Articolo metodologico

Immunodosaggio portatile su carta combinato con l'applicazione per smartphone per la rilevazione colorimetrica e quantitativa dell'antigene NS1 della dengue

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DOI:

10.3791/66130

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26 gennaio 2024

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1Department of Pharmacy, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Universitas Islam Indonesia, 2School of Bioresources and Technology, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 3Department of Otolaryngology, Phramongkutklao Hospital and College of Medicine, 4Sensor Technology Laboratory, Pilot Plant Development and Training Institute, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 5Biosciences and Systems Biology Research Team, National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, National Sciences and Technology Development Agency at King Mongkut's University of Technology Thonburi

In questo articolo

Sommario

Per rispondere alle esigenze diagnostiche urgenti della dengue, qui presentiamo un dispositivo analitico cartaceo Dengue NS1 integrato nell'app per smartphone (DEN-NS1-PAD) per quantificare la concentrazione dell'antigene Dengue NS1 in campioni clinici di siero/sangue. Questa innovazione migliora la gestione della dengue aiutando il processo decisionale clinico in vari contesti sanitari, anche quelli con risorse limitate.

Abstract

L'infezione da virus della dengue (DENV), trasmessa dalle zanzare Aedes , è una delle principali preoccupazioni per la salute pubblica nei paesi tropicali e subtropicali. Con un'incidenza annua di circa 10 milioni di casi e 20.000-25.000 decessi, in particolare tra i bambini, c'è un urgente bisogno di strumenti diagnostici pratici. La presenza della proteina non strutturale 1 (NS1) della dengue durante l'infezione precoce è stata collegata al rilascio di citochine, alla perdita vascolare e alla disfunzione endoteliale, rendendola un potenziale marcatore per la dengue grave.

I test immunologici cartacei, come i saggi a flusso laterale (LFA) e i dispositivi analitici microfluidici basati su carta (PAD), hanno guadagnato popolarità come test diagnostici grazie alla loro semplicità, rapidità, economicità, specificità e facilità di interpretazione. Tuttavia, i test immunologici convenzionali su carta per la rilevazione della dengue NS1 si basano in genere sull'ispezione visiva, producendo solo risultati qualitativi. Per ovviare a questa limitazione e migliorare la sensibilità, abbiamo proposto un test di rilevamento della dengue NS1 altamente portatile su un dispositivo analitico (PAD) basato su carta, ovvero DEN-NS1-PAD, che integra un'applicazione per smartphone come lettore colorimetrico e quantitativo. Il sistema di sviluppo consente la quantificazione diretta delle concentrazioni di NS1 nei campioni clinici.

I campioni di siero e di sangue ottenuti dai pazienti sono stati utilizzati per dimostrare le prestazioni del prototipo del sistema. I risultati sono stati ottenuti immediatamente e possono essere utilizzati per la valutazione clinica, sia in strutture sanitarie ben attrezzate che in contesti con risorse limitate. Questa combinazione innovativa di un test immunologico cartaceo con un'applicazione per smartphone offre un approccio promettente per migliorare il rilevamento e la quantificazione dell'antigene NS1 della dengue. Aumentando la sensibilità oltre le capacità dell'occhio nudo, questo sistema ha un grande potenziale per migliorare il processo decisionale clinico nella gestione della dengue, in particolare in aree remote o scarsamente servite.

Introduzione

L'infezione da virus dengue (DENV) è la malattia trasmessa dalle zanzare a più rapida diffusione1 e più di 390 milioni di persone sono infettate da 96 milioni di infezioni sintomatiche, 2 milioni di casi di malattia grave e più di 25.000 decessi all'anno si verificano nel mondo 1,2. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), si stima che 3,9 miliardi di persone siano a rischio di dengue; ~70% vive nei paesi dell'Asia-Pacifico e principalmente nel sud-est asiatico3. Nel 2019, il numero di casi di dengue segnalati all'OMS è stato di 4,2 milioni e la Thailandia ha contribuito con almeno 136.000 casi di dengue e 144 casi di morte per infezione da dengue4. L'epidemia di dengue in Thailandia si verifica durante la stagione delle piogge, da aprile a dicembre, sia nelle aree urbane che in quelle rurali, soprattutto nell'area nord-orientale.

