellulare in un organoide 3D simile a un bastoncino.
3. Prelevare e posizionare gli organoidi NHDF in una piastra di Petri non aderente (per cellule) di 10 cm. Questo tipo di piatto viene utilizzato per evitare l'emigrazione cellulare dall'organoide alla plastica.
4. A questo punto o un giorno dopo (giorno 0 o giorno 1 di maturazione 3D), raccogliere alcuni degli organoidi per ulteriori analisi come il peso umido, la valutazione istologica (gli organoidi del giorno 1 sono preferibili in quanto diventano più compatti), l'isolamento dell'RNA e delle proteine.
5. Fissare i bordi dell'organoide con perni metallici come segue:
   1. Tenere con cura un lato dell'organoide con una pinzetta e con un'altra pinzetta applicare delicatamente uno stiramento manuale di circa il 10% di allungamento assiale. Per stimare l'allungamento assiale del 10%, utilizzare carta millimetrata o righello.
   2. Quindi, prendi uno spillo di metallo con la pinzetta e premi manualmente attraverso il bordo dell'organoide nel piatto di plastica per fissarlo. Ripetere questa procedura con il secondo perno sul secondo bordo dell'organoide.
6. Aggiungere 10 ml di terreno ad alto contenuto di glucosio DMEM integrato con il 10% di FBS, 1x aminoacidi MEM, 50 μg/mL di acido ascorbico, 10 ng/mL di TGFß3 e l'1% di penna/streptococco, preriscaldato a 37 °C.
7. Posizionare la pirofila da 10 cm a 37 °C in atmosfera umidificata al 5% di CO₂ . Cambia il mezzo ogni 2 giorni.
8. Monitorare regolarmente gli organoidi per 14 giorni.
   NOTA: i perni potrebbero allentarsi, quindi rifissarli utilizzando la stessa tecnica descritta nel passaggio 4.5.
9. Dopo 14 giorni, rimuovere il mezzo ad alto contenuto di glucosio DMEM dagli organoidi. Lavare gli organoidi con PBS preriscaldato.
10. Misurare gli organoidi per il peso umido al giorno 0 e al giorno 14 utilizzando una bilancia di precisione.
    1. Posizionare un piatto vuoto di 10 cm sulla bilancia e tarare il peso a zero per assicurarsi che venga misurato solo il peso degli organoidi. Rimuovere completamente il terreno di coltura dal piatto da 10 cm e misurare il peso umido dell'organoide uno per uno.
       NOTA: In questo studio, al giorno 0, sono stati pesati tre organoidi per donatore e al giorno 14 due organoidi per donatore.
11. Secondo gli scopi dello studio, implementare alcuni degli organoidi NHDF in ulteriori analisi istologiche o congelarli immediatamente in azoto liquido utilizzando provette sterili prive di DNA/RNA per il successivo isolamento di DNA, RNA e proteine e quindi conservarle a -80 °C.
12. Per l'indagine istologica, fissare ciascun organoide in 5 mL di paraformaldeide al 4% preraffreddata (4 °C) in PBS (regolata a pH neutro) per 45 minuti su ghiaccio, seguita da un lavaggio PBS a RT (2 x 5 min ciascuno).
13. Crioproteggere gli organoidi fissati utilizzando un gradiente di saccarosio mettendo gli organoidi in barattoli di vetro per l'istologia. Incubare gli organoidi in saccarosio al 10% in soluzione di PBS per 2 ore a 4 °C, successivamente saccarosio al 20%/PBS per 2 ore a 4 °C e infine incubazione notturna al 30% di saccarosio/PBS a 4 °C. Modificare le soluzioni di saccarosio prima pipettando e poi riempiendo con la nuova soluzione.
14. Incorporare gli organoidi nel crio-mezzo.
    1. Metti una piastra di rame sul ghiaccio secco in una scatola di polistirolo e lascia raffreddare per 10 minuti.
    2. Quindi, posizionare un criostampo di plastica, preriempito con crio-mezzo, sulla piastra di rame e premere delicatamente l'organoide sul fondo del criomedio usando una pinzetta. Attendere che il criomezzo sia completamente congelato.
    3. Per gli organoidi lunghi, prima tagliare a metà con un bisturi e mettere le due metà parallele tra loro nel criostampo. Ripetere la procedura per ciascun organoide destinato ad essere sottoposto ad analisi istologica.
15. Conservare i campioni a -20 °C fino alla criosezione.
16. Utilizzando un criotomo, tagliare longitudinalmente gli organoidi in sezioni spesse 10 μm e sottoporli a colorazione istologica come ematossilina ed eosina (H&E) utilizzando il protocollo standard⁸.

