Articolo metodologico

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

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DOI:

10.3791/66132

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19 gennaio 2024

 ,  ,  , 
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research, Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un approccio per l'esecuzione dell'imaging del calcio in organoidi intestinali umani infettati da virus e offre un approccio all'analisi.

Abstract

La segnalazione del calcio è un regolatore integrale di quasi tutti i tessuti. All'interno dell'epitelio intestinale, il calcio è coinvolto nella regolazione dell'attività secretoria, nella dinamica dell'actina, nelle risposte infiammatorie, nella proliferazione delle cellule staminali e in molte altre funzioni cellulari non caratterizzate. Pertanto, la mappatura delle dinamiche di segnalazione del calcio all'interno dell'epitelio intestinale può fornire informazioni sui processi cellulari omeostatici e svelare risposte uniche a vari stimoli. Gli organoidi intestinali umani (HIO) sono un modello ad alto rendimento, derivato dall'uomo, per studiare l'epitelio intestinale e rappresentano quindi un sistema utile per studiare la dinamica del calcio. Questo documento descrive un protocollo per trasdurre stabilmente HIO con indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), eseguire microscopia a fluorescenza dal vivo e analizzare i dati di imaging per caratterizzare in modo significativo i segnali di calcio. Come esempio rappresentativo, gli HIO tridimensionali sono stati trasdotti con lentivirus per esprimere stabilmente GCaMP6s, un GECI citosolico basato su proteine fluorescenti verdi. Gli HIO ingegnerizzati sono stati poi dispersi in una sospensione a cellula singola e seminati come monostrati. Dopo la differenziazione, i monostrati HIO sono stati infettati con rotavirus e/o trattati con farmaci noti per stimolare una risposta al calcio. Un microscopio a epifluorescenza dotato di una camera di imaging dal vivo umidificata a temperatura controllata ha consentito l'imaging a lungo termine di monostrati infetti o trattati con farmaci. Dopo l'imaging, le immagini acquisite sono state analizzate utilizzando il software di analisi ImageJ, disponibile gratuitamente. Nel complesso, questo lavoro stabilisce una pipeline adattabile per la caratterizzazione della segnalazione cellulare negli HIO.

Introduzione

Il calcio è un secondo messaggero ampiamente conservato che svolge un ruolo fondamentale nella regolazione della fisiologia cellulare1. Data la sua forte carica, le piccole dimensioni e l'elevata solubilità in condizioni fisiologiche, il calcio è un manipolatore ideale della conformazione proteica. Ciò rende il calcio un potente mezzo per trasdurre i segnali elettrochimici in alterazioni enzimatiche, trascrizionali o post-trascrizionali. I rigidi gradienti di concentrazione di calcio attraverso il reticolo endoplasmatico (ER) e le membrane plasmatiche creano un'elevata forza motrice che consente rapidi cambiamenti nella concentrazione citosolica di calcio. Diversi meccanismi, tra cui sia il buffering che il trasporto attivo, mantengono strettamente questo gradiente. Sebbene sia necessaria per le normali funzioni cellulari, questa manutenzione è energeticamente costosa, il che la rende particolarmente suscettibile negli stati di stress 2.

In quanto tale, la disregolazione del calcio all'interno del citosol è un segnale quasi universale di molti tipi di stress cellulare. Disturbi metabolici, tossine, agenti patogeni, danni meccanici e perturbazioni genetiche possono interrompere la segnalazione del calcio. Indipendentemente dallo stimolo, a livello di cellula intera, aumenti sostenuti e incontrollati del calcio citosolico possono promuovere l'apoptosi e infine la necrosi 3,4. Alterazioni dei livelli citosolici di calcio di minore ampiezza o di maggiore frequenza, tuttavia, hanno effetti variabili2. Allo stesso modo, gli esiti delle fluttuazioni del calcio possono differire in base al microdominio spaziale in cui si verificano5. Il monitoraggio dei livelli di calcio può quindi offrire informazioni sui processi di segnalazione dinamica, ma ciò richiede un campionamento con una risoluzione temporale e spaziale relativamente elevata.

Gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) sono potenti strumenti per il campionamento continuo in sistemi di cellule vive6. Alcune delle GECI più utilizzate sono proteine fluorescenti reattive al calcio a base di GFP note come GCaMPs7. Il GCaMP canonico è una fusione di tre domini proteici distinti: una GFP permutata circolarmente (cpGFP), calmodulina e M136. Il dominio calmodulina subisce un cambiamento di conformazione al momento del legame con il calcio, permettendone l'interazione con M13. L'interazione calmodulina-M13 induce un cambiamento conformazionale nella cpGFP che aumenta la sua emissione fluorescente durante l'eccitazione. Pertanto, un aumento della concentrazione di calcio è correlato a un aumento dell'intensità della fluorescenza GCaMP. Questi sensori possono essere citosolici o mirati a specifici organelli8.

Simile alla maggior parte dei tessuti, il calcio regola una varietà di funzioni all'interno dell'epitelio gastrointestinale. L'epitelio intestinale è fondamentale per l'assorbimento dei nutrienti e dei liquidi, ma deve anche formare una barriera stretta e un'interfaccia immunitaria per evitare l'invasione di agenti patogeni o insulti tossici. Le vie calcio-dipendenti influenzano quasi tutte queste funzioni vitali 9,10,11. Tuttavia, la segnalazione del calcio all'interno dell'epitelio intestinale rimane una frontiera poco esplorata con un potenziale promettente come bersaglio terapeutico. Mentre il monitoraggio della dinamica del calcio all'interno dell'epitelio intestinale in vivo continua a presentare sfide, gli organoidi intestinali umani (HIO) offrono un sistema ex vivo adattabile per la sperimentazione12. Gli HIO sono sferoidi tridimensionali (3D) derivati da cellule staminali intestinali umane e, una volta differenziati, ricapitolano gran parte della diversità cellulare dell'epitelio intestinale nativo12.

Questo protocollo descrive metodi completi per ingegnerizzare HIO che esprimono GECI e quindi preparare HIO ingegnerizzati come monostrati per l'imaging del calcio su cellule vive. Offre l'infezione virale come esempio di manipolazione patologica che interrompe la segnalazione del calcio e fornisce un approccio analitico per quantificare questi cambiamenti.