Le infezioni da DENV hanno diverse manifestazioni cliniche che vanno dai sintomi subclinici, alla febbre dengue lieve (DF) alla febbre emorragica dengue grave (DHF). La caratteristica principale di una grave condizione di DHF è l'aumento della permeabilità vascolare seguito da shock e disfunzione d'organo1. Comprendere il percorso molecolare che può causare la perdita vascolare è molto importante nello sviluppo di trattamenti efficaci per la dengue. La proteina non strutturale 1 (NS1) della dengue è una glicoproteina secreta durante l'infezione viraleprecoce 5,6 e funziona come cofattore per la replicazione dell'RNA virale7. NS1 può innescare il rilascio di citochine e contribuire alla perdita vascolare legandosi al recettore toll-like 4 (TLR4) e al glicocalice endoteliale 8,9. La ricerca in vitro ha dimostrato che NS1 interagisce con le cellule endoteliali e induce l'apoptosi. Questa condizione può contribuire alla disfunzione endoteliale e alla perdita vascolare10. I livelli sierici dell'antigene NS1, correlati con i livelli sierici di interleuchina (IL)-10, sono aumentati significativamente nei pazienti con malattia clinica grave11. La dengue NS1 contribuisce anche alla patogenesi della malattia inducendo IL-10 e sopprimendo le risposte delle cellule T specifiche per DENV12,13. Inoltre, la proteina NS1 della dengue è stata correlata a una grave malattia clinica e la concentrazione di NS1 > 600 ng mL-1 nei primi 3 giorni di malattia è stata associata allo sviluppo di DHF14.

La persistenza dell'antigene NS1 della dengue nei pazienti con DHF potrebbe essere utilizzata come marcatore di dengue6 grave. Esistono diversi metodi per rilevare NS1 nei campioni clinici, come il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e il test rapido15. Il gold standard per misurare la concentrazione di proteine NS1 in ambito clinico è il metodo ELISA. Tuttavia, il metodo ELISA è costoso e richiede personale qualificato e strutture di laboratorio16. Pertanto, lo sviluppo di una tecnologia per rilevare e quantificare le proteine NS1 nel test point-of-care (POCT) è ancora in corso. Nell'ultimo decennio, i test immunologici cartacei come i saggi a flusso laterale (LFA) e i dispositivi analitici microfluidici basati su carta (μPAD) sono diventati popolari come test diagnostici grazie alla loro semplicità, rapidità, economicità e specificità 17,18,19. In un test immunologico su carta, sono state utilizzate diverse etichette per generare segnali, come nanoparticelle d'oro (AuNPs)20, nanoparticelle magnetiche21,22, punti quantici23 e materiali fluorescenti24,25. Le AuNP sono le etichette più comuni utilizzate nei test immunologici cartacei grazie al loro basso costo di produzione, alla facilità di fabbricazione, alla stabilità e alla semplice lettura. Attualmente, i saggi a flusso laterale (LFA) per la dengue NS1 sono notoriamente utilizzati in ambito clinico26,27. Tuttavia, il rilevamento convenzionale delle etichette LFA utilizza comunemente l'occhio nudo e fornisce solo risultati qualitativi.

Nell'ultimo decennio, più di 5 miliardi di smartphone sono stati ampiamente utilizzati a livello globale e c'è il potenziale per sviluppare il rilevamento portatile28,29. Gli smartphone hanno capacità multifunzionali come sensori fisici integrati, processori multi-core, fotocamere digitali, porte USB, porte audio, wireless e software applicativo, che li rendono adatti per l'uso in varie piattaforme di biosensori30. Inoltre, le tecnologie wireless consentono di inviare rapidamente i dati e possono essere utilizzate per il monitoraggio in tempo reale e in loco31. Mudanyali et al. hanno combinato il test immunologico cartaceo e gli smartphone per sviluppare una piattaforma POCT portatile, senza apparecchiature, rapida, a basso costo e facile da usare per la malaria, la tubercolosi e l'HIV32. Ling et al. hanno riportato un test a flusso laterale combinato con la fotocamera di uno smartphone per rilevare quantitativamente l'attività della fosfatasi alcalina nel latte33. Hou et al. hanno anche sviluppato un sistema di imaging a doppia modalità basato su smartphone per segnali quantitativi da colore o fluorescenza nel saggio a flusso laterale34. Inoltre, l'utilizzo dello smartphone come lettore colorimetrico e quantitativo può migliorare la sensibilità mentre l'occhio nudo non può segnalare con sicurezza la presenza del target35.

Rappresentando una svolta nella diagnostica della dengue, il DEN-NS1-PAD 36,37,38 (d'ora in poi denominato dispositivo) offre una soluzione portatile ed efficiente. Utilizzando la tecnologia microfluidica a base di carta stampata a cera, questo dispositivo quantifica NS1 con elevata sensibilità e specificità attraverso l'elaborazione delle immagini. Per migliorarne ulteriormente l'utilità, abbiamo sviluppato un'app per smartphone di facile utilizzo per la lettura colorimetrica e quantitativa. La convalida clinica utilizzando campioni di pazienti provenienti da ospedali thailandesi sottolinea il suo impatto immediato sulla valutazione dei pazienti in tempo reale. La nostra innovazione segna un progresso fondamentale nella gestione semplificata della dengue point-of-care, promettendo di rivoluzionare la diagnostica in ambienti sanitari con risorse limitate.

