Articolo metodologico

Dispositivo di assemblaggio acustico tridimensionale per la produzione di massa di sferoidi cellulari

DOI:

10.3791/66078

⸱

13 ottobre 2023

 ,  ,  , 
1School of Automation, Hangzhou Dianzi University, 2Key Laboratory of Medical Information and 3D Bioprinting of Zhejiang Province, Hangzhou Dianzi University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli sferoidi cellulari sono stati considerati un potenziale modello nel campo delle applicazioni biologiche. Questo articolo descrive i protocolli per la generazione scalabile di sferoidi cellulari utilizzando un dispositivo di assemblaggio acustico 3D, che fornisce un metodo efficiente per la fabbricazione robusta e rapida di sferoidi cellulari uniformi.

Abstract

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Gli sferoidi cellulari sono promettenti modelli tridimensionali (3D) che hanno ottenuto ampie applicazioni in molti campi biologici. Questo protocollo presenta un metodo per la produzione di sferoidi cellulari di alta qualità e ad alto rendimento utilizzando un dispositivo di assemblaggio acustico 3D attraverso procedure manovrabili. Il dispositivo di assemblaggio acustico è costituito da tre trasduttori di titanato di zirconato di piombo (PZT), ciascuno disposto nel piano X/Y/Z di una camera quadrata in polimetilmetacrilato (PMMA). Questa configurazione consente la generazione di un modello 3D dot-array di nodi acustici levitati (LAN) quando vengono applicati tre segnali. Di conseguenza, le cellule nella soluzione di gelatina metacriloile (GelMA) possono essere guidate verso le LAN, formando aggregati cellulari uniformi in tre dimensioni. La soluzione GelMA viene quindi fotopolimerizzata ai raggi UV e reticolata per fungere da impalcatura che supporta la crescita degli aggregati cellulari. Infine, masse di sferoidi maturi vengono ottenute e recuperate dissolvendo successivamente gli scaffold GelMA in condizioni miti. Il nuovo dispositivo di assemblaggio di celle acustiche 3D proposto consentirà la fabbricazione su larga scala di sferoidi cellulari e persino di organoidi, offrendo un grande potenziale tecnologico nel campo biologico.

Introduzione

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I modelli di coltura 3D in vitro, che forniscono caratteristiche strutturali e morfologiche più simili a quelle in vivo rispetto ai modelli di coltura 2D convenzionali, sono stati riconosciuti come sistemi promettenti in varie applicazioni biomediche come l'ingegneria tissutale, la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci 1,2,3. Come un tipo di modello di coltura 3D, gli sferoidi cellulari si riferiscono tipicamente all'aggregazione cellulare, creando strutture sferoidali 3D caratterizzate da interazioni cellula-cellula e cellula-matricemigliorate 4,5,6. Pertanto, la fabbricazione di sferoidi cellulari è diventata un potente strumento per consentire diversi studi biologici.

Per ottenere sferoidi sono state sviluppate varie tecniche, tra cui la goccia sospesa7, le piastre non adesive8 o i dispositivi a micropozzetto9. In linea di principio, questi metodi facilitano comunemente l'assemblaggio delle cellule utilizzando forze fisiche come la forza gravitazionale, riducendo al minimo le interazioni tra le cellule e il substrato. Tuttavia, spesso comportano processi ad alta intensità di manodopera, hanno una bassa produttività e pongono sfide per il controllo delle dimensioni degli sferoidi10,11. È importante sottolineare che la produzione di sferoidi con le dimensioni e l'uniformità desiderate in quantità sufficiente è della massima importanza per soddisfare specifiche applicazioni biologiche. A differenza dei metodi sopra menzionati, le onde acustiche, come un tipo di tecnica guidata dalla forza esterna 12,13,14, hanno mostrato il potenziale per la produzione di massa di sferoidi cellulari di alta qualità e produttività, sulla base del principio di migliorare l'aggregazione cellulare attraverso forze esterne 15,16,17,18. A differenza delle forze elettromagnetiche o magnetiche, le tecniche di manipolazione cellulare basate sull'acustica non sono invasive e prive di marcatura, consentendo la formazione di sferoidi con un'eccellente biocompatibilità19,20.

