Method Article

Identificazione delle popolazioni microambientali del midollo osseo nella sindrome mielodisplastica e nella leucemia mieloide acuta

DOI:

10.3791/66093

⸱

November 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Wilmot Cancer Institute, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 3Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 4Genomics Research Center, University of Rochester Medical Center, 5Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, University of Rochester Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per isolare e caratterizzare le popolazioni microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindromi mielodisplastiche e leucemia mieloide acuta. Questa tecnica identifica i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo non ematopoietico, comprese le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, con progressione della malattia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il microambiente del midollo osseo è costituito da popolazioni cellulari distinte, come le cellule stromali mesenchimali, le cellule endoteliali, le cellule osteolignaggio e i fibroblasti, che forniscono supporto alle cellule staminali ematopoietiche (HSC). Oltre a supportare le normali HSC, il microambiente del midollo osseo svolge anche un ruolo nello sviluppo di malattie delle cellule staminali ematopoietiche, come le sindromi mielodisplastiche (MDS) e la leucemia mieloide acuta (LMA). Le mutazioni associate alle MDS nelle HSC portano a un blocco della differenziazione e a una progressiva insufficienza del midollo osseo, soprattutto negli anziani. Le MDS possono spesso progredire verso la LMA resistente alla terapia, una malattia caratterizzata da un rapido accumulo di blasti mieloidi immaturi. È noto che il microambiente del midollo osseo è alterato nei pazienti con queste neoplasie mieloidi. Qui viene descritto un protocollo completo per isolare e caratterizzare fenotipicamente le cellule microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindrome mielodisplastica e leucemia mieloide acuta. L'isolamento e la caratterizzazione dei cambiamenti nelle popolazioni di nicchia del midollo osseo può aiutare a determinare il loro ruolo nell'inizio e nella progressione della malattia e può portare allo sviluppo di nuove terapie mirate alle alterazioni che promuovono il cancro nelle popolazioni stromali del midollo osseo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il microambiente del midollo osseo è costituito da cellule ematopoietiche, cellule stromali non ematopoietiche e dalla matrice extracellulare 1,2. Questo microambiente può promuovere l'autorinnovamento delle cellule staminali ematopoietiche, regolare la differenziazione del lignaggio e fornire supporto strutturale e meccanico al tessuto osseo 1,2,3,4,5. La nicchia stromale comprende le cellule dell'osteolignaggio, i fibroblasti, le cellule nervose e le cellule endoteliali6, mentre la nicchia ematopoietica è costituita dalle popolazioni linfoidi e mieloidi 1,2,3. Oltre a supportare le normali HSC, il microambiente del midollo osseo può anche svolgere un ruolo nello sviluppo di malattie delle cellule staminali ematopoietiche come MDS e LMA 7,8,9,10,11. È stato dimostrato che le mutazioni nelle cellule osteolignaggi promuovono lo sviluppo di MDS, LMA e altre neoplasie mieloproliferative 10,12,13,14.

Le sindromi mielodisplastiche sono un gruppo di malattie preleucemiche che derivano da mutazioni nelle cellule staminali ematopoietiche. La MDS è spesso associata a un blocco della differenziazione delle HSC e alla produzione di cellule displastiche, che spesso possono portare a insufficienza del midollo osseo. La MDS è la neoplasia mieloide più comunemente diagnosticata negli Stati Uniti ed è associata a un tasso di sopravvivenza a 3 anni del 35%-45%15. La MDS è spesso associata a un alto rischio di trasformazione in leucemia mieloide acuta. Questa può essere una complicanza fatale, poiché la LMA derivata da MDS è resistente alla maggior parte delle terapie e può recidiva. Anche la LMA che insorge de novo a causa di traslocazioni o mutazioni nel tronco ematopoietico e nei progenitori è spesso resistente alla chemioterapia standard16,17. Poiché le MDS e la LMA sono principalmente malattie degli anziani, con la maggior parte diagnosticate oltre i 60 anni, la maggior parte dei pazienti non è idonea per i trapianti curativi di midollo osseo. C'è, quindi, una significativa necessità di identificare nuovi regolatori della progressione della malattia. Poiché il microambiente del midollo osseo può fornire supporto alle cellule maligne14, la definizione dei cambiamenti nella nicchia del midollo osseo con progressione della malattia può portare all'identificazione di nuove terapie volte a inibire il rimodellamento della nicchia tumorale. C'è, quindi, una significativa necessità di identificare nuovi regolatori della progressione della malattia. A tal fine, è fondamentale identificare e caratterizzare i cambiamenti nelle popolazioni di cellule stromali del midollo osseo che possono fornire supporto alle cellule maligne.

