Method Article

Editing del genoma CRISPR-Cas9 di embrioni di ratto utilizzando il virus adeno-associato (AAV) e l'elettroporazione di embrioni a 2 cellule

DOI:

10.3791/66069

⸱

March 15th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Animal Modeling Core, University of Missouri, 2Comparative Medicine Program, University of Missouri, 3Rat Resource and Research Center, University of Missouri, 4Department of Veterinary Pathobiology, University of Missouri

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo presenta un approccio ottimizzato per la produzione di modelli di ratto geneticamente modificati. Il virus adeno-associato (AAV) viene utilizzato per fornire un modello di riparazione del DNA e l'elettroporazione viene utilizzata per fornire reagenti CRISPR-Cas9 per completare il processo di editing del genoma nell'embrione a 2 cellule.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tecnologia di editing del genoma è ampiamente utilizzata per produrre animali geneticamente modificati, compresi i ratti. L'iniezione citoplasmatica o pronucleare di modelli di riparazione del DNA e reagenti CRISPR-Cas è il metodo di somministrazione più comune negli embrioni. Tuttavia, questo tipo di micromanipolazione richiede l'accesso ad attrezzature specializzate, è laborioso e richiede un certo livello di abilità tecnica. Inoltre, le tecniche di microiniezione spesso comportano una minore sopravvivenza dell'embrione a causa dello stress meccanico sull'embrione. In questo protocollo, abbiamo sviluppato un metodo ottimizzato per fornire modelli di riparazione del DNA di grandi dimensioni da lavorare in combinazione con l'editing del genoma CRISPR-Cas9 senza la necessità di microiniezioni. Questo protocollo combina la somministrazione di DNA mediata da AAV di modelli di donatori di DNA a singolo filamento con la somministrazione della ribonucleoproteina CRISPR-Cas9 (RNP) mediante elettroporazione per modificare gli embrioni a 2 cellule. Utilizzando questa nuova strategia, abbiamo prodotto con successo modelli mirati di ratto knock-in con inserzione di sequenze di DNA di dimensioni comprese tra 1,2 e 3,0 kb con efficienze comprese tra il 42% e il 90%.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo sviluppo di strumenti di editing del genoma basati su CRISPR ha accelerato la nostra capacità di generare in modo efficiente nuovi e più sofisticati modelli di ratti geneticamente modificati. L'RNA a guida singola, insieme alla nucleasi Cas9, viene combinato per formare complessi di ribonucleoproteina (RNP) che prendono di mira le sequenze di DNA di interesse all'interno del genoma e provocano rotture del DNA a doppio filamento. Poiché i meccanismi di riparazione del DNA cellulare sono soggetti a errori, durante il processo di riparazione vengono introdotte inserzioni e delezioni (INDEL) che possono interrompere la funzione di un gene bersaglio. Quando c'è la co-consegna di una sequenza di DNA ingegnerizzato desiderata (modello di riparazione) insieme a reagenti di editing del genoma, l'inserimento del modello di riparazione nella regione contenente la rottura del DNA a doppio filamento avviene attraverso un processo chiamato riparazione diretta dall'omologia (HDR). Si tratta di una strategia efficace per la generazione di modelli animali con inserzioni/sostituzioni mirate di DNA (knock-in). Una limitazione è che le sequenze knock-in sono spesso di grandi dimensioni, il che ha dimostrato di ridurre l'efficienza dell'editing genetico, rendendo così più difficile la generazione del modello desiderato1. Le strategie per aumentare l'efficienza knock-in hanno incluso la linearizzazione dei modelli di riparazione del DNA a doppio filamento (dsDNA) e del DNA a singolo filamento (ssDNA) e la modifica chimica dei modelli di riparazione del DNA 2,3,4. Inoltre, sono state tentate la microiniezione pronucleare insieme a composti stimolanti l'HDR, l'applicazione di impulsi elettrici in combinazione con la microiniezione e la microiniezione temporizzata in embrioni a 2 cellule 5,6,7. Nonostante il successo di alcuni di questi approcci, l'incorporazione di sequenze di DNA più grandi di 1,0 kb rimane tecnicamente impegnativa.