Protocollo

Il Comitato Etico dell'Institutional Review Board, Royal Thai Army Medical Department, Phramongkutklao Hospital, Bangkok, Thailandia (IRBRTA 1218/2562) ha concesso l'approvazione. Nell'effettuare questo studio, abbiamo rispettato tutte le normative etiche necessarie.

1. Fabbricazione del dispositivo del test immunologico su carta

NOTA: Il dispositivo di dosaggio immunologico su carta è stato fabbricato seguendo i metodiprecedentemente stabiliti 36,37 e la richiesta di brevetto tailandese n. 19010081638.

  1. Progettazione e disegno del modello: Progettare il dispositivo analitico cartaceo (Figura 1A,B) con 18 modelli in cera PAD su un computer.
    NOTA: Il design è specifico e destinato alla carta in formato A5. Il numero di PAD è correlato alle dimensioni della carta, come richiesto dall'utente.
  2. Stampa il modello disegnato sulla carta di cellulosa utilizzando una stampante a cera (Tabella dei materiali).
  3. Sciogliere la carta cerata in forno da laboratorio per 75 secondi a 150 °C. Successivamente, conservarlo in una scatola di silice fino al momento del bisogno per i passaggi successivi.
  4. Applicare 0,5 μL di poli-L-lisina (PLL) allo 0,025% sia nell'area di prova che in quella di controllo. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 2 minuti in una scatola di silice e poi riscaldare in forno a 65 °C per 5 minuti.
  5. Applicare 0,5 μL di 1 μg μL-1 di anticorpo IgG anti-topo di capra sull'area di controllo e 0,5 μL di 1 μg μL-1 dell'anticorpo di cattura sull'area del test. Lasciare asciugare le gocce in una scatola di gel di silice a RT per 30 minuti.
  6. Applicare 2 μL del tampone di blocco sull'area del campione, 3 μL sull'area coniugata e 2 μL sull'area di rilevamento. Lasciare asciugare le gocce a RT in una scatola di gel di silice per 30 min.
  7. Applicare 2 μL di soluzione di complesso nanoparticella-anticorpo d'oro (AuNPs-Ab) sull'area coniugata e lasciare asciugare in una scatola di gel di silice a RT per 30 minuti.

2. Assemblaggio del test immunologico cartaceo

  1. Rimuovere con cautela la pellicola protettiva sul retro della carta di supporto in plastica adesiva per esporre l'adesivo.
  2. Allineare la carta di cellulosa trattata con il cartoncino di plastica adesiva e premere saldamente i due strati insieme.
    NOTA: Evitare di toccare il campo idrofilo per ridurre al minimo il rischio di contaminazione o danni al dispositivo.
  3. Applicare una pellicola di plastica per rivestire la carta e premerle insieme.
  4. Tagliare il pezzo di dispositivi desiderato usando le forbici da fogli di dispositivi completamente assemblati.
  5. I DEN-NS1-PAD (Figura 1C) sono ora pronti per l'uso. Per una stabilità a lungo termine, conservarli a 4 °C.

3. Preparazione del coniugato AuNPs-Ab

NOTA: L'AUNPS-Ab è stato preparato come descritto in precedenza da Prabowo et al.36.

  1. Combinare 10 μL di 1 mg di anticorpo anti-NS1 mL−1 in PBS, 1 mL di colloide AuNPs da 40 nm e 0,1 mL di tampone borato 0,1 M (pH 8,5).
  2. Ruotare la miscela a 50 rpm per 60 min e incubare a RT.
  3. Applicare 0,1 mL di 10 mg mL−1 BSA in BBS, ruotare a 50 rpm e incubare a RT per 15 min.
  4. Centrifugare la soluzione a 20.187 × g e 4 °C per 30 min.
  5. Pipettare con cura e separare il surnatante dalle AuNPs-Ab precipitate.
  6. Risospendere gli AuNPs-Ab in 500 μL di BBS e disperderli utilizzando la sonicazione.
  7. Ripetere la centrifugazione a 20.187 × g e 4 °C per 30 min.
    NOTA: Ripetere i processi di dispersione e centrifugazione 3 volte.
  8. Aggiungere 50 μL di tampone coniugato alla sospensione, rendendola pronta per l'applicazione sull'area coniugata.