Sono stati generati diversi modelli murini di LMA e MDS che possono essere utilizzati per studiare i cambiamenti nel microambiente del midollo osseo durante l'inizio e la progressione della malattia 6,1,19,20,21,22. Qui, vengono descritti i protocolli per identificare i cambiamenti nelle popolazioni di cellule stromali del midollo osseo utilizzando modelli murini di LMA 6,20 indotta da retrovirale, nonché il modello Nup98-HoxD13 (NHD13) disponibile in commercio di MDS ad alto rischio in trasformazioneAML 19. I topi trapiantati con cellule di LMA de novo soccombono alla malattia in 20-30 giorni6. I topi NHD13 sviluppano citopenie e displasia del midollo osseo intorno alle 15-20 settimane, che alla fine si trasformano in LMA, e quasi il 75% dei topi soccombe alla malattia intorno alle 32 settimane. Per analizzare le popolazioni del microambiente del midollo osseo modello murino, le ossa vengono prelevate, il midollo osseo e le spicole ossee vengono digeriti utilizzando la digestione enzimatica e le cellule vengono quindi arricchite per le popolazioni non ematopoietiche CD45-/Ter119- mediante ordinamento magnetico. Sebbene analisi simili siano state descritte in precedenza 11,13,22,23,24,25, spesso si concentrano sul midollo osseo o sull'osso e non incorporano cellule provenienti da entrambe le fonti nelle loro analisi. La caratterizzazione combinata di queste popolazioni, in combinazione con le analisi dell'espressione genica, può fornire una comprensione completa di come il microambiente ematopoietico cellulare fornisca supporto per l'inizio e la progressione della malattia (Figura 1). Mentre il protocollo descritto di seguito si concentra sul modello di LMA indotto retroviralmente e su un modello genetico di MDS, queste strategie possono essere facilmente adattate per studiare i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo di qualsiasi modello murino di interesse.

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Protocol

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato per le risorse animali dell'Università di Rochester. I topi sono stati allevati e mantenuti nelle strutture per la cura degli animali dell'Università di Rochester. Per modellare le MDS ad alto rischio, viene utilizzato il modello murino NHD1319 disponibile in commercio. In questo modello, le cellule stromali del midollo osseo vengono analizzate in topi femmina NHD13 a 8 settimane di età, prima dell'insorgenza della malattia. De novo L'AML viene generato come descritto in precedenza 6,11,20. Gli oncogeni utilizzati per indurre la LMA, come MLL-AF9 e NRas, sono marcati con GFP o YFP, consentendo l'analisi delle popolazioni di midollo osseo GFP non leucemiche utilizzando la citometria a flusso. In breve, topi femmina C57BL/6J di 10 settimane vengono trapiantati con cellule AML murine GFP/YFP+ e il midollo osseo viene raccolto 2 settimane dopo il trapianto. Mentre i topi femmina sono utilizzati in questo studio a scopo dimostrativo, questo protocollo può essere condotto con topi maschi o femmine. Può anche essere eseguita utilizzando un femore o tutte le ossa lunghe.

1. Prelievo del midollo osseo

NOTA: Per i dettagli sul protocollo di dissezione degli animali, fare riferimento a Amend et al.26.