L'elettroporazione, che è un metodo comune per introdurre reagenti in linee cellulari in coltura, offre un'alternativa alla microiniezione per la somministrazione di componenti CRISPR-Cas9 negli embrioni. L'elettroporazione embrionale, dimostrata per la prima volta negli embrioni di ratto8, è stata da allora utilizzata con successo come metodo di somministrazione nei topi 9,10,11,12,13, nei suini 14,15 e in altri organismi modello animali 16,17,18. Gli embrioni, sospesi nel terreno contenente i reagenti CRISPR-Cas9, vengono posti in una cuvetta o su un vetrino tra due elettrodi e sottoposti a impulsi diretti di correnti elettriche. Questo crea aperture transitorie nella zona pellucida e nella membrana plasmatica dell'embrione attraverso le quali i componenti CRISPR-Cas9 entrano negli embrioni. Tipicamente, gli impulsi elettrici di "poring" di medio livello vengono utilizzati per creare le aperture temporanee seguite da "impulsi di trasferimento" elettrici di livello inferiore che facilitano il movimento dei componenti di editing del genoma caricati negativamente. L'elettroporazione embrionale è efficiente, ha un'elevata produttività ed è facile da eseguire. Tuttavia, mentre l'elettroporazione embrionale ha dimostrato di avere un grande successo per l'introduzione di modelli di riparazione di ssDNA di piccole dimensioni (<200 bp), ci sono poche segnalazioni di successo dell'elettroporazione di modelli di riparazione più grandi (>1,0 kb)13,19. Questa restrizione dimensionale rappresenta una delle principali limitazioni dell'elettroporazione embrionale per la generazione di modelli animali knock-in che richiedono grandi inserimenti.

Nel contesto della terapia genica, i virus adeno-associati (AAV) sono stati a lungo utilizzati come veicoli per veicolare materiale genetico grazie alla loro efficiente infettività in vivo delle cellule in divisione e non in divisione, alla mancanza di patogenicità e alla rara integrazione genomica20,21. Recentemente, altri studi hanno combinato gli AAV con la tecnologia CRISPR-Cas9 per introdurre modelli di riparazione del DNA e reagenti CRISPR 22,23,24. Questo approccio consente la consegna di modelli di riparazione del DNA più grandi senza la necessità di tecniche di microiniezione.

La via HDR è più attiva nelle ultime fasi S e G2 del ciclo cellulare25,26. Negli studi condotti in vitro, sono stati ottenuti aumenti significativi dell'efficienza knock-in mediante la somministrazione di RNP CRISPR-Cas9 e modelli di riparazione del DNA in cellule sincronizzate con G2 o limitando la presenza della proteina Cas9 alle fasi S e G2 tardive utilizzando una proteina di fusione Cas9-Geminina2. Inoltre, c'è un evento di attivazione del genoma zigotico maggiore (ZGA) che si verifica durante la fase G2 estesa dell'embrione allo stadio di 2 cellule, e questo è associato a uno stato di cromatina aperta. Si ipotizza che questo fornisca agli RNP CRISPR-Cas9 e ai modelli di riparazione una maggiore accessibilità al DNA genomico.

Il nostro obiettivo era quello di basarci su tutte queste osservazioni, combinando l'approccio AAV con l'elettroporazione embrionale per introdurre gli RNP CRISPR-Cas9 nella fase a 2 cellule dello sviluppo embrionale. Questa strategia sfrutta la maggiore capacità di rilascio del modello di riparazione del DNA dell'AAV, la facilità tecnica dell'elettroporazione e il punto temporale più ottimale a 2 cellule per l'accessibilità genomica durante lo sviluppo embrionale per creare un metodo efficiente per l'ingegneria genetica mirata delle inserzioni di DNA. Come evidenziato in questo protocollo, il nostro metodo ottimizzato consente la produzione di modelli di ratto knock-in mirati che trasportano inserzioni di sequenze di DNA di dimensioni comprese tra 1,2 e 3,0 kb senza la necessità di tecniche di microiniezione.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Missouri (protocollo ACUC #25580) e sono state eseguite secondo le linee guida stabilite nella Guida per l'uso e la cura degli animali da laboratorio.