4. Sviluppo di applicazioni mobili

  1. Sviluppo dell'elaborazione delle immagini e dell'apprendimento automatico
    1. Raccogli un set di dati per un modello di immagine supervisionato raccogliendo oltre 900 immagini con messa a fuoco automatica di DEN-NS1-PAD, catturando varie condizioni come diverse concentrazioni, marche di telecamere (12-13 megapixel), rotazioni (90° e 180°) e impostazioni di illuminazione. Punta a 30 immagini in ogni condizione specifica.
    2. Etichettare la verità di base identificando e annotando due regioni di interesse come aree di test e controllo all'interno delle immagini raccolte per l'apprendimento supervisionato.
    3. Progetta un algoritmo per identificare la striscia di sfondo. Individuare la linea centrale tra le regioni di test e di controllo, calcolarne il punto medio e stabilire una regione quadrata proporzionale alla dimensione media delle due regioni principali mantenendo lo stesso orientamento di rotazione.
    4. Creare un modello di segmentazione delle immagini utilizzando il set di dati e le etichette di verità di base dei passaggi 4.1.1 e 4.1.2 per eseguire il training di un modello di segmentazione delle immagini per identificare le aree di interesse.
  2. Algoritmo dell'applicazione
    1. Applicare il modello di segmentazione delle immagini sottoposto a training alle nuove immagini per individuare automaticamente le aree di test, controllo e sfondo.
    2. Utilizzare le tecniche di elaborazione delle immagini di base per ottenere un singolo valore di intensità per ciascuna delle tre aree di interesse (test, controllo e sfondo).
    3. Trasforma l'immagine in una rappresentazione di matrice 3D (canale y, x) per accedere ai valori dei pixel.
    4. Converti l'immagine in scala di grigi calcolando la media dei valori RGB e applica l'inversione con la formula (255-x).
    5. Normalizzare i valori dell'area di test e di controllo sottraendo il valore dell'area di sfondo.
    6. Utilizzare la curva di calibrazione prestabilita per calcolare la concentrazione di NS1.
    7. Classificare i risultati come positivi o negativi in base a un valore di cut-off di 0,1103 derivato dalle intensità normalizzate della scala di grigi37.

5. Curva di calibrazione e sensibilità

  1. Preparare il campione NS1 nel siero umano per la calibrazione con concentrazioni di 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0 μg mL-1.
  2. Far cadere 50 μL di ciascuna concentrazione sull'area del campione ed eseguire le misurazioni in triplice copia.
  3. Lasciare che i campioni si assorbano completamente nel dispositivo, operazione che potrebbe richiedere 20-30 minuti per ottenere i risultati.
  4. Cattura le immagini del dispositivo utilizzando una fotocamera digitale o uno smartphone dopo 5 minuti di incubazione.
  5. Analizza le aree di test e controllo utilizzando ImageJ e un'applicazione mobile personalizzata.
  6. Costruisci la curva di calibrazione in base ai dati di ImageJ e dell'applicazione mobile.
  7. Calcola il limite del bianco (LOB), il limite di rilevamento (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) utilizzando le equazioni (1-3) seguenti:
    LOB = Media dei dati bianchi + 1:645* ð (deviazione standard dei dati bianchi) (1)
    LOD = LOB +1:645*ð (deviazione standard dei dati di concentrazione più bassa) (2)
    LOQ = Media dei dati in bianco + 10*ð (deviazione standard dei dati in bianco) (3)

6. Esecuzione di un test immunologico cartaceo con campioni clinici

  1. Raccogliere e processare 300 μL di sangue periferico da 30 pazienti il primo giorno di ricovero in provette EDTA viola superiori, seguendo le buone pratiche cliniche.
  2. Centrifugare il sangue a 2.884 × g e 4 °C per 20 min.
  3. Trasferire il componente liquido (plasma) in una provetta di polipropilene pulita utilizzando una pipetta.
  4. Conservare immediatamente il plasma nel congelatore a −20 °C per l'analisi successiva.
  5. Applicare 20 μL di plasma sull'area del campione sulla parte superiore del dispositivo. Quindi, aggiungere 30 μL di tampone di lavaggio (0,05% v/v Tween 20 in soluzione salina tamponata con fosfato).
  6. Lasciare che il campione penetri completamente nel dispositivo, operazione che potrebbe richiedere 20-30 minuti per ottenere i risultati.
  7. Cattura le immagini del dispositivo utilizzando una fotocamera digitale o uno smartphone dopo 5 minuti di incubazione a temperatura ambiente.
  8. Analizza le aree di test e controllo utilizzando ImageJ e un'applicazione mobile personalizzata.

7. Quantificazione con applicazione mobile

NOTA: L'intensità del test immunologico cartaceo viene analizzata nell'applicazione mobile (Figura 2).

  1. Apri l'applicazione mobile sviluppata sullo smartphone.
  2. Seleziona Usa fotocamera o Carica dalla galleria per scegliere o caricare l'origine dati. Fallo tramite l'acquisizione della fotocamera o selezionando un'immagine dalla galleria del dispositivo.
  3. Passare alla sezione analitica e toccare il pulsante Analizza sullo schermo.
  4. Attendere che l'applicazione analizzi i dati e visualizzi i risultati.