Protocollo

Tutti gli organoidi intestinali umani (HIO) utilizzati in questo protocollo e negli esperimenti rappresentativi sono stati derivati da tessuto umano ottenuto e mantenuto dal Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core. Tutti i campioni sono stati raccolti in conformità con un protocollo approvato dall'Institutional Review Board del Baylor College of Medicine.

1. Preparazione dei materiali e dei reagenti

  1. Per il mantenimento degli organoidi, raccogliere piastre a 24 pozzetti trattate con colture cellulari, matrice di membrana basale (BMM), provette coniche da 15 mL e provette coniche da 1,5 mL.
    1. Per preparare terreni completi senza fattori di crescita (CMGF-), a 500 mL di DMEM F12 avanzato aggiungere 5 mL di 1M HEPES, 5 mL di 100x antibiotico-antimicotico, 5 mL di integratore di glutammina 100x.
    2. Per preparare terreni contenenti Wnt, R-spondina e Noggin (WRNE), mescolare parti uguali di terreni condizionati da CMGF e Wnt, aggiungere terreno condizionato da Noggin, 10% in volume, terreno condizionato da R-spondina, 20% in volume, 50 ng/mL di fattore di crescita epidermico umano, 10 mM di nicotinamide, 10 nM [Leu15]-Gastrina I, 500 nM A-83-01, 10 μM SB202190, 1x integratore di B27, 1x integratore di N2 e 1 mM di N-acetilcisteina.
  2. Per la trasduzione lentivirale, preparare Siero fetale bovino (FBS), 0,05% tripsina-EDTA in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), CMGF- con 10% FBS, 1x PBS sterile, Polybrene, 10 μM Y-27632, Lentivirus, High Wnt WRNE + 10 μM Y-27632
  3. Per la generazione di monostrati di organoidi, preparare un vetrino per coltura cellulare a 10 pozzetti con fondo in vetro, FBS, collagene IV (1 mg/mL in (di)H2O deionizzato), matrice di membrana basale, EDTA 0,5 mM in 1x PBS, 5 mM EDTA in 1x PBS, tampone di dissociazione enzimatica, CMGF- con FBS al 10%, WRNE + 10 μM Y-27632.
  4. Per l'infezione virale dei monostrati di organoidi, preparare tripsina, rotavirus, CMGF-, ago 25G, PBS sterile 1x e terreni di differenziazione privi di rosso fenolo.
    1. Per preparare i terreni di differenziazione privi di rosso fenolo, prelevare 500 mL di terreno di coltura cellulare privo di rosso fenolo, aggiungere 5 mL di amminoacidi non essenziali MEM 100x, 5 mL di L-glutammina 100x, 5 mL di piruvato di sodio 100 nM e 7,5 mL di HEPES 1M.
  5. Per la colorazione in immunofluorescenza degli organoidi, preparare il 4% di formaldeide (16% di formaldeide diluita in 1x PBS), Triton X-100 (0,1% Triton X-100 in 1x PBS), albumina sierica bovina (3% di albumina sierica bovina in 1x PBS), NH4Cl soluzione (50 mM), DAPI (1 μg/mL di soluzione DAPI in 1x PBS).

2. Ingegnerizzazione di organoidi per esprimere sensori di calcio geneticamente codificati

NOTA: Questo protocollo descrive i passaggi per trasdurre un singolo pozzetto di organoidi intestinali umani tridimensionali placcati in 30 μL di matrice di membrana basale (BMM) su una piastra a 24 pozzetti13. La maggior parte delle linee conterrà circa 400.000 cellule per pozzetto. Un secondo pozzetto, non trasdotto, deve essere incluso come controllo. Conservare tutti i reagenti e le sospensioni cellulari in ghiaccio.