  1. Pulire il mortaio e il pestello con etanolo al 70%, sciacquarli con tampone FACS refrigerato (Tabella 1) e metterli sul ghiaccio a raffreddare prima di iniziare la raccolta. Inoltre, posizionare il tampone MACs (Tabella 1) sul banco per consentirgli di raggiungere la temperatura ambiente.
  2. Sopprimere l'animale seguendo le linee guida e i protocolli istituzionali per la cura e l'uso degli animali.
  3. Sul piano di lavoro, spruzzare accuratamente il topo con etanolo al 70% fino a quando il pelo non è bagnato. Usando una pinza e delle forbici ricurve, sollevare la pelle sull'addome e praticare due incisioni di circa 0,5 mm di lunghezza su entrambi i lati del topo, lateralmente dall'addome. Successivamente, praticare un'incisione di 0,5 mm distale dall'addome. Tirare verso il basso per rimuovere la pelle e il pelo dalle zampe del topo.
  4. Posizionare le forbici perpendicolarmente al bacino, premere verso il basso mentre si tira verso l'alto il femore con una pinza. La testa del femore dovrebbe staccarsi dal bacino. Separare il femore e la tibia all'articolazione femoro-rotulea. Posizionare le ossa nel tampone FACS in una piastra a 6 pozzetti su ghiaccio.
  5. Rimuovere il tessuto dalle ossa utilizzando tessuto di laboratorio e posizionare le ossa pulite in una nuova piastra a 6 pozzetti con tampone FACS fresco su ghiaccio.
  6. Mettere tutte le ossa nel mortaio con 2-5 ml di tampone FACS in modo che tutte le ossa siano immerse nel tampone (regolare il volume del tampone in base al numero di ossa che si stanno lavorando). Schiacciare e macinare le ossa usando il pestello con un movimento circolare fino a quando il tessuto del midollo osseo non viene rilasciato.
  7. Utilizzando una siringa da 3 ml, omogeneizzare il midollo osseo tirando verso l'alto e sciacquando il liquido dal mortaio.
  8. Utilizzando una siringa da 3 ml, estrarre il liquido dalla malta e filtrarlo attraverso un colino cellulare da 70 μm in una provetta da 50 mL su ghiaccio. Sciacquare i pezzi di osso/tessuto dal filtro nel mortaio con tampone FACS e tornare al passaggio 1.7 per omogeneizzare e filtrare una seconda volta. Questa costituisce la frazione del midollo osseo.
  9. Sciacquare i restanti pezzi di osso (spicole) nella malta con tampone FACS e sciacquarli in una provetta da 15 mL utilizzando un tampone FACS per garantire la massima resa cellulare. Questa è la frazione delle spicole ossee.

2. Digestione del midollo osseo

  1. Centrifugare il midollo osseo a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Decantare e scartare il surnatante.
  2. Risospendere il midollo osseo in 2 mL della miscela per la digestione del midollo osseo (Tabella 1) e trasferirlo in una provetta da 15 mL. Incubare a 37 °C per 45 minuti su un rotatore.
  3. Aggiungere 10 mL di tampone FACS per arrestare la digestione enzimatica. Filtrare la miscela attraverso un colino cellulare da 70 μm in una nuova provetta da 50 ml.
  4. Pellet la miscela a 400 x g per 7 minuti a 4 °C.
  5. Risospendere il pellet di midollo osseo in 1 mL di tampone di lisi per globuli rossi (vedere Tabella dei materiali). Incubare per 4 minuti con ghiaccio.
  6. Aggiungere 10 mL di tampone FACS per arrestare la lisi. Filtrare la miscela attraverso un colino cellulare da 70 μm in una nuova provetta da 50 ml.
  7. Pellet la miscela a 300 x g per 5 min a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 100 μL di tampone FACS.

3. Digestione delle spicole ossee

  1. Vorticare le spicole ossee dal passaggio 1.9 e lasciarle depositare. Decantare il surnatante e trattenere l'osso sul fondo.
  2. Risospendere le spicole ossee in 1 mL della miscela per la digestione delle spicole ossee (Tabella 1).
  3. Posizionare i tubi su un rotatore di tubi per 60 minuti a 37 °C.
  4. Aggiungere 10 mL di tampone FACS per arrestare la digestione enzimatica. Filtrare la miscela attraverso un colino cellulare da 70 μm nella provetta da 50 mL contenente il midollo osseo lisizzato e digerito dai globuli rossi.

4. Colorazione

  1. Mescolare delicatamente le spicole ossee e la sospensione delle cellule del midollo osseo.
  2. Utilizzare 10 μL della sospensione cellulare per contare il numero di cellule vive su un emocitometro utilizzando la colorazione a base di blu di tripano allo 0,4%, come descritto nei protocolli pubblicati27. Raccogli 50.000 cellule per un controllo non colorato dalla sospensione cellulare.
  3. Centrifugare le restanti cellule a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospenderlo in 100 μL di tampone FACS.
    NOTA: Gli anticorpi possono essere titolati per determinare la diluizione ideale. La selezione degli anticorpi (epitopi e fluorocromi) può essere personalizzata.
  4. Per la colorazione con anticorpi per la deplezione magnetica, aggiungere FC Block (1 μL per 25 x 106 cellule), CD45-APC (10 μL per 25 x 106 cellule) e Ter119-APC (4 μL per 25 x 106 cellule) (vedi Tabella dei materiali).
  5. Incubare su ghiaccio per 20 min. Lavare con tampone FACS, rimuovere 50.000 cellule (~50 μL) per il controllo colorato con APC, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e risospendere in 100 μL di tampone FACS.
  6. Per la colorazione della sospensione cellulare con microsfere per la deplezione magnetica, aggiungere mIgG (8 μL per 25 x 106 cellule) e microsfere Anti-APC (20 μL per 25 x 106 cellule) (vedere Tabella dei materiali).
  7. Incubare su ghiaccio per 20 min. Lavare con tampone FACS da 10 mL, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.