Comunemente, sono stati sviluppati dispositivi basati su onde acustiche di superficie stazionarie (SAW) e onde acustiche di massa (BAW) per generare sferoidi, utilizzando i nodi acustici (AN) prodotti dai corrispondenti campi acustici stazionari 21,22,23. In particolare, i dispositivi di assemblaggio acustico basati su BAW, con i meriti di una produzione conveniente, di un funzionamento facile e di un'eccellente scalabilità, hanno attirato l'attenzione per la fabbricazione di sferoidi cellulari24,25. Recentemente abbiamo sviluppato un semplice dispositivo di assemblaggio acustico basato su BAW con la capacità di generare sferoidi con un'elevata produttività26. Il dispositivo proposto è costituito da una camera quadrata in polimetilmetacrilato (PMMA) con tre trasduttori in piombo zirconato titanato (PZT) disposti rispettivamente nel piano X/Y/Z. Questa disposizione consente la creazione di un modello 3D dot-array di nodi acustici levitati (LAN) per l'assemblaggio delle celle di guida. Rispetto ai dispositivi basati su BAW o SAWs precedentemente riportati, che possono creare solo un array 1D o 2D di AN 27,28,29, il presente dispositivo consente un array di punti 3D di LAN per una rapida formazione di aggregati cellulari all'interno della soluzione di metacriloile di gelatina (GelMA). Successivamente, gli aggregati cellulari sono maturati in sferoidi ad alta vitalità all'interno degli scaffold GelMA fotopolimerizzati dopo tre giorni di coltivazione. Infine, un gran numero di sferoidi di dimensioni uniformi è stato facilmente ottenuto dagli scaffold GelMA per applicazioni a valle.

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Protocollo

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1. Fabbricazione del dispositivo di assemblaggio acustico 3D

  1. Si inizia preparando quattro fogli di PMMA di 1 mm di spessore attraverso il taglio laser30, quindi si procede ad incollarli tra loro fino a formare una camera quadrata con una larghezza interna di 21 mm e un'altezza di 10 mm.
  2. Successivamente, fissare un altro foglio di PMMA di 1 mm di spessore sul fondo della camera per fungere da supporto per il bioink.
  3. Fissare con cautela tre trasduttori in titanato di zirconato di piombo (PZT) (ciascuno delle dimensioni di 20 mm di lunghezza, 10 mm di larghezza, 0,7 mm di spessore e con una frequenza di risonanza primaria di 3 MHz, vedere la tabella dei materiali) all'esterno delle tre pareti ortogonali della camera, rispettivamente. Assicurarsi che il trasduttore PZT inferiore sia centrato sotto la camera.
  4. Saldare i fili alle due aree conduttive di ciascun trasduttore PZT.
  5. Infine, fissare il dispositivo su una base cava per evitare che il PZT inferiore entri in contatto con altri piani di lavoro.

2. Installazione del sistema di montaggio acustico

  1. Iniziare montando il dispositivo acustico su un tavolino per microscopio, consentendo l'osservazione dall'alto dell'interno della camera.
  2. Posizionare un microscopio digitale sul lato del dispositivo privo di trasduttori PZT, consentendo l'osservazione laterale dell'interno della camera.
  3. Collegare in modo indipendente i fili dei tre trasduttori PZT in serie a tre amplificatori di potenza e tre canali di uscita dei generatori di funzioni (vedere la tabella dei materiali).
  4. Programmare le impostazioni sui generatori di funzioni per ciascun trasduttore PZT, specificando parametri come la forma d'onda sinusoidale, la frequenza e l'ampiezza.
  5. Per garantire la sterilizzazione, riempire la camera del dispositivo acustico con alcol al 75% per 5 minuti, seguita da un'accurata pulizia con soluzione sterile PBS. Successivamente, irradiare la camera con luce UV in un banco pulito per almeno 1 ora.