1. Somministrazione di modelli di riparazione del DNA mediati da AAV

  1. Progettare il costrutto del DNA in modo che contenga la sequenza di knock-in desiderata tra due bracci di omologia. Le lunghezze tipiche dei bracci di omologia sono di 300-500 bp. Assicurarsi che l'intero modello di riparazione del DNA (bracci di omologia + sequenza knock-in desiderata) sia affiancato da ripetizioni terminali invertite (ITR) mediante clonazione in una spina dorsale plasmidica appropriata e impacchettamento in ssAAV1 o ssAAV6 ricombinanti (sierotipi 1 o 6).
    NOTA: Se la sequenza bersaglio dell'sgRNA è presente nel modello di riparazione del DNA, è importante ingegnerizzare mutazioni silenti per interrompere questa sequenza, impedendo così l'editing mediato da CRISPR-Cas9 dell'allele correttamente mirato.
    ATTENZIONE: I vettori virali AAV ricombinanti non sono integranti e classificati come BSL-1. Le tecniche asettiche standard vengono utilizzate per il pipettaggio e la manipolazione degli embrioni che sono stati esposti al virus.
  2. Aggiungere ssAAV1 o ssAAV6 ingegnerizzato (confezionato con dima di riparazione del DNA) a 30 μL di terreno KSOM-R27,28 a una concentrazione finale di 3 × 10 7 copie del genoma (GC)/μL sotto olio minerale in una capsula di Petri da 35 mm.
  3. Posizionare gli zigoti con pronuclei visibili nel terreno KSOM-R contenente ssAAV ingegnerizzato.
    NOTA: Utilizzando questo protocollo non è necessario assottigliare la zona pellucida poiché i sierotipi AAV 1 e 6 sono in grado di passare prontamente attraverso per un'efficiente somministrazione del modello di riparazione del DNA.
  4. Incubare a 37 °C con il 5% di CO2 e umidità massima per 18-20 ore per consentire una sufficiente trasduzione virale.

2. Preparazione all'elettroporazione

  1. Il giorno seguente, preparare una miscela di elettroporazione contenente 100 ng/μL di sgRNA e 100 ng/μL di proteina Cas9 diluiti in terreni Opti-MEM in una provetta sterile priva di RNasi. Mescolare delicatamente.
  2. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire la formazione di RNP.
  3. Durante il tempo di incubazione, accendere l'elettroporatore e collegare i cavi a un elettrodo vetrino con interasse di 1,5 mm.
  4. Impostare i parametri di elettroporazione come descritto nella Tabella 1.

3. Elettroporazione embrionale a 2 cellule

  1. Pipettare delicatamente 5 μL della miscela di elettroporazione CRISPR tra i due elettrodi sul vetrino facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nella soluzione.
  2. Rimuovere l'embrione allo stadio di 2 cellule dalla soluzione di AAV. Allineare gli embrioni allo stadio di 2 cellule nella miscela senza permettere loro di toccare i lati degli elettrodi. Questo viene fatto per evitare la lisi.
  3. Premere il pulsante Ohm per misurare l'impedenza. Verificare che l'impedenza sia compresa tra 0.100 e 0.300 kΩ. Il volume di reazione altererà l'impedenza (aggiungere volume per diminuire l'impedenza e sottrarre volume per aumentare l'impedenza).
  4. Premere Avvio. Il processo richiede pochi secondi per essere completato.
  5. Prelevare gli embrioni subito dopo l'elettroporazione e lavarli 3 volte in gocce fresche da 30 μL di terreno KSOM-R.
  6. Riporre gli embrioni in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2 e la massima umidità per la coltura in vitro in gocce da 500 μL di terreno KSOM-R sotto olio minerale. In alternativa, trasferire chirurgicamente gli embrioni in un ratto femmina pseudogravida post coito (dpc) di 1,5 giorni per produrre prole viva.

diagramma di rilascio del DNA mediato da rAAV; Editing genetico CRISPR; elettroporazione embrionale; modello di roditore.
Figura 1: Schema della somministrazione di DNA mediato da AAV e della pipeline di elettroporazione dell'embrione a 2 cellule per l'editing del genoma CRISPR-Cas9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seguendo il protocollo, c'è un'efficace somministrazione mediata da AAV del modello di riparazione del DNA che consente un HDR altamente efficiente dopo che gli embrioni a 2 cellule sono stati elettroporati con RNP CRISPR-Cas9. Come mostrato nel video, un processo di elettroporazione riuscito provoca la formazione di bolle su ciascun elettrodo (Figura 2C) e l'impedenza rimane nell'intervallo compreso tra 0,100 e 0,300 kΩ. Dopo l'elettroporazione non è raro che gli embrioni si gonfino riempiendo lo spazio perivitellino all'interno della zona pellucida (Figura 3). Questo gonfiore dovrebbe attenuarsi dopo alcune ore in coltura. Inoltre, non è raro vedere una piccola percentuale (fino al 20%) di eventi di fusione cellulare dopo l'elettroporazione di embrioni a 2 cellule (Figura 3). La fusione cellulare può essere potenzialmente evitata con un attento allineamento dell'asse orizzontale piuttosto che con l'allineamento dell'asse verticale tra gli elettrodi (Figura 2B). Tuttavia, in genere scartiamo gli embrioni fusi dopo il processo di elettroporazione.