  1. Dopo 2-5 giorni dall'ultimo passaggio, rimuovere il terreno WRNE di mantenimento da due pozzetti di HIO. Sostituire con 300 μL di tripsina-EDTA allo 0,05% per pozzetto e pipettare delicatamente su e giù 5 volte per staccare il BMM dalla piastra. Mettere in incubatrice a 37 °C per 4 min.
  2. Aggiungere 500 μL di CMGF- + 10% FBS per pozzetto. Pre-rivestire un puntale per pipette a basso legame da 1 mL con FBS pipettando 1 mL di FBS su e giù 2 volte. FBS può essere riutilizzato su più puntali. Con il puntale preverniciato, pipettare gli HIO su e giù 10 volte.
  3. Trasferire il contenuto di ciascun pozzetto nella propria provetta per microcentrifuga prerivestita da 1,5 mL. Sciacquare ogni pozzetto con altri 500 μL di CMGF- e aggiungere il lavaggio alla rispettiva provetta.
  4. Centrifugare le provette a 100 x g in una centrifuga a secchiello oscillante per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e l'eventuale BMM residuo.
  5. Risospendere in 1 ml di 1x PBS. Dividere ogni provetta in due provette per microcentrifuga per un totale di 4 provette. Centrifugare le provette a 100 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante.
  6. Risospendere ogni provetta un'altra volta in 1x PBS e centrifugare a 100 x g per 5 minuti a 4 °C.
  7. Preparare 400 μL di mezzo di trasduzione e mezzo di controllo (Tabella 1). Risospendere 2 provette in 200 μL del mezzo di controllo e 2 provette in 200 μL del mezzo di trasduzione.
  8. Incubare in un incubatore per colture cellulari a 37 °C per 24 ore. Risospendere pipettando periodicamente verso l'alto e verso il basso con un puntale rivestito (ad es. 2 ore dopo la trasduzione (HPT), 12 HPT, 18 HPT) per favorire una trasduzione uniforme.
  9. Dopo 24 ore, centrifugare le provette a 100 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante.
  10. Risospendere il pellet in 500 μL di 1x PBS per lavare. Centrifugare a 100 x g per 5 min a 4 °C. Rimuovere il surnatante.
  11. Utilizzando un puntale per pipette ghiacciato da 200 μL, risospendere ciascuno dei 4 pellet in 30 μL di BMM. Pipettare delicatamente verso l'alto e verso il basso per disperdersi in modo uniforme.
  12. Placcare il contenuto di ciascuna provetta nel proprio pozzetto su una piastra da 24 pozzetti. Incubare per 10 minuti a 37 °C per consentire al BMM di solidificarsi prima di aggiungere 500 μL di HighWnt WRNE + 10μM Y-27632.
  13. Lasciare crescere gli HIO trasdotti per 1 settimana, aggiornando il terreno (HighWnt WRNE + 10 μM Y-27632) a giorni alterni. Dopo 1 settimana, verificare l'espressione dell'indicatore fluorescente al microscopio. Se il segnale è forte, iniziare la selezione del farmaco. Se il segnale è debole, ripetere la trasduzione come descritto sopra.
  14. Una volta stabilita la linea, verificare la funzione dell'indicatore di fluorescenza tramite trattamento agonista. L'ADP da 100 nM è un agonista affidabile per la convalida GCaMP. Testare gli organoidi 3D per la convalida iniziale come descritto di seguito.
    1. Dopo un passaggio, placcare un pozzetto (o più di uno) di organoidi in BMM su una piastra inferiore di imaging separata. Placcare gli organoidi a circa 1/3 della densità normale per evitare sovrapposizioni eccessive durante l'imaging. Non continuare a passare questi HIO dopo il trattamento con agonisti, poiché è difficile garantire la sterilità.
    2. Attendere 2-3 giorni affinché gli HIO si riprendano dopo il passaggio. Prima dell'imaging, passare al terreno di differenziazione privo di rosso fenolo.
    3. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, impostare una corsa di 3 minuti con immagini acquisite ogni 5 s utilizzando un'eccitazione a 488 nm e un set di filtri FITC/GFP. Dopo 30 secondi di imaging, aggiungere 100 nM ADP o controllo del veicolo. Continuare l'imaging fino a quando il segnale non ritorna vicino alla linea di base, ~2 min. Un aumento transitorio, ~2 volte, della fluorescenza GCaMP con il trattamento ADP indica il successo della trasduzione e della funzione del biosensore. Per una stima più precisa dell'efficienza di trasduzione, ripetere il test dell'agonista con l'imaging utilizzando monostrati generati tramite il processo descritto nella parte 3.

3. Preparazione di monostrati HIO per l'imaging in fluorescenza dal vivo

  1. Rivestire tutti i pozzetti di un vetrino a 10 pozzetti della camera inferiore con Collagen IV. Per fare ciò, mescolare 34 μL di 1 mg/mL di collagene EV con 960 μL di acqua deionizzata sterile. Aggiungere 95 μL di soluzione di collagene IV diluito in ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 0,5-2 ore.
  2. Rimuovere il fluido di manutenzione WRNE da 4 pozzetti di HIO 3D. Gli HIO dovrebbero essere 5-7 giorni dall'ultimo passaggio.
    NOTA: 1 piastra da 10 pozzetti richiede in genere ~1,25 x 106 celle. Ciò richiede in genere 2-4 pozzetti di HIO 3D placcati in 30 μL di BMM ciascuno, ma varierà in base alla densità.
  3. Aggiungere 500 μL di 1x PBS + 0,5 mM di EDTA per pozzetto. Con un puntale prerivestito da 1 mL, pipettare delicatamente verso l'alto e verso il basso per staccare il BMM dalla piastra. Trasferire la sospensione in una provetta conica da 15 mL prerivestita, combinando pozzetti simili nella stessa provetta.
  4. Risciacquare ogni pozzetto con altri 500 μL di PBS + 0,5 mM di EDTA. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e il BMM residuo.
  5. Utilizzando una punta preverniciata, risospendere il pellet rimanente in 3 mL di PBS + 5 mM di EDTA (si noti che si tratta di 10 volte più EDTA rispetto al primo lavaggio).
  6. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e il BMM residuo. Risospendere il pellet in 2 mL di tampone di dissociazione enzimatica.
  7. Incubare a bagnomaria a 37 °C per 5 min. Aggiungere 3 mL di CMGF- + 10% FBS e pipettare delicatamente per mescolare.
  8. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante. Aggiungere 1 mL di CMGF-.
  9. Pipettare vigorosamente su e giù con un puntale prerivestito 80x-100x per rompere meccanicamente gli HIO in singole cellule. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante.
  10. Risospendere in 1 mL di WRNE + 10 μM Y-27632. Ottenere un conteggio delle cellule per la sospensione da 1 mL.
  11. Diluire la sospensione cellulare con WRNE + 10μM Y-27632 per ottenere una concentrazione di 1,25 x 105 cellule/100 μL (1,25 x 106 cellule/mL).
  12. Utilizzando una pipetta da 200 μL, rimuovere la soluzione di collagene dalla piastra preparata nella fase 1, poiché il collagene si è ora depositato sul fondo del pozzetto. Evitare di toccare il fondo del pozzetto con il puntale della pipetta.
  13. Utilizzando un puntale per pipetta prerivestito da 200 μL, aggiungere 100 μL della soluzione cellulare del passaggio 3.11 (1,25 x 105 celle) per pozzetto.
  14. Incubare per 24 ore in un incubatore per colture cellulari a 37 °C. Dopo 24 ore, rimuovere il terreno di coltura da tutti i pozzetti e sostituirlo con 100 μL di terreno di differenziazione per pozzetto.
    NOTA: A questo punto, le celle dovrebbero aderire alla piastra. Si noti che il monostrato probabilmente non sarà confluente o completamente planare.
  15. Riposizionare il vetrino nell'incubatore per colture cellulari a 37 °C. Rinfrescare il mezzo di differenziazione ogni 24 ore fino a quando il monostrato è confluente. Questo di solito richiede 3-5 giorni dalla placcatura. A questo punto, i monostrati sono pronti per le applicazioni a valle.