Risultati

La scelta di un metodo di fabbricazione è fondamentale per garantire prestazioni di dosaggio riproducibili nei dispositivi di dosaggio immunologico su carta. Nel nostro studio, abbiamo esplorato vari processi di produzione e materiali nel contesto della dimostrazione di un test immunologico su carta. Il metodo scelto utilizza un sistema di stampa a cera per creare barriere idrofobiche all'interno di dispositivi microfluidici a base di carta. Questo approccio si distingue per la sua semplicità, velocità e risultati coerenti. Da notare, offre il vantaggio di evitare l'uso di sostanze chimiche fotoresist, che hanno il potenziale di interferire con l'adsorbimento delle proteine e aumentare l'idrofobicità della carta di cellulosa. Inoltre, la stampa a cera garantisce dimensioni costanti dei canali fluidici, contribuendo alla ripetibilità delle prestazioni del saggio.

A seguito della formazione di barriere idrofobiche, i reagenti necessari per il test immunologico sono stati applicati sulla superficie della carta di cellulosa. Con l'adsorbimento elettrostatico, il PLL ha aiutato nell'immobilizzazione delle biomolecole interagendo sia con la carica positiva dei gruppi funzionali amminici che con l'anticorpo caricato negativamente. Questa fase facilita la modifica e l'immobilizzazione degli anticorpi e l'applicazione di coniugati marca-anticorpo durante i processi di fabbricazione. È importante sottolineare che questo passaggio può essere eseguito in parallelo. L'assemblaggio dei dispositivi di immunodosaggio su carta (DEN-NS1-PAD, come mostrato nella Figura 1A) viene completato impilando la carta modificata su una carta di supporto in plastica adesiva e laminandola con una pellicola di plastica.

Lo scopo principale di questo studio è quello di sviluppare un metodo user-friendly che utilizza uno smartphone per misurare le concentrazioni di NS1. Questo approccio potrebbe essere utilizzato come dispositivo di test point-of-care (POCT) sia in ambito domiciliare che clinico. Data l'ampia gamma di concentrazioni di NS1 nel siero del paziente, sono stati impiegati semplici modelli lineari basati sui risultati di questi esperimenti. Per ogni concentrazione di NS1 è stato preparato un set di dati comprendente tre dispositivi di prova. Le foto dei dispositivi sono state scattate utilizzando uno smartphone con impostazioni standard e condizioni di illuminazione ottimali, eliminando la necessità di una scatola oscura. La zona di test dei PAD contiene l'anticorpo monoclonale NS1 della dengue di topo, mentre la zona di controllo presenta l'anticorpo IgG anti-topo di capra. Con un formato di saggio a sandwich, concentrazioni più elevate di NS1 nei campioni corrispondono a una maggiore intensità del colore rosso nella zona di prova. Al contrario, l'intensità del colore nella zona di controllo rimane relativamente costante. La Figura 1B mostra le immagini non elaborate degli smartphone, che forniscono un'osservazione visiva vantaggiosa senza richiedere attrezzature specializzate.

Utilizzando un'applicazione mobile dedicata, abbiamo normalizzato le intensità e calcolato semplici modelli lineari per le concentrazioni di NS1 nei campioni di siero: la correlazione dei coefficienti (r2) ottenuta dall'applicazione mobile. La correlazione del coefficiente (r2) ottenuta dall'applicazione mobile è stata pari a 0,92 (Figura 3), in linea con le aspettative. Questo approccio basato su smartphone ha superato l'osservazione a occhio nudo, migliorando significativamente la sensibilità del 178%. Inoltre, il limite di bianco (LoB), il limite di rilevazione (LoD) e il limite di quantificazione (LoQ) sono stati calcolati per le intensità normalizzate, come presentato nella Tabella 1.

Sono stati utilizzati campioni clinici del mondo reale per dimostrare la funzionalità pratica dei DEN-NS1-PAD in ambito clinico. Il test immunologico cartaceo ha prodotto letture qualitative del colore entro 20-30 minuti, consentendo la determinazione visiva di esiti negativi o positivi. Campioni di siero di pazienti sospettati di dengue sono stati sottoposti al dispositivo. La Figura 4 illustra e confronta i risultati ottenuti sia dal dispositivo che da un test diagnostico rapido (RDT) commerciale. La Tabella 2 riassume i risultati delle letture visive e del sistema basato su smartphone. L'RDT commerciale e il dispositivo hanno prodotto risultati simili, con sette esiti positivi e 23 negativi dalla lettura visiva. Al contrario, il sistema di lettura basato su smartphone applicato esclusivamente al dispositivo ha riportato nove esiti positivi e 21 negativi da campioni clinici.

