Le interazioni proteina-proteina sono importanti per chiarire la funzione delle proteine bersaglio e la co-immunoprecipitazione (co-IP) può facilmente confermare i PPI. Abbiamo trasfettato transitoriamente un plasmide codificante una proteina marcata con epitopo in cellule HEK-293 e sviluppato un metodo di immunoprecipitazione per confermare facilmente il legame di due proteine bersaglio.
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Articolo metodologico
Immunoprecipitazione con un gel di affinità antiepitopo per studiare le interazioni proteina-proteina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le interazioni proteina-proteina (PPI) svolgono un ruolo fondamentale nei fenomeni biologici, come l'organizzazione cellulare, la trasduzione del segnale intracellulare e la regolazione trascrizionale. Pertanto, la comprensione dei PPI è un importante punto di partenza per ulteriori indagini sulla funzione della proteina bersaglio. In questo studio, proponiamo un metodo semplice per determinare il legame di due proteine bersaglio introducendo vettori di espressione di mammiferi nelle cellule HEK-293 utilizzando il metodo della polietilenimmina, lisando le cellule in un tampone di lisi proteica fatto in casa e abbassando le proteine bersaglio su un gel di affinità per tag epitopo. Inoltre, il PPI tra le varie proteine fuse con tag epitopo può essere confermato utilizzando anticorpi di affinità contro ciascun tag invece del gel di affinità tag epitopo. Questo protocollo potrebbe anche essere utilizzato per verificare vari PPI, compresi gli estratti nucleari, da altre linee cellulari. Pertanto, può essere utilizzato come metodo di base in una varietà di esperimenti PPI. Le proteine si degradano con un decorso temporale prolungato e ripetuti cicli di gelo-disgelo. Pertanto, la lisi cellulare, l'immunoprecipitazione e l'immunoblotting devono essere eseguite nel modo più fluido possibile.
Introduzione
Le proteine svolgono un ruolo importante in tutte le funzioni cellulari, tra cui l'elaborazione delle informazioni, il metabolismo, il trasporto, il processo decisionale e l'organizzazione strutturale. Le proteine mediano le loro funzioni interagendo fisicamente con altre molecole. Le interazioni proteina-proteina (PPI) sono importanti per mediare le funzioni cellulari, come la mediazione della trasduzione del segnale, il rilevamento dell'ambiente, la conversione dell'energia in movimento fisico, la regolazione dell'attività degli enzimi metabolici e di segnalazione e il mantenimento dell'organizzazione cellulare1. Pertanto, i PPI possono essere utilizzati per chiarire funzioni sconosciute2. I metodi per rilevare gli IPP possono essere classificati in tre tipi: in vitro, in vivo e in silico. Per la rilevazione in vitro di PPI sono state utilizzate la co-immunoprecipitazione (co-IP), la cromatografia di affinità, la purificazione di affinità tandem, gli array proteici, il phage display, la complementazione di frammenti proteici, la cristallografia a raggi X e la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare3. Tra questi metodi, il co-IP è ampiamente utilizzato per la sua semplicità.
Il tag di fusione FLAG è costituito da otto amminoacidi (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDDK), incluso un sito di scissione dell'enterochinasi, ed è stato specificamente progettato per la cromatografia di immunoaffinità4. Le proteine marcate con DYKDDDDK vengono riconosciute e catturate utilizzando un anticorpo anti-DYKDDDDK. Pertanto, vengono efficacemente abbattuti utilizzando le perle di agarosio leganti DYKDDDDK5 per confermare il loro legame a proteine specifiche in modo semplice. L'immunoprecipitazione può essere eseguita in una varietà di cellule e un'ampia gamma di PPI può essere confermata utilizzando anticorpi contro la proteina di interesse. L'immunoprecipitazione e l'eluizione di peptidi con perle di agarosio anti-DYKDDDDK sono state precedentemente riportate5.