4. Infezione virale dei monostrati HIO

  1. Preparare l'inoculo virale. Se necessario, la tripsina attiva il ceppo virale. Per il rotavirus, aggiungere 10 μg/mL di tripsina di Worthington alle scorte di virus e incubare a 37 °C per 1 ora.
    1. Diluire il virus attivo utilizzando uno dei due metodi seguenti.
      1. Se si punta al numero massimo di cellule infette utilizzando un solo ceppo virale, miscelare 50 μL di stock virale attivato con 50 μL di CMGF-.
      2. Se si confrontano più ceppi, preparare gli inoculi per ottenere una molteplicità equivalente di infezione (MOI). Utilizzare la seguente formula per determinare il volume delle scorte di virus per pozzetto necessarie per il MOI desiderato. Aggiungere CMGF- al volume di scorte virali calcolato per ottenere un volume finale di 100 μL per pozzetto.
        figure-protocol-1
        NOTA: Un singolo monostrato HIO placcato in un pozzetto con un diametro di 5,46 mm (piastra a 96 pozzetti) contiene circa 200.000 cellule. A causa della scarsa efficienza dell'infezione nei monostrati, è preferibile un MOI elevato (100-1 milione di particelle virali per cellula). Il MOI ottimale deve essere determinato empiricamente.
    2. Infettare i monostrati rimuovendo delicatamente il terreno dal monostrato HIO utilizzando una pipetta da 200 mL. Sostituire con 100 ml di inoculo virale o inoculo simulato.
      1. Poiché la maggior parte dei ceppi di rotavirus si propaga nelle cellule MA104, utilizzare un lisato di cellule MA104 non infetto per l'inoculo simulato. Utilizzare un volume equivalente al volume di scorte virali utilizzato per i pozzetti infetti e aggiungere CMGF- per un volume finale di 100 mL per pozzetto.
      2. Per i virus che infettano le cellule basolateralmente, come il rotavirus14, utilizzare un ago da 25G per incidere il monostrato. È più facile fare un singolo segno su tutta la lunghezza del monostrato, dal basso verso l'alto del pozzo. Premere delicatamente l'ago nel monostrato ad angolo con il lato smussato rivolto verso l'alto, opposto alla direzione del movimento, e trascinarlo per tutta la lunghezza del monostrato per creare una cicatrice (Figura 2A).
    3. Incubare in incubatrice a 37 °C per 2 ore. Rimuovere il virus e simulare l'inoculo. Lavare i monostrati una volta con 1x PBS.
    4. Aggiungere 100 μL di terreno di differenziazione privo di rosso fenolo. Posizionare il vetrino in un incubatore a 37 °C fino al momento di ottenere l'immagine. La finestra di imaging ottimale varia in base alla cinetica dell'infezione virale. Per il rotavirus, iniziare l'imaging a 6-8 ore dopo l'infezione.

5. Imaging Ca2+ di monostrati infetti

  1. Preriscaldare l'incubatrice a 37 °C. Funzionamento con CO2 umidificato a 0,02 L/min. Posizionare il vetrino con i monostrati infetti nella camera dell'incubatrice e sigillare il coperchio.
  2. Utilizzando l'illuminazione in campo chiaro (BF) e un obiettivo 20x, selezionare le coordinate X e Y dei campi visivi all'interno del monostrato che verrà ripreso. È meglio selezionare i punti con la regione segnata in vista, poiché la maggior parte delle cellule infette sarà vicina al graffio.
  3. Ottimizza i parametri di imaging e acquisisci un'immagine utilizzando l'eccitazione a 488 nm. Per ridurre al minimo la fototossicità, impostare la sorgente luminosa al 50% di potenza con un tempo di esposizione di 50 ms. I parametri di acquisizione appropriati possono variare e devono essere ottimizzati acquisendo più acquisizioni. Assicurati che nessun pixel sia saturo. Regolare il tempo di esposizione e la potenza della luce in base alle esigenze per garantire che l'intera gamma dinamica del sensore di calcio fluorescente possa essere rilevata.
  4. Se si utilizzano altri fluorofori (ad esempio, virus marcati con fluorescenza), ripetere l'ottimizzazione su questi canali. Impostare il loop di imaging e acquisire un'immagine a 488 nm ad ogni coordinata X, Y selezionata in un loop di 1 minuto. Immagina questo ciclo continuamente. Quando si utilizza un virus marcato con fluorescenza, acquisire un'immagine sul canale appropriato ogni 10loop (ad esempio, 1 immagine/10 min).
  5. Raccogli immagini per ~18 h. Se si utilizzano virus senza tag fluorescenti, fissare i monostrati ed eseguire la colorazione in immunofluorescenza per identificare le cellule infette. Eseguire questa operazione dopo aver completato l'esecuzione dell'imaging come descritto di seguito.
    1. Rimuovere i supporti di imaging e sostituirli con 100 μL di formaldeide al 4% in PBS 1x. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
    2. Rimuovere il fissativo e temprare con 100 μL di 50mM NH4Cl per 10 min. Rimuovere NH4Cl. Permeabilizzare i monostrati con 100 μL di Triton X-100 allo 0,1% in 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C.
    3. Rimuovere il tampone di permeabilizzazione. Bloccare con 100 μL di albumina sierica bovina al 3% in 1x PBS per 1 ora.
    4. Rimuovere la soluzione bloccante. Aggiungere gli anticorpi primari diluiti alla concentrazione raccomandata/ottimizzata in 1x PBS. Aggiungere 100 μL di soluzione anticorpale per pozzetto.
    5. Incubare per una notte a 4 °C con un leggero dondolio. Rimuovere gli anticorpi primari. Lavare 3 volte con 1 PBS.
    6. Aggiungere anticorpi secondari coniugati con fluorescenza diluiti alla concentrazione raccomandata/ottimizzata in 1x PBS. Aggiungere 100 μL per pozzetto. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
      NOTA: FPBase15 è un'ottima risorsa per aiutare a selezionare i database secondari che eviteranno il bleed-through durante il multiplexing. La maggior parte dei secondari è efficace con una diluizione 1:1000 in PBS 1x.
    7. Rimuovere gli anticorpi secondari. Preparare una soluzione DAPI da 1 μg/mL in 1x PBS e aggiungere 100 μL per pozzetto. Incubare per 20 min. Rimuovere DAPI. Lavare 3 volte con 1 PBS.
    8. Mantenere i monostrati fissi in 100 μL di PBS 1x per l'imaging. Riposizionare il vetrino sul tavolino del microscopio, ricaricare le coordinate X e Y dall'esecuzione dell'imaging dal vivo e visualizzare l'immagine di ciascun punto multiplo sul canale che corrisponde all'anticorpo secondario utilizzato per la colorazione. Fare riferimento alle immagini dell'esecuzione di immagini dal vivo per assicurarsi che vengano acquisiti gli stessi punti.