3. Procedura di coltura cellulare e raccolta

  1. Iniziare coltivando cellule C3A, una linea cellulare di carcinoma epatocellulare umano, in un matraccio di coltura cellulare T25 utilizzando il terreno Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina (vedi Tabella dei materiali).
  2. Quando le cellule C3A raggiungono circa l'80% di confluenza, eseguire il passaggio cellulare come segue: in primo luogo, lavare due volte il fondo del pallone di coltura con PBS. Quindi, aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% al matraccio di coltura cellulare e incubare a 37 °C per facilitare il distacco cellulare. Interrompere il processo di tripsinizzazione aggiungendo 2 mL di terreno di coltura completo.
  3. Trasferire la soluzione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugarla a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per ottenere un pellet cellulare.

4. Preparazione del bioink

  1. Preparare una soluzione di GelMA al 6% (p/v) contenente lo 0,5% (p/v) di litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP) sciogliendo 0,3 g di GelMA e 0,025 g di LAP (vedere Tabella dei materiali) in 5 mL di soluzione tampone fosfato (PBS). Lasciare riposare la miscela a bagnomaria a 47 °C per 1 ora.
  2. Prima di miscelare con le cellule, far passare la soluzione di GelMA attraverso un filtro da 0,22 μm (vedere la tabella dei materiali) per la sterilizzazione.
  3. Risospendere il pellet cellulare di cui sopra (passaggio 3.3) nel terreno di coltura cellulare. Colorare un piccolo volume di cellule con una soluzione di blu tripano allo 0,4% e quindi utilizzare un emocitometro pulito per il conteggio delle cellule.
  4. Miscelare una quantità appropriata di cellule C3A, calcolata in base alla densità cellulare ottenuta sopra, con la soluzione sterilizzata di GelMA per preparare il bioink con una densità cellulare di 2 × 106 cellule/mL.
  5. Per la visualizzazione degli sferoidi cellulari assemblati, precolorare le cellule C3A incubandole con un tracker cellulare da 2 μM (colorante DiO, vedere la tabella dei materiali) a 37 °C per 20 min. Successivamente, lavare le cellule marcate con terreno di coltura cellulare fresco tre volte prima dell'uso.

5. Assemblaggio degli sferoidi cellulari utilizzando il dispositivo acustico

  1. Pipettare più di 1 mL di bioink nella camera sterilizzata. Assicurarsi che la distanza faccia a faccia tra la superficie del liquido e il fondo della camera sia un multiplo intero della metà della lunghezza d'onda acustica.
    NOTA: È possibile controllare questa distanza regolando il volume del bioink aggiunto. La lunghezza d'onda acustica (λ) può essere stimata utilizzando la formula λ = c/f, dove c rappresenta la velocità del suono nel mezzo e f è la frequenza del trasduttore PZT.
  2. Accendere il generatore di funzioni e l'amplificatore di potenza per avviare l'azionamento di ciascun trasduttore PZT.
    NOTA: Si consiglia di azionare prima singolarmente ciascun trasduttore PZT per ottenere il modello cellulare ottimale in linea parallela. Ciò può essere ottenuto conducendo uno sweep di frequenza con una dimensione del passo di 0,001 MHz vicino alla frequenza di risonanza primaria per ciascun trasduttore PZT. Successivamente, applicare simultaneamente questi segnali ottimali a tutti e tre i trasduttori PZT per ottenere il modello cellulare 3D-dot previsto. Prima di applicare ogni segnale di ingresso, assicurarsi che le cellule siano uniformemente disperse nel bioink agitando delicatamente.
  3. Reticolazione del bioink utilizzando la luce blu (405 nm, 60 mW/cm2, 30 s) per creare un'impalcatura di idrogel 3D che incapsula gli aggregati cellulari assemblati acusticamente. Successivamente, spegnere il generatore di funzioni e l'amplificatore di potenza.
  4. Trasferire con cautela l'impalcatura di idrogel 3D dalla camera in una capsula di Petri e tagliarla in piccoli pezzi (ad es. 2 mm × 2 mm × 2 mm) utilizzando un rasoio pulito.
  5. Aggiungere il terreno di coltura cellulare per la coltivazione.
    NOTA: Ricordarsi di cambiare il terreno di coltura ogni giorno.