Qui, forniamo un semplice metodo di immunoprecipitazione in cui un plasmide che codifica per una proteina marcata con DYKDDDDK viene introdotto transitoriamente nelle cellule HEK-293 per confermare l'associazione di due proteine di interesse. Alcuni anticorpi DYKDDDDK possono legarsi sia all'N-terminale che al C-terminale delle proteine di fusione, ma non ad altri6. Pertanto, per evitare confusione, dovrebbe essere scelto l'anticorpo che riconosce il tag fuso sia con l'estremità N che con quella C. Quando si inserisce un tag epitopo, può essere possibile evitare cambiamenti conformazionali nella proteina inserendo da 3 a 12 coppie di basi tra il tag epitopo e la proteina bersaglio. Tuttavia, la sequenza inserita dovrebbe essere una coppia di basi in multipli di 3 per evitare lo spostamento dei fotogrammi.
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Protocollo
La Figura 1 presenta una panoramica del protocollo.
1. Preparazione di soluzioni e tamponi
- Tampone di lisi proteica: preparare il tampone di lisi proteica seguendo un rapporto precedentemente pubblicato7 (Tabella 1).
- Tampone di lisi proteica + inibitore della proteasi (PI): aggiungere l'inibitore della proteasi (vedere la tabella dei materiali) al tampone sopra preparato (passaggio 1.1). Conservare a -20 °C.
- Tampone campione: Miscelare 900 μL di 4x tampone campione Laemmli (vedere Tabella dei materiali) e 100 μL di 2-mercaptoetanolo. Conservare a -20 °C.
- Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con monolaurato di poliossietilene (20) sorbitano (PBS-P): miscelare 1,998 L di PBS e 2 mL di monolaurato di poliossietilene (20) sorbitano (vedere la tabella dei materiali). Conservare a temperatura ambiente.
- 1x tampone Tris/Glycine/SDS: Miscelare 450 mL di DDW e 50 mL di 10x Tris/Glycine/SDS. Preparare a temperatura ambiente il giorno dell'uso.
2. Trasfezione plasmidica
- Coltivare le cellule HEK-293 in un piatto rivestito di collagene di 10 cm fino alla subconfluenza (80%-95%) utilizzando il terreno di coltura dell'aquila modificato di Dulbecco contenente il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina (10.000 unità/mL di penicillina G e 10.000 μg/mL di streptomicina) (vedere Tabella dei materiali).
- Preparare 1-10 μg di plasmide7 da trasfettare per piatto e preparare una miscela di trasfezione. Aggiungere 150 mM di NaCl a un volume finale di 250 μl per piatto. Vorticare e centrifugare il composto.
- Aggiungere 60 μl di polietilenimmina (PEI, vedere Tabella dei materiali) da 1 mg/mL per piatto, seguiti da 150 mM di NaCl fino a un volume finale di 250 μl di soluzione di PEI.
- Aggiungere la soluzione di PEI alla miscela di trasfezione per ottenere una soluzione miscelata. Immediatamente vortice (alla massima velocità per 3-5 s, eseguire lo stesso in seguito) e girare verso il basso.
- Incubare a temperatura ambiente per 15-30 min. Durante questo periodo, cambia il mezzo delle cellule HEK-293.
- Cospargere 500 μL/piatto di soluzione mista su tutto il piatto di cellule HEK-293 e incubare per una notte (13-14 h).
- Eseguire lo scambio medio il giorno successivo.
3. Lisi cellulare e preparazione del campione
NOTA: Per evitare la degradazione delle proteine, i passaggi successivi devono essere eseguiti il più possibile senza conservare o congelare il campione in modo da congelarlo.
- Circa 48 ore dopo la trasfezione, lavare le cellule tre volte con PBS ghiacciato, aggiungere 500 μL/piatto di tampone di lisi proteica + PI e raccogliere le cellule con raschietto cellulare e pipetta in una provetta a basso adsorbimento proteico su ghiaccio.
- Vorticare ogni 5 minuti e incubare i campioni su ghiaccio per 10 minuti.
- Centrifugare a 16.400 x g per 10 min a 4 °C. Raccogliere il surnatante e trasferirlo in una provetta fresca da 1,5 ml a basso adsorbimento proteico. I campioni possono essere conservati a -80 °C.
- Determinare la concentrazione proteica dei campioni con un kit di misurazione della concentrazione proteica secondo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali).
- Separare 200-1000 μg della stessa quantità di proteine in ciascun campione, quindi aggiungere tampone di lisi proteica + PI per regolare il volume totale a 500-1000 μL.
NOTA: I seguenti passaggi vengono eseguiti sul ghiaccio.