La nostra tecnica di elettroporazione RNP CRISPR-Cas9 dell'embrione a 2 cellule si è dimostrata molto efficace per la generazione di modelli di ratto knock-in con inserimenti mirati. Testando il nostro metodo in embrioni di ratto e facendo lo screening di blastocisti in coltura per l'inserimento di un introne artificiale corto ingegnerizzato contenente siti loxP, abbiamo notato che oltre il 60% delle blastocisti conteneva l'allele knock-in correttamente mirato sulla base dell'analisi Next Generation Sequence (NGS) (Figura 4). Inoltre, testando il nostro metodo per produrre ratti knock-in vivi, abbiamo progettato un progetto per ingegnerizzare una sequenza codificante per la ricombinasi Cre mirata al sito di inizio ATG del gene Drd2 del ratto. Il modello del donatore di DNA confezionato con AAV consisteva in sequenze ITR necessarie per il confezionamento di AAV, un braccio di omologia di 5' (422 bp di lunghezza), una sequenza Cre-pA (1.339 bp di lunghezza) e un braccio di omologia di 3' (477 bp di lunghezza) (Figura 5A). Degli 11 cuccioli nati, 10 sono risultati positivi all'analisi PCR per la sequenza Cre-pA correttamente inserita nel sito di inizio ATG del ratto Drd2 (Figura 5B-D). L'inserimento mirato è stato successivamente confermato dall'analisi della sequenza del DNA. In sintesi, su 7 diversi progetti, abbiamo raggiunto un tasso medio di successo knock-in del 76% negli animali fondatori, come determinato dall'analisi PCR attraverso le giunzioni del braccio di omologia e dalla verifica della sequenza del DNA (Tabella 2).

Tensione [V]Lunghezza dell'impulso [msec]Intervallo di impulsi [msec]# di LegumiTasso di decadimento [%]Polarità
Impulso poroso403.550410+
Impulso di trasferimento55050540+/-

Tabella 1: Parametri di elettroporazione. Assicurarsi che il limite di corrente sia attivo durante l'elettroporazione.