6. Quantificazione delle onde intercellulari di calcio

  1. Assicurati che Fiji is Just ImageJ (FIJI) sia installato con i seguenti plug-in: Bio-Formats (dovrebbe essere preinstallato in FIJI ma non sarà in ImageJ); Ricettario: per eseguire l'installazione, dal menu FIJI, vai a Guida > aggiornamenti > Gestisci siti di aggiornamento. Dai un'occhiata al ricettario. Riavvia le Figi.
  2. Suddividere il file di dati dall'esecuzione dell'imaging dal vivo in più file, separando ciascuna coordinata X, Y. In Nikon NES Elements, selezionare File > Importa/Esporta > Dividi punti multipli. Selezionare una cartella per l'esportazione e un prefisso appropriato.
  3. Aprire le FIJI. Caricare un singolo file dai punti multipli divisi. Se si utilizza un'immagine multicanale, dividere i canali. Selezionare la finestra con le immagini del canale a 488 nm (GCaMP).
  4. Eseguire la funzione DeltaF Up per determinare la variazione del valore di ciascun pixel da un punto temporale all'altro. A tale scopo, selezionare Ricettario > funzioni T > Delta F Up.
  5. Scorri la pila fino a trovare un'immagine con un'onda di calcio. Con l'onda di calcio in vista, impostare una soglia facendo clic su Immagine > Regola > soglia. Regolare il limite inferiore per ridurre al minimo la quantità di segnale che non fa parte dell'onda che supera la soglia. Per le immagini a 16 bit acquisite utilizzando i parametri sopra descritti, iniziare con una soglia inferiore di 600 e regolare in base alle esigenze.
  6. Eseguire l'analizzatore di particelle per segmentare le onde facendo clic su Analizza > Analizza particelle. Impostare la dimensione minima dell'onda in μm2 regolando l'intervallo. È impostato su 0-infinito al valore di base. Per le immagini di cellule MA104 acquisite utilizzando un obiettivo 20x, iniziare aumentando il limite inferiore a 10.000 μm2 e regolare in base alle esigenze.
  7. Selezionare le caselle Visualizza risultati e Cancella risultati. Dal menu a discesa "Mostra", seleziona Contorni, quindi fai clic su OK. Ciò dovrebbe comportare 2 output: Una finestra, Risultati, elencherà ogni onda rilevata, l'area dell'onda e i suoi valori di intensità media, minima e massima (in base al delta F). L'altra finestra, intitolata Disegno di [nome file], includerà una nuova pila con i contorni delle onde segmentate. Utilizzare questa opzione per verificare il rilevamento delle onde. Regolare i valori di soglia e l'intervallo di dimensioni, se necessario, e ricontrollare le chiamate ondata.
  8. Per l'elaborazione batch, utilizzare lo script macro incluso (file di codifica supplementare 1). Per utilizzarlo, segui i passaggi descritti di seguito.
    1. Suddividere i punti multipli in file singoli come descritto nel passaggio 6.2. Aprire le FIJI. Selezionare Elabora > Batch > Macro. Nella casella "input", fornisci la mappa alla cartella contenente i file multipoint divisi. Lasciare vuota la casella "output".
    2. Incollare lo script dal file di codifica supplementare 1 nella casella. Regolare la soglia di intensità e la soglia di dimensione nello script in modo che riflettano i parametri ottimizzati dei passaggi 6.5 e 6.6.
    3. Fare clic su Elabora. A seconda del numero di punti multipli e della velocità di elaborazione del computer, l'elaborazione di tutte le immagini può richiedere 30 minuti o più. Una volta completati, i dati verranno scritti in un nuovo foglio di calcolo denominato "Rinominami dopo la scrittura" sul desktop. Il file di output deve contenere, per ogni multipunto, un conteggio delle onde e le metriche delle onde (area, intensità media, intensità minima e massima e densità di intensità).

Risultati

La Figura 1A mostra una cupola BMM contenente organoidi intestinali umani tridimensionali che sono stati trasdotti per esprimere stabilmente GCaMP6. La Figura 1B mostra la stessa linea di organoidi riplaccati come monostrato a 24, 48 e 72 ore dopo la semina. Per convalidare la funzione di GCaMP6s, il monostrato è stato sottoposto a imaging mediante microscopia a fluorescenza ogni 2 secondi per 4 minuti e 100 nM di ADP sono stati aggiunti al terreno dopo ~ 20 secondi. L'ADP provoca il rilascio di calcio dal reticolo endoplasmatico, aumentando il calcio citosolico. L'intensità di fluorescenza rilevata sul canale a 488 nm ad ogni esposizione è tracciata nella Figura 1C. La traccia mostra un'intensità di fluorescenza basale costante seguita da un rapido aumento dopo l'aggiunta di ADP e un graduale ritorno verso il basale. È incluso un controllo del veicolo per verificare che la risposta sia un vero evento di segnalazione e non semplicemente un cambiamento nell'intensità della fluorescenza che può derivare dall'aggiunta di media.

Il punteggio di un monostrato HIO aumenta l'efficienza dell'infezione da rotavirus. Sebbene le tecniche per il punteggio varino, è più facile ottenere un'infezione coerente utilizzando un singolo punteggio lungo la lunghezza del monostrato, come mostrato nella Figura 2A. Quando si utilizzano ceppi ricombinanti di rotavirus che esprimono proteine fluorescenti, l'infezione può essere verificata durante l'imaging dal vivo (Figura 2B). Quando si utilizza un ceppo che non esprime un marcatore, l'infezione può essere rilevata mediante immunofluorescenza dopo l'imaging. Data la motilità delle cellule nei monostrati HIO, è spesso difficile tracciare una singola cellula infetta nel tempo. Utilizzare invece la colorazione dell'endpoint come metodo per verificare l'infezione e confermare che la molteplicità dell'infezione corrisponda tra i campi visivi (Figura 2C).