4. Preparazione del liquame
NOTA: Preparare un impasto 1:1 di gel proteico G e gel di affinità per etichette epitopiche il giorno prima o il giorno dell'immunoprecipitazione.
- Preparazione di un gel proteico G
- Utilizzando una punta con l'estremità tagliata, mescolare bene e quindi separare il gel proteico G (vedi Tabella dei materiali) in modo da preparare 20 μl di microsfere per campione.
- Centrifugare a 12.000 x g per 20 s a 4 °C e mettere le perle sul ghiaccio per 1 minuto per consentire alle perle di livellarsi. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta.
- Aggiungere 1 mL di tampone di lisi proteica + PI al gel di proteina G preparato al punto 4.1.2 e mescolare picchiettando e capovolgendo. Centrifugare a 12.000 x g per 20 s a 4 °C, mettere le perle sul ghiaccio per 1 minuto per consentire alle perle di livellarsi e scartare il surnatante.
- Ripetere il passaggio 4.1.3 tre volte.
- Aggiungere un volume uguale di tampone di lisi proteica al gel proteico G per ottenere un impasto di gel proteico G 1:1. L'impasto di gel proteico G può essere conservato a 4 °C per circa 1 giorno.
- Preparazione di un gel di affinità per etichette epitopiche
- Utilizzando una punta con l'estremità tagliata, agitare bene e quindi separare il gel di affinità per etichette epitopiche (vedi Tabella dei materiali) in modo da preparare 10-15 μl di microsfere per campione.
- Centrifugare a 5.000 x g per 30 s a 4 °C e attendere 1 minuto sul ghiaccio per consentire alle perle di stabilizzarsi. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta.
- Aggiungere 1 mL di tampone di lisi proteica + PI al gel di affinità per etichette epitopiche preparato al punto 4.2.2 e mescolare picchiettando e capovolgendo. Centrifugare a 5.000 x g per 30 s a 4 °C, mettere le perle sul ghiaccio per 1 minuto per consentire alle perle di livellarsi e gettare il surnatante con una pipetta.
- Ripetere il passaggio 4.2.3 due volte.
- Aggiungere 500 μl di glicina 0,1 M (pH 3,5) al gel di affinità per etichette epitopiche preparato al punto 4.2.4 e mescolare picchiettando e capovolgendo. Questo passaggio viene eseguito per rimuovere gli anticorpi liberi del tag epitopo. Entro 20 minuti dall'aggiunta di glicina, centrifugare a 5.000 x g per 30 s a 4 °C, porre le perle sul ghiaccio per 1 minuto per consentire alle perle di livellarsi e scartare il surnatante.
- Aggiungere 500 μl di tampone di lisi proteica + PI al gel di affinità per etichette epitopiche preparato al punto 4.2.5 e mescolare picchiettando e invertendo. Centrifugare a 5.000 x g per 30 s a 4 °C, mettere le perle sul ghiaccio per 1 minuto per consentire alle perle di livellarsi e scartare il surnatante.
- Ripetere il passaggio 4.2.6 tre volte.
- Aggiungere un volume uguale di tampone di lisi proteica al gel di affinità per etichette epitopiche per preparare un impasto di gel di affinità per etichette epitopiche 1:1. L'impasto gel di affinità dell'etichetta epitopica può essere conservato a 4 °C per circa 1 giorno.
5. Preclearing con il gel proteico G e cattura dei complessi proteici con il gel di affinità per tag epitopo
- Miscelare l'impasto proteico G 1:1 (preparato nella fase 4) con una pipetta dotata di puntale tagliato e aggiungere 40 μl alla volta al campione.
- Ruotare il campione per 1 ora su un rotatore (vedi Tabella dei materiali) in circa 30 s per ciclo in una camera refrigerata (4 °C).
- Centrifugare a 12.000 x g per 20 s a 4 °C e mettere le perle sul ghiaccio per 1 minuto per consentire alle perle di livellarsi.
- Raccogliere il surnatante e trasferirlo in una nuova provetta da 1,5 ml a basso adsorbimento proteico.
- Separare il campione per l'input dal campione al punto 5.4 e trasferirlo in una nuova provetta da 1,5 mL.
- Aggiungere al campione 20-30 μl di impasto in gel per etichette di epitopi 1:1.