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Figura 1: Immagini del DEN-NS1-PAD progettato e fabbricato. (A,B) Un singolo canale della barriera idrofobica con motivo a cera è progettato e raffigurato in tre stati (C) prima e (D,E) dopo aver introdotto la soluzione del campione nell'area designata e aver mostrato rispettivamente i risultati (D) negativi e (E) positivi. La soluzione del campione penetra attraverso il canale (vedere la freccia etichettata), interagendo con i componenti in posizioni chiave: AuNPs-Ab nell'area coniugata, anticorpo anti-NS1 nell'area del test (indicativo di un risultato positivo per la dengue NS1) e IgG anti-topo nell'area di controllo. I risultati sono facilmente osservabili ad occhio nudo e possono essere quantificati mediante l'elaborazione delle immagini utilizzando uno scanner piano o la fotocamera di uno smartphone. Abbreviazione: AuNPs-Ab = coniugato nanoparticelle d'oro-anticorpo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Screenshot dello schermo del telefono dall'app mobile. (A) Schermata utente dell'applicazione Android in esecuzione sul dispositivo cellulare, (B) visualizzazione della schermata dell'applicazione, (C) menu principale dell'applicazione che gli utenti possono selezionare per utilizzare la fotocamera o caricare l'immagine dalla galleria, (D) visualizzazione di un'immagine correlata per il test, (E) visualizzazione del conto alla rovescia da analizzare, (F) visualizzazione dei risultati del test, compresa l'intensità della zona di test e di controllo, la decisione di infezione (positiva/negativa) e la concentrazione di NS1 nel campione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Curva di calibrazione lineare per il rilevamento di NS1 nel siero. Il dispositivo è stato utilizzato e le immagini sono state interpretate elaborando tramite un'applicazione basata sui dati dello smartphone. Le barre di errore mostrano ±1 deviazione standard, n = 3. Abbreviazioni: T = area di prova; C = area di controllo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Immagine di DEN-NS1-PAD dal test del campione clinico. Il siero (50 μL) è stato utilizzato in un test immunologico su carta. (A) Esempio di risultato negativo, (B) risultati positivi, (C) risultati complessivi e confronto tra RDT e immunodosaggio cartaceo. Abbreviazioni: RDT = Test Diagnostico Rapido; Pos = positivo; Neg = negativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

ParametroAd occhio nudoApp per dispositivi mobili
Limite di vuoto (LoB)-43,15 ng mL-1
Limite di rilevamento (LoD)200 ng mL-1112.19 ng mL-1
Limite di quantificazione (LoQ)-373,58 ng mL-1

Tabella 1: LoB, LoD e LoQ da ImageJ e applicazione mobile sullo standard di calibrazione dei dati NS1 nel siero. Abbreviazioni: LoB = limite di bianco; LoD = limite di rilevamento; LoQ = limite di quantificazione.

Paziente n.Occhi nudiSmartphone AppImmagineJ
RDT (Traduzione automatica)Immunodosaggio cartaceo
1----
2----
3----
4----
5----
6----
7----
8----
9++++
10--++
11----
12++++
13----
14----
15----
16++++
17++++
18----
19----
20----
21++++
22++++
23----
24++++
25----
26----
27----
28----
29----
30--++

Tabella 2: Confronto tra i risultati della lettura visiva e del sistema di lettura basato su smartphone per i campioni di siero. (+) e (-) indicano rispettivamente interpretazioni positive e negative dei risultati.

Discussione

Uno dei parametri di progettazione importanti per un sistema di lettura basato su smartphone è la capacità di fornire un'elaborazione riproducibile delle immagini dei campioni. In questo studio, per semplicità e praticità, le immagini sono state catturate da tre diverse marche di smartphone con fotocamere da 12-13 MP senza l'utilizzo di una scatola di imaging o accessori. Le condizioni variabili di acquisizione dell'immagine, come la risoluzione della fotocamera, il tempo di acquisizione dell'immagine, le condizioni di illuminazione e l'ambiente, possono influenzare l'intensità del colore dei punti di test e di controllo sul dispositivo. L'impatto dei diversi tempi di acquisizione delle immagini sull'illuminazione e sull'asciugatura del PAD sulle intensità del segnale dei dispositivi è stato ridotto al minimo utilizzando le intensità del segnale normalizzate, che sono rimaste coerenti tra le immagini acquisite in vari momenti36. La sottrazione del segnale di fondo è emersa come strategia per migliorare l'accuratezza delle misurazioni dell'intensità del colore, mitigando efficacemente l'influenza delle condizioni di illuminazione. La nostra scoperta è in linea con ricerche precedenti che evidenziano l'efficacia delle tecniche di sottrazione di base o di fondo nel ridurre al minimo gli effetti ambientali39,40.