5. Esaurimento del campione mediante cernita magnetica

NOTA: Questa fase viene eseguita utilizzando un separatore magnetico manuale disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore. Questo passaggio può essere eseguito anche con un separatore automatizzato (vedi Tabella dei materiali).

  1. Preparare la colonna LD lavandola con 2 mL di tampone MACs (Tabella 1). Scartare l'effluente e sostituire la provetta di raccolta.
  2. Risospendere fino a 1 x 108 cellule nel tampone MAC e filtrarle attraverso una provetta da 5 mL con un tappo di filtro da 35 μm.
  3. Posizionare la colonna LD sul supporto del separatore magnetico. Posizionare una provetta da 5 mL sotto la colonna per raccogliere l'eluato.
  4. Aggiungere la sospensione cellulare alla colonna LD preparata. Lasciare che la frazione negativa fluisca nella provetta di raccolta. Lavare la colonna due volte con 1 mL di tampone MACs, raccogliendo l'eluato nella stessa provetta. Questa è la frazione negativa utilizzata nel passaggio 5.6 di seguito.
  5. Rimuovere la colonna LD dal supporto del separatore magnetico e posizionarla su una nuova provetta da 5 mL. Utilizzare una pipetta per erogare 3 mL di tampone nella colonna per eliminare le cellule che sono state marcate positivamente, utilizzando lo stantuffo della colonna.
  6. Centrifugare le frazioni negativa e positiva a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospenderli in 100 μL di tampone FACS.
  7. Contare 10 μL delle frazioni negativa e positiva con lo 0,4% di blu di tripano. I volumi per l'osteoanalisi/colorazione del pannello endoteliale di seguito si baseranno su questa conta cellulare.
  8. Utilizzare 50.000 cellule vive dalla frazione positiva per i controlli di gating della citometria a flusso.

6. Osteoanalisi/colorazione del pannello endoteliale

NOTA: La compensazione deve essere eseguita seguendo i protocolli standard di citometria a flusso, compresi tutti i controlli appropriati di colorazione e gating.

  1. Per la colorazione della frazione negativa CD45/Ter119 (1 μL di ciascun anticorpo per 1 x 106 cellule), aggiungere CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE e CD140a-PE-Cy5 (vedere la tabella dei materiali).
  2. Incubare su ghiaccio per 20 min. Lavare con 2 mL di tampone FACS, quindi centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
  3. Aggiungere 1 mL di tampone FACS e una diluizione 1:1000 di PI per la colorazione viva/morta, quindi filtrare il campione attraverso una provetta da 5 mL con un tappo di filtro cellulare da 35 μm.
  4. Analizza le cellule su un citometro a flusso multicolore.

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Results

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Questo articolo descrive un metodo basato sulla citometria a flusso per l'analisi delle popolazioni microambientali del midollo osseo, come le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, da modelli murini di MDS e leucemia (Figura 1). La Figura 2 illustra la strategia di gating per l'individuazione delle popolazioni di interesse, a partire dalla selezione delle cellule (P1) nella frazione digerita e depleta di CD45/Ter119 attraverso il profilo di scatter dirett...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I modelli di leucemia murina sono stati ampiamente utilizzati per identificare i segnali cellulari intrinseci e di nicchia che promuovono la progressione della leucemia mieloide aggressiva 6,19,21. Qui, viene presentato un protocollo completo basato sulla citometria a flusso per definire la composizione cellulare del microambiente del midollo osseo in modelli murini di MDS e AML.

Prima di acquisire i ...