Le onde intercellulari di calcio negli HIO possono essere osservate qualitativamente, come illustrato nella Figura 3A. Tuttavia, la determinazione della frequenza delle onde di calcio in un determinato campo visivo richiede un'analisi quantitativa. I passaggi per una segmentazione di successo, come descritto nel passaggio 6 del protocollo precedente, sono illustrati nella Figura 3A. La figura mostra l'immagine grezza (Figura 3Ai), l'immagine dopo che le intensità dei pixel del fotogramma precedente sono state sottratte (Figura 3Aii), quindi l'onda di calcio segmentata (Figura 3Aiii).

Una volta che le onde di calcio sono state segmentate e quantificate per ciascun campo visivo nel corso dell'esecuzione dell'imaging, è spesso utile confrontare la frequenza delle onde in monostrati esposti a varie condizioni. Il grafico a strisce nella Figura 3B mostra il numero totale di onde di calcio per campo visivo in monostrati finti e inoculati con rotavirus. Questo esempio include due ceppi di RV: un ceppo di rotavirus umano (Ito HRV) e un ceppo ricombinante di rotavirus delle scimmie SA11 che esprime mRuby (SA11-mRuby). Il controllo finto-infetto è preso come frequenza basale dell'onda di calcio, i monostrati infetti da rotavirus non trattati fungono da controlli positivi e i monostrati infettati da rotavirus e trattati sono le condizioni sperimentali. I monostrati con infezione simulata e con infezione da RV trattati con farmaci, incluso l'inibitore del recettore ADP, BPTU, possono quindi essere confrontati con entrambe le condizioni di controllo mediante ANOVA unidirezionale. I dati suggeriscono che la BPTU diminuisce efficacemente la frequenza delle onde intercellulari di calcio.

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Figura 1: Validazione dell'espressione di GCaMP6s in organoidi intestinali umani digiunali. (A) Dopo la trasduzione dei lentivirus, gli HIO che esprimono GCaMP sono stati sottoposti a selezione e passaggi multipli, mostrati qui a 7 giorni dal passaggio più recente. Dopo la stimolazione con il laser a 488 nm, l'espressione di GCaMP6s è evidente negli HIO trasdotti placcati in una matrice di membrana basale da 15 μL come sferoidi tridimensionali (Ai). Esposizioni di 50 ms sono state acquisite al 50% della potenza laser utilizzando un obiettivo 20x, quindi unite insieme per visualizzare l'intera cupola della matrice della membrana del basamento. Un processo simile è stato eseguito utilizzando esposizioni in campo chiaro (Aii) di 4 ms. Nell'immagine in campo chiaro, gli HIO scuri al centro della cupola sono un'indicazione che le culture sono pronte per il passaggio. (B) Gli HIO sono stati digeriti enzimaticamente in una sospensione a singola cellula, quindi riplaccati a una densità di 150.000 cellule per pozzetto (5 mm di diametro) di una piastra inferiore di imaging pre-rivestita con collagene IV. Entro 72 ore dalla semina, il monostrato era confluente e pronto per le applicazioni a valle. Per convalidare la funzione di GCaMP, le immagini sono state acquisite utilizzando il set di filtri da 488 nm con esposizioni di 50 ms al 50% della potenza laser ogni 2 s per 4 min. (C) Le tracce mostrate qui rappresentano l'intensità di fluorescenza dell'intero campo normalizzata alla prima acquisizione nel corso dell'imaging. A circa 20 s (freccia), dopo la decima esposizione, è stata aggiunta 100 nM di adenosina difosfato (ADP) per suscitare un picco di calcio citosolico (rosso). L'aggiunta di un volume uguale di 1x PBS non ha suscitato una risposta significativa (blu). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Punteggio di un monostrato HIO per facilitare l'infezione del ventricolo destro. (A) La figura illustra una tecnica adatta per segnare un monostrato utilizzando un ago da 25G. (B) Un monostrato HIO è stato infettato con un ceppo ricombinante di RV che esprime la proteina fluorescente mRuby (magenta, freccia), consentendo l'identificazione delle cellule infette. In alternativa, quando si utilizza un ceppo naturale di RV, le cellule infette possono essere identificate utilizzando l'immunofluorescenza. (C) Le immagini mostrate provengono da 4 diversi monostrati HIO dopo la fissazione, la colorazione DAPI (blu) e la marcatura anticorpale dell'antigene del rotavirus (magenta). Entrambe le tecniche illustrano l'infezione preferenziale da ventricolo destro in prossimità della porzione segnata del monostrato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Segmentazione e quantificazione delle onde di calcio intercellulari indotte da RV. Le esposizioni a 488 nm di HIO infetti da RV che esprimono GCaMP6 sono state acquisite ogni 1 minuto per 16 ore utilizzando il protocollo. (A) La figura illustra il processo di segmentazione delle onde intercellulari del calcio. Innanzitutto, i valori dei pixel dell'acquisizione precedente (t-1) vengono sottratti da ciascuna immagine grezza (Ai) per quantificare la variazione dell'intensità della fluorescenza (Aii). Viene quindi applicata una soglia basata su un aumento minimo di intensità ottimizzato sperimentalmente rispetto al fotogramma precedente. Le immagini vengono quindi filtrate per un'area minima del segnale contigua per selezionare le onde di calcio intercellulari (Aiii) ed escludere i segnali di calcio a singola cellula. Questa elaborazione consente di quantificare le onde di calcio in ogni campo visivo. In questo esperimento, i monostrati sono stati infettati simulatamente, infettati con il ceppo ITO di rotavirus umano (HRV) o infettati con un ceppo ricombinante di rotavirus delle scimmie che codifica per mRuby sul segmento genico 7, a valle della proteina non strutturale 3 (SA11-mRuby). I monostrati infetti sono stati trattati con l'inibitore del recettore ADP BPTU o non trattati. I monostrati sono stati quindi ripresi in 8 diverse posizioni e le onde di calcio in ciascun campo visivo sono state quantificate utilizzando la pipeline descritta in questo protocollo. I punti sul grafico a strisce indicano il numero di onde di calcio rilevate in ogni posizione sovrapposte a un grafico a barre che segna la media e la SD. L'ANOVA unidirezionale seguita dai test di Dunnett mostrano che mentre entrambi i ceppi di RV aumentano la frequenza delle onde intercellulari di calcio al di sopra di quella del gruppo non infetto, il trattamento BPTU previene l'aumento mediato da RV della frequenza delle onde di calcio. **P<0.01, ***P<0.001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