Il dibattito in corso sulla superiorità dell'utilizzo di una scatola di imaging o di un metodo senza accessori ha implicazioni per l'elaborazione delle immagini39,41. Una scatola di imaging può migliorare la robustezza dei risultati dell'elaborazione delle immagini riducendo al minimo le variazioni nelle condizioni di imaging 41,42,43. In questo studio, abbiamo utilizzato un'applicazione mobile basata sull'apprendimento automatico cloud per l'elaborazione delle immagini. Questo approccio sfrutta l'apprendimento automatico all'interno di una piattaforma basata su cloud per classificare, estrarre e arricchire automaticamente i dati delle immagini. L'applicazione ha identificato ed elaborato in modo efficace l'area di interesse all'interno delle immagini, comprendendo le zone di sfondo, di test e di controllo. Questo passaggio è stato fondamentale per differenziare queste zone38. Ricerche precedenti suggeriscono che l'elaborazione delle immagini che coinvolge l'apprendimento automatico produce una classificazione superiore tra i risultati per i campioni di controllo e di test 43,44,45. In questo studio, l'utilizzo della posizione fissa e della sottrazione di fondo ha generato un segnale di fondo coerente dai μPAD di cellulosa, migliorando la coerenza e l'accuratezza della classificazione delle letture fornite dall'applicazione mobile40,43.

Per quanto riguarda le prestazioni costanti nella dimostrazione di un test immunologico basato su carta, il metodo di fabbricazione gioca un ruolo importante. In un precedente studio36, sono state studiate diverse condizioni di ottimizzazione per il metodo di progettazione e fabbricazione di DEN-NS1-PAD, come le concentrazioni di PLL, sostanza bloccante e anticorpo NS1. Il dispositivo ha testato con successo NS1 in tampone, coltura cellulare e siero umano sia qualitativamente che quantitativamente.

Gli effetti della matrice derivanti dai componenti del siero possono interferire con il limite di rilevamento del dispositivo durante l'analisi dei campioni di siero. Tuttavia, i risultati indicano che il test immunologico sviluppato potrebbe rilevare con successo le concentrazioni di NS1 nei campioni di siero, producendo risultati paragonabili a quelli dell'RDT commerciale (Tabella 2). Sono stati osservati i risultati apparenti utilizzando l'ispezione visiva e l'applicazione mobile (Figura 4), sottolineando l'efficacia del test per l'analisi del siero. Sebbene la maggiore viscosità del siero possa influire sui tempi di analisi, non ostacola l'interpretazione dei risultati36. L'utilizzo di un'applicazione mobile può fornire risultati più positivi per i saggi dei campioni perché l'utilizzo di un'applicazione mobile migliora significativamente la sensibilità dei test dei campioni46. Vale la pena notare che sono necessari ulteriori confronti con test molecolari come RT-PCR 15,47,48 per la dengue NS1 per determinare potenziali risultati falsi positivi o falsi negativi.

Un notevole limite di questo studio sorge quando si considera una matrice di campioni più complessa come il sangue. I componenti presenti nel sangue potrebbero infatti interferire con il limite di rilevabilità del dispositivo. In questi casi, l'impiego di tamponi assorbenti aggiuntivi per migliorare l'assorbimento del tampone in esecuzione rappresenta una potenziale soluzione. Questa modifica può aiutare la coagulazione del sangue, sfruttando le proprietà emostittiche della cellulosa influenzando le piastrine del sangue49. Un altro approccio prevede l'applicazione di gocce saline al 4% (p/v) sul tampone del campione per migliorare la coagulazione del sangue. Ricerche precedenti hanno dimostrato che sali come il cloruro di calcio e il cloruro di sodio inducono la coagulazione dei globuli rossi (RBC)50,51. Na+ può destabilizzare la sospensione dei globuli rossi nel sangue sopprimendo il doppio strato elettrico sulla superficie dei globuli rossi e riducendo la repulsione di carica tra i globuli rossi. Inoltre, un'alta concentrazione di sale induce anche l'aggregazione del sangue52. Inoltre, la carica di valenza del controione del Na+ sopprime lo spessore del doppio strato carico dei globuli rossi, portando all'aggregazione dei globuli rossi sgonfi. L'aggiunta di soluzione salina al 4% (p/v) (NaCl) facilita la separazione del plasma su carta di cellulosa51. Tuttavia, è necessaria un'attenta ottimizzazione della concentrazione salina per evitare di indurre effetti indesiderati sull'aggregazione del sangue e sull'aggregazione di nanoparticelle d'oro53,54.

Le stampanti a cera commerciali fornivano una combinazione ideale di costo e semplicità di prototipazione. Poiché queste stampanti sono state interrotte nel 2016, sono stati necessari metodi di fabbricazione alternativi come la stampa a getto d'inchiostro55, la serigrafia56 e la fotolitografia57. Una stampante a toner per ufficio è un buon candidato per la fabbricazione di μPAD. La resina poliestere nel toner crea motivi idrofobici a 200 °C per 60 minuti con vari disegni58.