Il modello di organoide 3D T/L è stato precedentemente stabilito e dimostrato qui implementando NHDF acquistato commercialmente (n=3, 3 organoidi per donatore, NHDF sono stati utilizzati nei passaggi 5-8). Il flusso di lavoro del modello è riepilogato nella Figura 1. La Figura 2 mostra immagini rappresentative a contrasto di fase della coltura NHDF durante la pre-espansione in fiasche T-75 (Figura 2A) e all'inizio e dopo 5 giorni di coltura nella fase di espansione 2D in piastre di coltura cellulare da 10 cm (Figura 2B). La Figura 2C (immagini rappresentative a contrasto di fase) mostra la confluenza di NHDF durante la stimolazione 2D dopo 14 giorni di coltura nelle piastre di coltura cellulare da 10 cm. Successivamente, i fogli cellulari sono stati staccati manualmente e contemporaneamente arrotolati in organoidi 3D a forma di bastoncino (al giorno 0, la lunghezza dell'organoide è di circa 6 cm, la larghezza di circa 0,4 cm), che sono stati coltivati sotto tensione statica del 10% per 14 giorni (Figura 3, giorno 0 e giorno 14, immagini macroscopiche rappresentative). Entro il giorno 14 del processo di maturazione 3D, gli organoidi hanno mostrato un aspetto bianco scintillante, si sono contratti e sono apparsi più densi degli organoidi iniziali. Il peso umido degli organoidi è stato misurato al momento della formazione (giorno 0) e di nuovo il giorno 14 della fase di maturazione 3D (Figura 4). È stata osservata una significativa riduzione del peso umido, indicando la contrazione e la riorganizzazione strutturale della ECM all'interno degli organoidi durante l'intervallo di tempo di questa fase del protocollo. Oltre alla variazione di peso, a causa della contrazione, si è ridotta anche la lunghezza dell'organoide (al giorno 14, la lunghezza dell'organoide è di circa 3,5 cm e la larghezza è di circa 0,3 cm). In questo processo, i perni metallici si sono allentati e hanno dovuto essere rifissati; quindi, durante i 14 giorni di maturazione 3D, si consiglia di monitorare frequentemente gli organoidi. Per valutare la morfologia degli organoidi, sono state ottenute sezioni longitudinali da organoidi NHDF raccolti il giorno 1 e il giorno 14 della fase di maturazione 3D e sottoposti a colorazione H&E (Figura 5). Il primo giorno, gli organoidi hanno mostrato strati disconnessi, composti principalmente da cellule circondate da basse quantità di ECM. Inoltre, le celle all'interno degli strati dell'organoide non erano allineate lungo l'asse longitudinale dell'organoide utilizzato come direzione per il carico di trazione statico applicato. I nuclei NHDF mostravano una forma rotonda con dimensioni e forme variabili. L'analisi H&E degli organoidi del giorno 14 ha rivelato un notevole aumento del segnale dell'eosina, indicando la deposizione di ECM durante il processo di maturazione 3D. A questo punto, gli organoidi mostravano strati fusi, con aree contenenti cellule allineate. Le cellule erano spesso in gruppi; tuttavia, in alcune località erano anche organizzati in file di celle. La maggior parte dei nuclei aveva dimensioni simili e occasionalmente erano allungati.

Figura 1: Cartone animato del modello 3D di organoide T/L composto da 3 fasi: espansione 2D, stimolazione 2D e maturazione 3D. Inizialmente, gli NHDF sono stati pre-espansi in un pallone T-75 fino a raggiungere il 70%-80% di confluenza. Successivamente, gli NHDF sono stati coltivati utilizzando il terreno a basso contenuto di glucosio Modified Eagles Medium (DMEM) di Dulbecco in un piatto di coltura cellulare di 10 cm per 5 giorni (espansione 2D). Le cellule sono state quindi stimolate con DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con acido ascorbico per 14 giorni di coltura (stimolazione 2D). Successivamente, gli NHDF sono stati staccati dalla piastra aderente di 10 cm, arrotolati in un organoide 3D a forma di bastoncino, trasferiti e fissati in una piastra di coltura cellulare non aderente di 10 cm riempita con terreno ad alto contenuto di glucosio DMEM integrato con acido ascorbico e fattore di crescita trasformante beta 3 (TGFß3) per 14 giorni (maturazione 3D). Gli organoidi 3D formati possono essere sottoposti a una valutazione del peso umido, a una valutazione istologica, all'isolamento di RNA e proteine e ad altre analisi (ad esempio, microscopia elettronica a trasmissione, misurazioni biomeccaniche) in diversi momenti come i giorni 0, 1 e 14. Il cartone animato è stato generato nel software BioRender. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini rappresentative a contrasto di fase di NHDF durante le fasi di pre-espansione, espansione 2D e stimolazione 2D. (A) NHDF durante la pre-espansione nel pallone T-75. (B) NHDF ai giorni 1 e 5 della fase di espansione 2D in una piastra di coltura cellulare di 10 cm. (C) NHDF ai giorni 1 e 14 della fase di stimolazione 2D in una piastra di coltura cellulare di 10 cm. Barre di scala: 200 μm. Le immagini sono state scattate con un microscopio invertito dotato di una fotocamera ad alta risoluzione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Morfologia macroscopica degli organoidi 3D NHDF. Immagini macroscopiche rappresentative di organoidi NHDF ai giorni 0 e 14 della fase di maturazione 3D. Barra della scala: 1 cm. Le immagini sono state scattate con la fotocamera di un telefono cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi del peso umido di organoidi 3D NHDF. La misurazione del peso umido degli organoidi era al giorno 0 e al giorno 14, la fine del processo di maturazione 3D. Il grafico mostra i valori medi e le deviazioni standard (NHDF n = 3, 3 organoidi/donatore al giorno 0 e 2 organoidi/donatore al giorno 14 a causa di 1 organoide/donatore prelevato per l'istologia al giorno 1), ogni punto rappresenta i singoli organoidi mentre ogni forma colorata rappresenta un diverso donatore individuale. I dati sono presentati come media ± deviazione standard ed è stato utilizzato un test t parametrico non accoppiato. Differenze statistiche: **p ≤0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Analisi istologica di organoidi 3D NHDF. Immagini rappresentative di sezioni colorate con ematossilina ed eosina (H&E) di organoidi NHDF durante il processo di maturazione 3D ai giorni 1 e 14. Immagine a destra - immagini a basso ingrandimento, immagine a sinistra - vista ingrandita con indicatori come segue: frecce gialle - livelli disconnessi; punte di freccia gialle - nuclei di varie dimensioni e forme; frecce nere - strati fusi e deposizione ECM; punte di freccia nere - file di cellule, nuclei con dimensioni e allungamento simili; stelle nere - cellule in gruppi. Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.