- Ruotare su un rotatore per circa 30 s per ciclo in una camera refrigerata (4 °C) per 2 h.
- Aggiungere il tampone campione all'ingresso preparato al punto 5.5 per diluirlo a 4 volte e riscaldare a 98 °C per 10 minuti. L'ingresso può essere memorizzato a -80 °C.
NOTA: A causa della possibilità di degradazione delle proteine dovuta al congelamento e allo scongelamento, i passaggi successivi devono essere eseguiti senza preservare il più possibile le proteine.
6. Lavaggio ed eluizione delle proteine precipitate
- Impostare la temperatura del blocco termico a 98 °C.
- Centrifugare a 5.000 x g per 30 s a 4 °C e attendere 1 minuto sul ghiaccio per consentire alle perle di stabilizzarsi. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta.
- Aggiungere 1 mL di tampone di lisi proteica + PI e mescolare picchiettando e invertendo. Ruotare su un rotatore per circa 30 s per ciclo in una camera refrigerata (4 °C) per 5 min. Centrifugare a 5.000 x g per 30 s a 4 °C, attendere 1 minuto sul ghiaccio per consentire alle perle di stabilizzarsi e scartare il surnatante.
- Ripetere il passaggio 6.3 5-10 volte.
- Aggiungere 10 μl di tampone campione al campione preparato al punto 6.4. Far bollire a 98 °C per 10 min.
- Centrifugare a 5.000 x g a 4 °C per 30 s.
- Posizionare una colonna in una nuova provetta a basso adsorbimento proteico e trasferire il gel nella colonna utilizzando una pipetta con punta tagliata. Viene utilizzata una colonna per evitare la contaminazione del gel.
- Centrifugare a 9.730 x g per 1 min a 4 °C. Raccogli il flusso. Il campione può essere conservato a -80 °C.
NOTA: Se la degradazione del campione è un problema, è necessario eseguire il seguente immunoblotting senza congelamento.
7. Immunoblotting
NOTA: Le procedure di immunoblotting si basano su rapporti precedenti 7,8.
- Caricare campioni interi su un gel di poliacrilammide dodecilsolfato di sodio (SDS-PAGE, vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Se necessario, utilizzare gel a pozzetti grandi in modo che l'intero campione possa essere trasferito. Qui sono stati utilizzati gel con pozzetti da 50 μL. - Posizionare i gel nella camera di elettroforesi e aggiungere 1x tampone Tris/Glicina/SDS (vedi Tabella dei materiali) fino al volume appropriato intorno ai gel.
- Gel elettroforesi a 100 V e 400 mA.
- Trasferire su membrane in fluoruro di polivinilidene (PVDF, vedi Tabella dei materiali).
- Bloccare le macchie di membrana in PVDF con latte scremato al 5% in PBS-P per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare la membrana tre volte con PBS-P su uno shaker alla massima velocità per 5 minuti. Eseguire la stessa procedura successivamente durante il lavaggio.
- Incubare per una notte su uno shaker con l'anticorpo primario (vedere la tabella dei materiali) a 4 °C.
- Lavare la membrana tre volte con PBS-P il giorno successivo.
- Incubare per 1 ora con l'anticorpo secondario su un agitatore a temperatura ambiente.
NOTA: Se il peso molecolare della proteina bersaglio è vicino alla catena pesante IgG, che ha un peso molecolare di circa 50 kDa, è possibile utilizzare un anticorpo secondario specifico per la catena leggera per evitare la sovrapposizione della banda bersaglio con la catena pesante IgG. Questo studio ha utilizzatoanticorpi 7 specifici per la catena leggera o Veriblot come reagente per la rilevazione della proprietà intellettuale (vedere la Tabella dei materiali). - Identificare bande di proteine con substrati luminescenti di perossidasi. La membrana può essere salvata in PBS dopo averla lavata due volte con PBS-P.
- Spelare per 10 minuti con una soluzione di strippaggio (vedi Tabella dei materiali).
- Lavare tre volte e bloccare con il 5% di latte scremato in PBS-P. Il protocollo successivo è lo stesso del passaggio 7.6 in poi.