Configurazione del dispositivo microfluidico con diagramma di flusso del fluido che mostra la formazione di bolle e l'analisi della dinamica del flusso.
Figura 2: Processo di elettroporazione dell'embrione a 2 cellule. (A) Elettrodo a vetrino. (B) Embrioni sospesi nei reagenti di editing genomico CRISPR-Cas9 e caricati nell'elettrodo vetrino prima dell'elettroporazione. (C) Formazione di bolle d'aria su ciascun elettrodo durante l'elettroporazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fusione cellulare, gonfiore dell'embrione; Immagine al microscopio, biologia dello sviluppo, scala 100μm.
Figura 3: Aspetto dell'embrione dopo l'elettroporazione. La fusione cellulare si nota fino al 20% degli embrioni a 2 cellule dopo l'elettroporazione. Le cellule embrionali possono anche gonfiarsi all'interno della zona pellucida riempiendo lo spazio perivitellino. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Grafico a barre dell'efficienza knock-in che mostra la percentuale di modifica della blastocisti; AAV+EP che dimostra un'elevata efficienza.
Figura 4: Rilascio di DNA mediato da AAV ed efficienza di knock-in dell'elettroporazione embrionale a 2 cellule in blastocisti di ratto in coltura. Dati presentati come percentuale di blastocisti positive per il corretto rilevamento dell'allele knock-in mediante sequenziamento di nuova generazione (NGS). N=28 blastocisti (gruppo di controllo solo coltura), N=37 blastocisti (gruppo di controllo solo elettroporazione (EP)) e N=35 blastocisti (gruppo AAV+EP). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Diagramma di editing genetico con donatore ssAAV6, sistema Cre-lox; risultati dell'elettroforesi per l'analisi del DNA.
Figura 5: Creazione di un modello di ratto knock-in Drd2-Cre. (A) Targeting del gene Drd2 nel ratto. Il complesso RNP è stato progettato per colpire l'esone 2 che contiene il sito di inizio della regione codificante. Il modello del donatore AAV conteneva sequenze virali invertite terminali ripetute (ITR), 5' e 3' bracci di omologia genica (HA) Drd2 e il gene Cre con una sequenza polyA. L'integrazione riuscita del modello del donatore porta il gene Cre 3' al sito di partenza all'interno dell'esone 2. Questo mette il gene Cre sotto il controllo del promotore Drd2 e contemporaneamente elimina il gene Drd2. La posizione dei primer PCR utilizzati per la conferma dell'avvenuto knock-in è indicata da frecce viola. (B) Analisi PCR di animali potenzialmente modificati con il genoma (Lanes B10-C8) con primer che si estendono su tutto il braccio di omologia 5'. Corsia C9: wild type (controllo negativo); Corsia C10: nessuna dima (controllo negativo). La dimensione prevista dell'amplicone per gli animali knock-in positivi è di 601 bp. (C) Analisi PCR di animali potenzialmente modificati con genoma (Lanes D8-E6) con primer che si estendono su tutto il braccio di omologia 3'. Corsia E7: tipo selvatico; Corsia E8: nessun controllo del modello. La dimensione prevista dell'amplicone per gli animali knock-in positivi è di 676 bp. (D) Rilevamento del gene Cre. La dimensione prevista dell'amplicone è di 381 bp. Corsie C7-D5: potenziali fondatori; Corsia D6: tipo jolly; Corsia D7: nessun controllo del modello. Le reazioni di PCR sono state analizzate mediante elettroforesi capillare con marcatori di allineamento 15bp-3kb (indicati in verde). Il marcatore della dimensione del DNA QX è mostrato a sinistra di ogni immagine con la dimensione del picco corrispondente alla dimensione dell'amplicone della PCR in coppie di basi (bp). Questa cifra è stata modificata con l'autorizzazione del riferimento24. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Descrizione del progettoProle positiva al knock-in (%)
Oprm1-P2A-Flp (1.7 kb inserimento)5/5 (100%)
Drd2-Cre (1.3 kb inserimento)10/11 (91%)
Triml2-P2A-Cre (1.3 kb inserimento)9/16 (56%)
Cxcl15-iCre (1.3 kb inserimento)6/6 (100%)
Opn4-P2A-Cre (1.2 kb inserimento)6/8 (75%)
Vipr1-FLEX-EGFP (inserimento 1.4 kb)5/12 (42%)
Rosa26-FLEX-MTS-KillerRed (3.1 kb inserimento)5/7 (71%)

Tabella 2: Tassi di successo del modello knock-in

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sistema di editing genomico CRISPR-Cas ha rivoluzionato il campo dell'ingegneria genetica consentendo la produzione efficiente di modificazioni genetiche personalizzate sia semplici che complesse in una varietà di specie animali. I frequenti perfezionamenti e miglioramenti nelle tecniche associate all'editing del genoma ne aumentano ulteriormente la versatilità. Qui abbiamo descritto un nuovo approccio che utilizza la somministrazione di DNA mediata da ssAAV insieme all'elettroporazione embrionale a 2 cellule dei reagenti CRISPR-Cas9 in embrioni di roditori a 2 cellule. Abbiamo dimostrato che questo è un modo efficace per produrre modelli animali knock-in mirati.

Uno dei principali vantaggi dell'utilizzo dell'AAV è che consente la somministrazione di modelli di riparazione del DNA più grandi negli embrioni senza la necessità di tecniche di microiniezione. La somministrazione mediata da AAV aiuta anche ad aggirare in qualche modo le restrizioni sulle dimensioni del modello di DNA della sola elettroporazione. Tuttavia, ci sono alcune considerazioni importanti quando si utilizza AAV. La zona pellucida, la matrice glicoproteica indurita che circonda l'ovulo fecondato, funge da barriera fisica che spesso complica la somministrazione di acidi nucleici. L'assottigliamento della zona pellucida è una tecnica comune che viene utilizzata per un migliore accesso all'embrione. Tuttavia, alcuni studi hanno riportato che lo sviluppo embrionale è ostacolato dall'infezione con dosi più elevate (da 1 × 107 GC/μL a 1 ×10 9 GC/μL) AAV in embrioni in cui la zona pellucida è stata assottigliata prima dell'infezione da AAV22. Esistono, tuttavia, alcuni sierotipi di AAV che possono diffondersi in tutta la zona pellucida29. Il nostro protocollo non prevede l'assottigliamento della zona pellucida e utilizza AAV con sierotipi 1 e 6 a una concentrazione di 3 × 107 GC/μl per ottenere tassi di knock-in superiori rispetto ai rapporti pubblicati in precedenza. Non abbiamo notato una diminuzione dello sviluppo embrionale in queste condizioni.

