Le interazioni proteina-proteina sono importanti per chiarire la funzione delle proteine bersaglio e la co-immunoprecipitazione (co-IP) può facilmente confermare i PPI. Abbiamo trasfettato transitoriamente un plasmide codificante una proteina marcata con epitopo in cellule HEK-293 e sviluppato un metodo di immunoprecipitazione per confermare facilmente il legame di due proteine bersaglio.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Immunoprecipitazione con un gel di affinità antiepitopo per studiare le interazioni proteina-proteina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le interazioni proteina-proteina (PPI) svolgono un ruolo fondamentale nei fenomeni biologici, come l'organizzazione cellulare, la trasduzione del segnale intracellulare e la regolazione trascrizionale. Pertanto, la comprensione dei PPI è un importante punto di partenza per ulteriori indagini sulla funzione della proteina bersaglio. In questo studio, proponiamo un metodo semplice per determinare il legame di due proteine bersaglio introducendo vettori di espressione di mammiferi nelle cellule HEK-293 utilizzando il metodo della polietilenimmina, lisando le cellule in un tampone di lisi proteica fatto in casa e abbassando le proteine bersaglio su un gel di affinità per tag epitopo. Inoltre, il PPI tra le varie proteine fuse con tag epitopo può essere confermato utilizzando anticorpi di affinità contro ciascun tag invece del gel di affinità tag epitopo. Questo protocollo potrebbe anche essere utilizzato per verificare vari PPI, compresi gli estratti nucleari, da altre linee cellulari. Pertanto, può essere utilizzato come metodo di base in una varietà di esperimenti PPI. Le proteine si degradano con un decorso temporale prolungato e ripetuti cicli di gelo-disgelo. Pertanto, la lisi cellulare, l'immunoprecipitazione e l'immunoblotting devono essere eseguite nel modo più fluido possibile.
Introduzione
Le proteine svolgono un ruolo importante in tutte le funzioni cellulari, tra cui l'elaborazione delle informazioni, il metabolismo, il trasporto, il processo decisionale e l'organizzazione strutturale. Le proteine mediano le loro funzioni interagendo fisicamente con altre molecole. Le interazioni proteina-proteina (PPI) sono importanti per mediare le funzioni cellulari, come la mediazione della trasduzione del segnale, il rilevamento dell'ambiente, la conversione dell'energia in movimento fisico, la regolazione dell'attività degli enzimi metabolici e di segnalazione e il mantenimento dell'organizzazione cellulare1. Pertanto, i PPI possono esser....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
La Figura 1 presenta una panoramica del protocollo.
1. Preparazione di soluzioni e tamponi
- Tampone di lisi proteica: preparare il tampone di lisi proteica seguendo un rapporto precedentemente pubblicato7 (Tabella 1).
- Tampone di lisi proteica + inibitore della proteasi (PI): aggiungere l'inibitore della proteasi (vedere la tabella dei materiali) al tampone sopra preparato (passaggio 1.1). Conservare a -20 °C.
- Tampone campione: Miscelare 900 μL di 4x tampone campione Laemmli (vedere Tabella dei materia....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Gli adipociti termogenici, noti anche come adipociti marroni e beige, hanno potenziali effetti anti-obesità e anti-intolleranza al glucosio. PR (PRD1-BF1-RIZ1 omologo) contenente il dominio 16 (PRDM16) è un cofattore di trascrizione che svolge un ruolo importante nel determinare l'identità degli adipociti termogenici 9,10.
L'EHMT1 (istone-lisina N-metiltransferasi 1 eucromatica), nota anche come GLP, catalizza principalmente la mono- e.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo protocollo è quasi come i protocolli 5,7,14,15 precedentemente riportati. Il punto importante di questo protocollo è che non interrompiamo mai l'esperimento dalla fase di lisi cellulare alla fase di immunoprecipitazione. La degradazione delle proteine ostacola il rilevamento dei PPI. Il decorso prolungato e i ripetuti cicli di gelo-disgelo degradano le proteine. L'elettroforesi in SDS-PA.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Dichiariamo che nessuno degli autori ha conflitti di interesse relativi a questo studio.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Number 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K08672 (H.O.), Japan Diabetes Society Research Grant for Young Investigators (G.N.) e MSD Life Science Foundation Research Grant for Young Investigators (G.N.).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA (pH8.0) | Nippon gene | 311-90075 | |
| 10% Mini-PROTEAN TGX Gel proteici prefabbricati, 10 pozzetti, 50 e micro; L | Biorad | 4561034 | |
| 10x Tris/Glicina/SDS | Biorad | 1610772 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Anti-Topo IgG, Pecora Addominale intera collegata a HRP | GE Healthcare | NA931-1ML | |
| IgG anti-coniglio, Asino addominale intero collegato a HRP | GE Healthcare | NA934-1ML | |
| Raschietto cellulare M | Sumitomo Bachelite | MS-93170 | |
| Collagene I Coat Dish 100 mm | IWAKI | 4020-010 | |
| cOmplete, senza EDTA Inibitore della proteasi Cocktail | Roche | 4693132001 | |
| DMEM/F-12, integratore GlutaMAX | Invitrogen | 10565042 | |
| D-PBS (-) | FUJIFILM Wako | 045-29795 | |
| Glicerolo | FUJIFILM Wako | 072-00626 | |
| Glicina | FUJIFILM Wako | 077-00735 | |
| HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724 | Segnalazione cellulare | C29F4 | |
| Laemmli Tampone per campioni | Bio-Rad Laboratories | 161-0747 | |
| Colonne per cromatografia Micro Bio-Spin Biorad | 7326204 | ||
| Mini-PROTEAN Tetra Cell per mini gel prefabbricati | Biorad | 1658004JA | |
| Anticorpo monoclonale ANTI-FLAG M2 prodotto nel topo | Sigma | F3165 | |
| NaCl | FUJIFILM Wako | 191-01665 | |
| pcDNA3.1-FLAG-PRDM16 | Questo documento | N/A | |
| pcDNA3.1-HA-EHMT1 | Questo documento | N/A | |
| pcDNA3.1-vector | Questo documento | N/A | |
| PEI MAX - Grado di trasfezione lineare Polietilenimina cloridrato | PSI | 24765 | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | FUJIFILM Wako | 168-23191 | |
| Kit di analisi delle proteine BCA Pierce | Thermo scientific | 23227 | |
| Poliossietilene(10) Etere ottilfenilico | FUJIFILM Wako | 168-11805 | |
| Poliossietilene(20) Monolaurato di sorbitano | FUJIFILM Wako | 167-11515 | |
| Protein G Sepharose 4 confezioni da laboratorio a flusso rapido | Cytiva | 17061801 | |
| Protein LoBind Tubes | eppendorf | 30108442 | |
| ROTATOR RT-5 | TAITEC | RT-5 | |
| latte scremato | Morinaga | 0652842 | |
| Soluzione di strippaggio | FUJIFILM Wako | 193-16375 | |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack | Biorad | 1704156B03 | |
| Trans-Blot Turbo System | Biorad | N/A | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Siero fetale bovino testato USDA (FBS) | HyClone | SH30910.03 | |
| Veriblot | Abcam | ab131366 | |
| β-actina (13E5) mAb di coniglio #4970 | Segnalazione cellulare | 4970S |
Riferimenti
- Braun, P., Gingras, A. History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks. Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).
- Yanagida, M. Functional proteomics; current achievements. Journal of Chroma....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