ReagenteTrasduzioneControllo
Y-27632 (stock da 1 mM)4 μL4 μL
Polybrene (1 mg/μL di brodo)2 μL2 μL
Lentivirusvariabile*
HighWnt-WRNE *vedi notefino a 400 μLfino a 400 μL

Tabella 1: Terreno di trasduzione dei lentivirus. Preparare il terreno di trasduzione e il terreno di controllo combinando i reagenti nei volumi indicati rispettivamente nella seconda e nella terza colonna. Puntare a una molteplicità di infezione (MOI) di 10 unità di trasduzione di lentivirus per cellula. Per il ventricolo sinistro confezionato internamente, di solito sono necessari ~25-50 μL di LV concentrato. Il titolo della maggior parte dei LV confezionati in commercio sarà fornito con il certificato di analisi.

File di codifica supplementare 1: Script macro ImageJ per consentire la quantificazione delle onde di calcio mediante elaborazione batch. Fare clic qui per scaricare il file.

Discussione

Le alterazioni dei livelli citosolici di Ca2+ possono essere sia causa che effetto di patologie all'interno dell'epitelio 10,16,17. L'aumento del calcio citosolico può guidare direttamente la secrezione attraverso l'attivazione del canale del cloro calcio-dipendente TMEM16A18,19. L'attivazione di TMEM16A in risposta a Ca2+ consente l'efflusso apicale del cloruro, stabilendo un gradiente osmotico che favorisce la secrezione di liquidi20,21. Inoltre, l'aumento di Ca2+ all'interno delle cellule enteroendocrine innesca il rilascio di serotonina, che stimola i neuroni sensoriali afferenti in grado di modulare l'attività all'interno del sistema nervoso enterico22. I segnali di Ca2+ possono anche modulare le giunzioni strette per influenzare la funzione di barriera23,24 e regolare la proliferazione nelle cellule staminali intestinali25. Pertanto, la disregolazione di Ca2+ può avere effetti ampi e di vasta portata.

Molti virus manipolano il Ca2+ citosolico per creare un ambiente cellulare favorevole alla replicazione26. Il rotavirus ne è un ottimo esempio all'interno dell'epitelio intestinale27. La proteina non strutturale 4 del rotavirus (NSP4) è un canale conduttore di Ca2+ che consente l'efflusso di Ca2+ dal reticolo endoplasmatico nel citosol28,29. Questo stimola l'autofagia e aiuta l'assemblaggio del capside esterno 30,31,32. L'infezione da rotavirus induce anche il rilascio di ADP, innescando ondate intercellulari di Ca2+ che contribuiscono alla patogenesi17. Altri virus enterici, tra cui sia i calicivirus che gli enterovirus, codificano viroporine conduttrici di Ca2+ che innescano una simile disregolazione di Ca2+ all'interno delle cellule infette33,34.

L'imaging Ca2+ su cellule vive di organoidi intestinali umani offre una piattaforma versatile per studiare la segnalazione indotta da virus all'interno dell'epitelio. Tuttavia, la forza delle conclusioni tratte dai dati di imaging dipende, indissolubilmente, dalla salute e dalla qualità degli HIO, dai parametri di imaging appropriati e da un solido approccio analitico.

Un'efficiente trasduzione lentivirale è spesso il passo limitante quando si stabiliscono nuove linee HIO, ma i lentivirus ad alto titolo e le trasduzioni multiple aiutano a garantire una sufficiente espressione del transgene. È importante sottolineare che questo dovrà essere bilanciato con il potenziale di un significativo stress cellulare durante la trasduzione. Questo è il più delle volte temporaneo e si attenua dopo la selezione e più passaggi. Ciononostante, è fondamentale che gli HIO progettati per esprimere GECI mostrino una crescita e una proliferazione normali prima di iniziare gli esperimenti. Allo stesso modo, la dispersione di HIO tridimensionali e la loro riforma come monostrati induce stress cellulare. È buona norma attendere tre o più giorni affinché i monostrati si adattino dopo la placcatura. Il rivestimento delle piastre con collagene IV è fondamentale per l'integrità del monostrato35,36. Aliquotare il collagene IV e conservarlo a -80 °C tra un utilizzo e l'altro aiuta a garantire l'aderenza del monostrato. Anche la determinazione della densità di semina ottimale per ogni linea HIO può contribuire a migliorare la coerenza. Infine, l'inclusione dei controlli appropriati e il loro confronto tra gli esperimenti è indispensabile per garantire che qualsiasi osservazione rappresenti una risposta alla variabile in questione, piuttosto che un fattore confondente tecnico.

Mentre il punteggio di un monostrato può causare danni cellulari indesiderati, migliora notevolmente l'infezione da RV di HIO 2D. La Figura 2 illustra questo aspetto, poiché quasi tutte le cellule infette sono direttamente adiacenti al graffio. Evidenze sperimentali suggeriscono che la RV infetta in modo più efficiente sulla superficie basolaterale delle cellule epiteliali intestinali37. Pertanto, si prevede che l'incisione di un monostrato aumenti l'infettività esponendo la superficie basolaterale. Un'efficiente infezione monostrato può essere ottenuta anche placcando HIO su membrane in policarbonato sospese in pozzetti contenenti terreno di coltura, che consentono l'accesso alla superficie basolaterale. Tuttavia, la distanza relativamente lunga tra la piastra e la membrana in policarbonato, la membrana in policarbonato stessa e la superficie in plastica alla base del pozzetto li rendono inappropriati per l'imaging a epifluorescenza. Pertanto, il metodo di punteggio descritto in questo protocollo rimane l'approccio preferito. Dato che il punteggio stesso può portare a perturbazioni di segnalazione, l'inclusione del controllo non infetto e segnato è fondamentale per l'interpretazione. Per i virus, come il norovirus umano, che infettano in modo efficiente attraverso la membrana apicale, non è necessario segnare il monostrato38.