6. Recupero di sferoidi cellulari

  1. Inizia osservando la formazione di sferoidi in diversi strati delle impalcature utilizzando un microscopio invertito.
  2. Dopo 3 giorni di coltura, rimuovere il terreno di coltura e lavare accuratamente gli scaffold in idrogel due volte con PBS.
  3. Incubare gli scaffold con più di 2 mL di tampone di lisi GelMA a una diluizione 1: 200 con terreno di coltura cellulare per 30 minuti in un incubatore cellulare. Questa fase ha lo scopo di dissolvere gli scaffold in idrogel.
  4. Trasferire la soluzione del passaggio precedente in una provetta e poi centrifugarla a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per ottenere il pellet sferoidale cellulare.
  5. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in terreno di coltura fresco per le applicazioni a valle.

7. Analisi di vitalità degli sferoidi

  1. Valutare la vitalità degli sferoidi cellulari all'interno degli scaffold di idrogel o negli sferoidi recuperati utilizzando un kit di colorazione vivo/morto (vedere la tabella dei materiali).
  2. Incubare i campioni in diversi punti temporali della coltura con 1 mL di soluzione PBS contenente 1 μL di Calceina-AM e 2 μL di ioduro di propidio (PI) per 15 minuti a 37 °C.
  3. Per i campioni all'interno degli scaffold in idrogel, lavarli direttamente con PBS due volte. Per gli sferoidi recuperati, centrifugare a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per ottenere una pallina di sferoidi e lavarla due volte prima dell'osservazione.
  4. Osservare i campioni utilizzando un microscopio a fluorescenza e acquisire le immagini a fluorescenza.
  5. Calcolare il rapporto tra l'area colorata con Calcein-AM e l'area totale colorata sia con Calcein-AM che con PI utilizzando ImageJ per determinare la vitalità degli sferoidi.

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Risultati

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Questo studio ha progettato un dispositivo di assemblaggio acustico 3D per la produzione di massa di sferoidi cellulari. Il dispositivo acustico comprendeva una camera quadrata con due trasduttori PZT attaccati al piano X e al piano Y sulla superficie esterna della camera e un trasduttore PZT sul fondo della camera (Figura 1A,B). Tre canali di uscita di due generatori di funzioni sono stati collegati a tre amplificatori di potenza per generare tre segnali sinusoidali indipen...

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Discussione

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La fabbricazione efficiente e stabile di sferoidi cellulari ad alta produttività utilizzando tecnologie come il dispositivo di assemblaggio acustico 3D è molto promettente per il progresso dell'ingegneria biomedica e dello screening dei farmaci 1,2,3. Questo approccio semplifica la produzione di massa di sferoidi cellulari attraverso procedure semplici.

Tuttavia, ci sono fattori critici da considerare...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Il suo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (2022YFA1104600) e dalla Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LQ23H160011).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0.22-μ filtrom MerckSLGSM33SSUtilizzato per la sterilizzazione in soluzione GelMA
Piatto di coltura cellulare da 35 mmCorning430165Utilizzato per la coltura di cellule
Microscopio confocaleNikonA1RHD25Osservazione cellulare fluorescente
Colorante DiOBeyotimeC1038Colorante utilizzato per colorare le cellule
DMEMGibco12430054Terreni di coltura cellulare
FBSGibco10099141CIntegratore di terreni per colture cellulari
Generatore di funzioniRigolDG5352Per la generazione di segnali RF
GelMARegenovononeUtilizzato per preparare il
tampone di lisi bioink GelMAEFLEFL-GM-LS-001Utilizzato per sciogliere gli scaffold GelMA
Microscopio invertitoNikonTi-UOsservazione cellulare
LAPSigma-Aldrich900889Utilizzato come fotoiniziatore
Kit Live-DeadBeyotimeC2015MAnalisi della vitalità cellulare
PBSGibco10010002Utilizzato come tampone
Penicillina-streptomicinaGibco15070063Prevenire la contaminazione della coltura cellulare
Amplificatore di potenzaMinicircuitoLCY-22+Aumentare il ampiezza di tensione dei
trasduttori PZTYantai Xingzhiwen Trading Co., Ltd.PZT-41Unità funzionali per dispositivo di assemblaggio acustico
Pallone per coltura cellulare T25Corning430639Utilizzato per la coltura di cellule
Trypan blue Gibco15250061Conteggio cellulare
Tripsina-EDTA Gibco25200056Enzima di dissociazione cellulare
del segnale RF

Riferimenti

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