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Disclosures

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Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il Flow Cytometry Core di URMC. Questo lavoro è stato sostenuto dall'American Society of Hematology Scholar Award, dal premio della Leukemia Research Foundation e dalle sovvenzioni NIH R01DK133131 e R01CA266617 assegnato a J.B.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Puntali per pipette da 1 ml Genesee Scientific Provette per microcentrifuga 24-165RL
da 1,7 mLAVANTL211511-CS
10 &; L pipetta PunteGenesee Scientific 24-140RL
Pipette sierologiche sterili da 10 mL confezionate singolarmenteGlobe scientific1760
Pallone per filtrazione sottovuoto da 1000 mLNEST344021
Provetta da centrifuga da 15 mLVWR10026-076
Pipetta di aspirazione da 2 mLNEST325011
200 &; L pipetta PunteGenesee Scientific 24-150-RL
Pipette sierologiche sterili da 25 mL confezionate singolarmenteGlobe scientific1780
Pipette sierologiche sterili da 5 mL confezionate singolarmente Globescientific1740
Provetta a fondo tondo in polistirene da 5 mL 12 x 75 mm stileFalcon352054
5 mL in polistirene con tappo per filtro cellulare 12 x 75 mm stileFalcon
Provetta da centrifuga da 50 mlNEST602052
6 pozzetti, fondo piatto con coperchio a bassa evaporazione Falcon353046
Underpads assorbenti con barriera all'umidità impermeabileVWR56616-031
APC MicroBeadsMiltenyi 130-090-855
autoMACS Pro SeparatoreMiltenyi Biotec GmBH4425745
BD Pharmingen Ratto purificato Anti-Topo CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences5531410,5 mg/mL 
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA790666.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-topo Ly-6A/E (Sca-1) Anticorpo (D7)Invitrogen404-59810,2 mg/mL
C57BL/6J MiceJackson Laboratory 664
Serbatoio di gas di anidride carbonicaAirgasCD50
CD31 (PECAM-1) Anticorpo monoclonale (390), PE-Cianina7Invitrogen25-0311-820,2 mg/mL
CD45 Anticorpo monoclonale (30-F11), APCInvitrogen17-0451-820,2 mg/mL
Filtro cellulare 70 &; m Nylon Falcon352350
Cole-Parmer Essentials Mortaio e Pestello; Agata, 125 mLCole-ParmerEW-63100-62
Collagenasi da Clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138-500MG
Collagenasi di tipo ISTEMCELL7415
Corning Mini centrifugaCORNING6770
Corning Stripettor Ultra Pipet ControllerCorning4099
Desossiribonucleasi I da pancreas bovinoSigma-AldrichD4513
Dispase II, polvereGibco117105041
DPBS 10xgibco14200-075
eBioscience 1x RBC Lisi TamponeInvitrogen00-4333-57
Etanolo assoluto, KOPTEC, soddisfa le specifiche analitiche di BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)VWR89125-174
Forbici fini - affilateFine Science Tools14061-10
Fondazione B Fetale Siero BovinoGeminiBio900-208
Gilson  PIPETMAN L Pipette Starter KitFisherScientific 
Graefe ForcipeStrumenti per la scienza fine11051-10
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) 10xgibco14185-052
EmocitometroFisher02-671-10
Incubatrice BINDERC150-UL
KimwipesKIMTECHK222101
LABGARD Classe II, Tipo A2 Cabina di sicurezza biologicaNuaireNU-425-400
Colonne LDMiltenyi Biotec GmBH130-042-901
LSE Vortex MixerCORNING6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1Becton, Dickinson and Company647800L6
MACS SUPPORTO MULTIPLOMiltenyi Biotec GmBH130-042-303
MACsmix Rotatore per tubi Miltenyi Biotec GmBH130-090-753
mIgGMillipore-Sigma18765-10mg2 mg/mL 
Nup98-HoxD13 (NHD13) TopiJackson Laboratory 
PE anti-topo CD51 Anticorpo (RMV-7)Biolegend1041060,2 mg/mL
PE/Cianina5 anti-topo CD140a Anticorpo (RUO)Biolegend1359200,2 mg/mL
Penicillina-Streptomicina Gibco1514012210.000 U/mL
Siringa Plastipak 3 mLBecton, Dickinson and Company309657
Ioduro di Propidio - 1,0 mg/mL Soluzione in AcquaThermoFisher ScientificP3566
QuadroMACS  Separatore Miltenyi Biotec GmBH130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus SerieCentrifuga Thermo Scientific 
75009521 Anticorpo monoclonale TER-119 (TER-119), APCInvitrogen17-5921-820,2 mg/mL
Soluzione di Tripano Blu 0,4%Gibco15-250-061
Ultrapuro 0,5 M EDTA, pH 8,0 Invitrogen15575-038
352235F167370G010505

References

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