Come con qualsiasi sistema di imaging dal vivo, la fototossicità può facilmente confondere gli esperimenti che utilizzano monostrati HIO. Durante un esperimento di imaging, è importante monitorare la vacuolizzazione inaspettata, il blebbing della membrana o altri indicatori morfologici di stress39. Se viene rilevato uno di questi segni, la durata, la frequenza o la potenza di eccitazione devono essere ridotte. L'aumento del rapporto segnale/rumore spesso va a scapito della salute delle cellule a lungo termine, quindi l'ottimizzazione empirica dei parametri è fondamentale. Il fotosbiancamento, come indicato da una diminuzione dell'intensità della fluorescenza basale nel tempo, è un presagio di stress cellulare e dovrebbe essere evitato.

La visualità dei dati di imaging può portare i ricercatori a privilegiare analisi qualitative, piuttosto che quantitative. Tuttavia, come per qualsiasi modalità, le conclusioni riproducibili richiedono una quantificazione. L'analisi quantitativa delle immagini contiene molta più complessità di quella che può essere trattata in un singolo manoscritto, ma vale la pena evidenziare alcuni punti chiave. In primo luogo, una quantificazione coerente richiede un'acquisizione coerente. Una pipeline di analisi sviluppata per un determinato set di parametri di acquisizione potrebbe non essere efficace per le immagini acquisite a frequenze, tempi di esposizione, potenze laser o lunghezze d'onda diverse. In secondo luogo, la molteplicità delle infezioni ha un'influenza smisurata sulla frequenza dei segnali di calcio indotti viralmente. Pertanto, è importante valutare il numero di cellule infette per campo visivo e garantire la coerenza tra le condizioni di trattamento. In alternativa, la normalizzazione della frequenza del segnale al numero di cellule infette per campo visivo può aiutare a ridurre l'errore. Infine, mentre l'indicatore di calcio basato su mNG (NEMO) recentemente sviluppato offre un approccio promettente per determinare le concentrazioni assolute di Ca2+ nelle cellule40, la maggior parte dei biosensori trasmette solo informazioni relative sui sistemi biologici. Pertanto, la sottrazione in background, la normalizzazione e il confronto con un controllo sono fondamentali.

Sebbene questo protocollo si concentri sull'imaging del calcio durante l'infezione virale, l'approccio generale è facilmente adattabile. L'infezione virale può essere facilmente sostituita da una condizione di trattamento alternativa e c'è una litania sempre crescente di biosensori per monitorare molti percorsi e processi cellulari diversi. Con qualsiasi adattamento del protocollo, i ricercatori devono tenere a mente l'analisi, progettando esperimenti con risultati chiari e quantificabili.

Nel complesso, l'imaging dal vivo fornisce una risoluzione temporale senza rivali, migliorando la caratterizzazione di processi altamente dinamici. L'incorporazione di organoidi in esperimenti di imaging dal vivo consente l'osservazione di questi processi in un modello realistico e fisiologicamente rilevante. Ci auguriamo che il protocollo qui descritto faciliti la progettazione e l'ottimizzazione sperimentale, consentendo ai ricercatori di scoprire nuovi aspetti della segnalazione cellulare e tissutale.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da divulgare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni R01DK115507 e R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) del National Institutes of Health (NIH). Il supporto ai tirocinanti è stato fornito da NIH grants F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) e F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Vorremmo ringraziare il Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core per aver fornito i terreni di mantenimento dell'organoide.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Advanced DMEM F12Gibco12634028
[Leu15]-Gastrin ISigma-AldrichG9145
0,05% Tripsina EDTA Gibco 
0,05% tripsina EDTAGibco 
provette per microcentrifuga da 1,5 mlFisherbrand5408137
provette coniche da 15 mlThermofisher Scientific0553859A
16% formaldeideThermofisher Scientific28906
1MHEPES Gibco15630080
1M HEPESGibco15630080
1X PBSCorning 21-040-CV
Ago calibro 25Thermofisher Scientific1482113D
A-83-01Tocris2939
ADPSigma-Aldrich A2754
Advanced DMEM F12Gibco12634028
Antibiotico-antimicocitico Gibco15240062
Antibiotico-antimicotico Gibco15240062
B27 IntegratoreGibco17504-044
Albumina sierica bovinaFisherScientific 
CellView Vetrino per colture cellulari, PS, 75/25 MM, fondo in vetro, 10 scompartiGreiner543979
Collagen IVSigma AldrichC5533
DAPIThermofisher ScientificD1306
EDTACorning46-034-CI
Siero fetale bovino Corning 35010CV
Siero fetale bovino Corning 35010CV
FluorobriteGibcoA1896701
GlutaMAX Gibco 
GlutaMAX Gibco 
Fattore di crescita epidermico umanoProteinTechHZ-1326
Vettore di lentivirusCostruttore(variabile)
MatrigelBD Biosceicen356231/CB40230C
N2 IntegratoreGibco17502-048
N-acetilcisteinaSigma-AldrichA9165-5G
NH4ClSigma-Aldrich A9434
NicotinamideSigma-AldrichN0636
Nunc Piastre a 24 pozzetti trattate con coltura cellulareThermofisher Scientific142475
PolybreneMilliporeSigmaTR1003G
SB202190Sigma-AldrichS70767
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151100
TrypLE Express Enzima, senza fenolo rossoThermofisher Scientific12604013
TripsinaWorthingtonBiochemical NC9811754
Y-27632Tocris1254
2530005425300054BP16001003505007935050079

Riferimenti

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