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Risultati
Gli adipociti termogenici, noti anche come adipociti marroni e beige, hanno potenziali effetti anti-obesità e anti-intolleranza al glucosio. PR (PRD1-BF1-RIZ1 omologo) contenente il dominio 16 (PRDM16) è un cofattore di trascrizione che svolge un ruolo importante nel determinare l'identità degli adipociti termogenici 9,10.
L'EHMT1 (istone-lisina N-metiltransferasi 1 eucromatica), nota anche come GLP, catalizza principalmente la mono- e...
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Discussione
Questo protocollo è quasi come i protocolli 5,7,14,15 precedentemente riportati. Il punto importante di questo protocollo è che non interrompiamo mai l'esperimento dalla fase di lisi cellulare alla fase di immunoprecipitazione. La degradazione delle proteine ostacola il rilevamento dei PPI. Il decorso prolungato e i ripetuti cicli di gelo-disgelo degradano le proteine. L'elettroforesi in SDS-PA...
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Dichiarazioni
Dichiariamo che nessuno degli autori ha conflitti di interesse relativi a questo studio.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Number 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K08672 (H.O.), Japan Diabetes Society Research Grant for Young Investigators (G.N.) e MSD Life Science Foundation Research Grant for Young Investigators (G.N.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA (pH8.0) | Nippon gene | 311-90075 | |
| 10% Mini-PROTEAN TGX Gel proteici prefabbricati, 10 pozzetti, 50 e micro; L | Biorad | 4561034 | |
| 10x Tris/Glicina/SDS | Biorad | 1610772 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Anti-Topo IgG, Pecora Addominale intera collegata a HRP | GE Healthcare | NA931-1ML | |
| IgG anti-coniglio, Asino addominale intero collegato a HRP | GE Healthcare | NA934-1ML | |
| Raschietto cellulare M | Sumitomo Bachelite | MS-93170 | |
| Collagene I Coat Dish 100 mm | IWAKI | 4020-010 | |
| cOmplete, senza EDTA Inibitore della proteasi Cocktail | Roche | 4693132001 | |
| DMEM/F-12, integratore GlutaMAX | Invitrogen | 10565042 | |
| D-PBS (-) | FUJIFILM Wako | 045-29795 | |
| Glicerolo | FUJIFILM Wako | 072-00626 | |
| Glicina | FUJIFILM Wako | 077-00735 | |
| HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724 | Segnalazione cellulare | C29F4 | |
| Laemmli Tampone per campioni | Bio-Rad Laboratories | 161-0747 | |
| Colonne per cromatografia Micro Bio-Spin Biorad | 7326204 | ||
| Mini-PROTEAN Tetra Cell per mini gel prefabbricati | Biorad | 1658004JA | |
| Anticorpo monoclonale ANTI-FLAG M2 prodotto nel topo | Sigma | F3165 | |
| NaCl | FUJIFILM Wako | 191-01665 | |
| pcDNA3.1-FLAG-PRDM16 | Questo documento | N/A | |
| pcDNA3.1-HA-EHMT1 | Questo documento | N/A | |
| pcDNA3.1-vector | Questo documento | N/A | |
| PEI MAX - Grado di trasfezione lineare Polietilenimina cloridrato | PSI | 24765 | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | FUJIFILM Wako | 168-23191 | |
| Kit di analisi delle proteine BCA Pierce | Thermo scientific | 23227 | |
| Poliossietilene(10) Etere ottilfenilico | FUJIFILM Wako | 168-11805 | |
| Poliossietilene(20) Monolaurato di sorbitano | FUJIFILM Wako | 167-11515 | |
| Protein G Sepharose 4 confezioni da laboratorio a flusso rapido | Cytiva | 17061801 | |
| Protein LoBind Tubes | eppendorf | 30108442 | |
| ROTATOR RT-5 | TAITEC | RT-5 | |
| latte scremato | Morinaga | 0652842 | |
| Soluzione di strippaggio | FUJIFILM Wako | 193-16375 | |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack | Biorad | 1704156B03 | |
| Trans-Blot Turbo System | Biorad | N/A | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Siero fetale bovino testato USDA (FBS) | HyClone | SH30910.03 | |
| Veriblot | Abcam | ab131366 | |
| β-actina (13E5) mAb di coniglio #4970 | Segnalazione cellulare | 4970S |
Riferimenti
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