L'elevata efficienza knock-in raggiunta dall'elettroporazione di embrioni a 2 cellule è molto probabilmente dovuta alla fase G2 estesa negli embrioni in questa fase di sviluppo, rendendo questa una fase di sviluppo ottimale in cui eseguire l'elettroporazione. Tuttavia, una potenziale complicanza è la fusione cellulare osservata in alcuni embrioni a 2 cellule durante il processo di elettroporazione. Questa osservazione non è sorprendente dato che le procedure di elettrofusione sono comunemente usate per fondere cellule di mammifero e la fusione può potenzialmente essere evitata con un attento allineamento dell'asse orizzontale piuttosto che verticale tra gli elettrodi30,31. Inoltre, quando l'editing del genoma si verifica in una fase successiva dello sviluppo, come ad esempio a 2 cellule piuttosto che a 1 cellula, c'è un maggiore potenziale per un aumento del mosaicismo. Utilizzando il nostro approccio di elettroporazione a 2 cellule, abbiamo osservato un leggero aumento del mosaicismo rispetto all'iniezione pronucleare (86% per l'approccio AAV e 67% per l'approccio PNI) in uno stadio a 1 cellula, ma siamo stati comunque in grado di ottenere la trasmissione germinale dell'allele modificato in tutti gli animali fondatori testati. Un'altra potenziale preoccupazione è la possibilità di integrazione di modelli di DNA derivati da AAV in tandem concatemeri. Sebbene non sia stato eseguito il sequenziamento a lunga lettura per i modelli descritti in questo protocollo, abbiamo confermato l'integrazione singola dei modelli di DNA per tutti i modelli utilizzando la variazione del numero di copie della PCR digitale a goccioline (ddPCR).

Infine, mentre il nostro metodo prevedeva la somministrazione di AAV di sequenze di DNA di interesse, dovrebbe essere possibile utilizzare altri approcci di somministrazione di DNA mediati da virus e non virali in combinazione con l'elettroporazione embrionale per manipolare geneticamente con successo gli embrioni. In conclusione, la combinazione della somministrazione di DNA mediata da ssAAV e dell'elettroporazione di RNP CRISPR-Cas9 in embrioni in stadio di 2 cellule è un metodo efficiente e facilmente adattabile per generare in modo efficiente modelli di ratto knock-in.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori desiderano ringraziare Nolan Davis per l'assistenza nella videografia e nel montaggio video.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Elettrocateteri con morsetti a coccodrillo per elettrodiNepaGeneC117
Olio mineraleMilliporeSigmaM5310
NepaGene21 Super Electroporator NepaGeneNEPA21
Elettrodi a piastra in platino su vetrinoNepaGeneCUY501P1-1.5
PURedit Cas9 ProteinMilliporeSigmaPECAS9
sgRNA (chimicamente modificato)SynthegoN/A
ssAAV1 o ssAAV6 modello di riparazione del DNA confezionatoVectorbuilderN/A

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20(2020).
  2. Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).
  3. Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35(2017).
  4. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).
  5. Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR. Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67(2020).
  6. Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos. Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).
  7. Kurihara, T., et al. DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons. Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).
  8. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci Rep. 4, 6382(2014).
  9. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  10. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).
  11. Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
  12. Troder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), e0196891(2018).
  13. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Sci Rep. 8 (1), 474(2018).
  14. Tanihara, F., et al. Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes. BMC Biotechnol. 20 (1), 40(2020).
  15. Tanihara, F., et al. Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes. Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).
  16. Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Front Genet. 11, 570069(2020).
  17. Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes. Front Genet. 12, 648482(2021).
  18. Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos. Data Brief. 21, 316-320 (2018).
  19. Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318(2018).
  20. Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing. Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).
  21. Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications. Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).
  22. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  23. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  24. Davis, D. J., et al. Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation. Front Genome Ed. 5, 1256451(2023).
  25. Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle. Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).
  26. Takata, M., et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).
  27. Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
  28. Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro. Theriogenology. 198, 69-74 (2023).
  29. Romeo, C., et al. AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs. Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).
  30. Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells. Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).
  31. Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382(2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Cas9 Genome EditingRat EmbryosAAV DNA Delivery2 Cell Embryo ElectroporationKnock In Rat ModelsHomology Directed RepairRibonucleoprotein ElectroporationDNA Repair TemplateTargeted DNA InsertionEmbryo Electroporation

Related Articles