In questa ricerca è stato utilizzato l'anticorpo NS1 sierotipo due, come specificato dall'azienda. Tuttavia, abbiamo scoperto che questo anticorpo interagisce anche con tutti i sierotipi36,37. Le sensibilità per il rilevamento di DENV-4 sono inferiori (87,5%) rispetto ad altri sierotipi. La sensibilità di DENV-1 e DENV-2 è di circa l'88,89% e per DENV-3 è del 100%37. Questi risultati sono in linea con ricerche precedenti, che hanno anche riportato una minore sensibilità dell'RDT a DENV-4 rispetto ad altri sierotipi59. La sensibilità complessiva del dispositivo è ~88,89%, con una specificità di circa l'86,67%. È interessante notare che l'effettiva sensibilità di DEN-NS1-PAD può superare quella dell'RDT commerciale. Tuttavia, l'RDT dimostra un valore predittivo positivo (PPV) dell'84,62% e un'accuratezza dell'87,67%. In particolare, il DEN-NS1-PAD ha ottenuto risultati migliori nel rilevare l'infezione da dengue nei primi 5-6 giorni, mentre l'RDT è efficace solo nei primi 5 giorni37.

In sintesi, la combinazione di un test immunologico portatile su carta (DEN-NS1-PAD) con un'applicazione per smartphone è molto promettente per la misurazione della dengue NS1. L'applicazione mobile migliora significativamente la sensibilità e l'efficienza nella quantificazione di NS1 nei campioni di siero rispetto all'osservazione ad occhio nudo. I vantaggi dell'applicazione mobile includono tempi di analisi ridotti, facilità d'uso e compatibilità con diversi dispositivi smartphone, posizioni e condizioni di illuminazione. Tuttavia, sono necessari ulteriori miglioramenti per migliorare la sensibilità e le prestazioni. Nel frattempo, è necessaria una modifica del test immunologico cartaceo per migliorarne le prestazioni quando si tratta di campioni di sangue. Inoltre, sono necessarie valutazioni complete del DEN-NS1-PAD per rilevare la dengue utilizzando un numero più significativo di sierotipi di infezione primaria e campioni selezionati raccolti da vari pazienti (bambini e adulti).

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

M.H.P. ringrazia il fondo di ricerca per le borse di studio dell'Universitas Islam Indonesia (UII). Gli autori estendono la loro gratitudine a Mr. Nutchanon Ninyawee per la sua preziosa esperienza e assistenza durante lo sviluppo dell'applicazione mobile e per i suoi contributi al manoscritto. Inoltre, gli autori apprezzano il sostegno finanziario fornito da Thailand Science Research and Innovation (TSRI), Basic Research Fund: Fiscal year 2023 (progetto n. FRB660073/0164) nell'ambito del programma Smart Healthcare dell'Università di Tecnologia di Thonburi di King Mongkut.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiali
0,1 M soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,2) 
BBS contenente lo 0,1% di Tween 20, il 10% di saccarosio e l'1% di caseina   il trattamento dell'area coniugata e il tampone bloccante
Soluzione salina tamponata con borato di borato (BBS) (25 mM di borato di sodio e 150 mM di cloruro di sodio a pH 8,2) integrati con l'1% di BSA il tampone di lavaggio durante il processo di coniugazione AuNP con l'anticorpo
acido boricoMerck10043-35-3
Frazione di albumina sierica bovina V (BSA)   PAA Lab GmbH (Germania)K41-001 
CaseinaMerck9005-46-3
Carta per cromatografia Grado 2 GE Sanità3002-911 
Film laminato trasparente3M (Cartoleria)
Idrogeno fosfato disodicoMerck7558-79-4
Doppio nastro lateraleCartolerie
Anticorpo IgG anti-topo capra MyBiosource (USA)MBS435013
Nanoparticelle d'oro (40 nm)   Serve Science Co., Ltd. (Thailandia)
Anticorpo policlonale IgG umano   MerckAG711-M
Anticorpo monoclonale dengue NS1 di topo MyBiosource (USA)MBS834415
Anticorpo monoclonale NS1 per la dengue di topo Antigeni MyBiosource (USA)MBS834236
NS1 sierotipo 2MyBiosource (USA)MBS 568697
PBS 1X contenente lo 0,1% di Tween 20 è stato utilizzato comeeluizione
Cartoncino di supporto in plastica 10x30 cmPacific Biotech Co., Ltd. (Thailandia)
Poli-L-lisina (PLL)Sigma AldrichP4832
Cloruro di potassioMerck104936
Monofosfato di potassioMerck104877
Cloruro di sodioMerck7647-14-5
Tetraborato di sodioSigma Aldrich1303-96-4
SaccarosioMerck57-50-1
Tween 20 SigmaAldrich9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 lettore multimodaleBioTek
Telefoni cellulariHuawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
Scanner fotograficoEpson Perfection V30
FornoMemmert
Stampante a cera Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Object Detection documentazioneGoogle Cloud
ImageJNational Institute of Health, Bethesda, MD, USA
Software Inkscape 0.91
tampone di

Riferimenti

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