Immunoistochimica fluorescente ciclica multiplex

Summary

L'immunoistochimica ciclica multiplex consente la rilevazione in situ di più marcatori contemporaneamente utilizzando l'incubazione ripetuta antigene-anticorpo, la scansione delle immagini e l'allineamento e l'integrazione delle immagini. Qui, presentiamo il protocollo operativo per l'identificazione dei substrati delle cellule immunitarie con questa tecnologia in campioni di carcinoma polmonare e metastasi cerebrali accoppiate.

Abstract

Il microambiente tumorale coinvolge le interazioni tra cellule ospiti, cellule tumorali, cellule immunitarie, cellule stromali e vascolarizzazione. La caratterizzazione e l'organizzazione spaziale dei sottoinsiemi di cellule immunitarie e delle proteine bersaglio sono cruciali per scopi prognostici e terapeutici. Ciò ha portato allo sviluppo di metodi di colorazione immunoistochimica multiplexati. L'immunoistochimica a fluorescenza multiplex consente la rilevazione simultanea di più marcatori, facilitando una comprensione completa della funzione cellulare e delle interazioni intercellulari. In questo articolo, descriviamo un flusso di lavoro per il test di immunoistochimica fluorescente ciclica multiplex e la sua applicazione nell'analisi di quantificazione di sottogruppi di linfociti. La colorazione immunoistochimica fluorescente ciclica multiplex segue passaggi e reagenti simili a quelli dell'immunoistochimica standard, che prevede il recupero dell'antigene, l'incubazione ciclica degli anticorpi e la colorazione su un vetrino di tessuto in formalina fissata con paraffina (FFPE). Durante la reazione antigene-anticorpo, viene preparata una miscela di anticorpi di specie diverse. Le condizioni, come il tempo di recupero dell'antigene e la concentrazione di anticorpi, sono ottimizzate e convalidate per aumentare il rapporto segnale/rumore. Questa tecnica è riproducibile e funge da strumento prezioso per la ricerca sull'immunoterapia e le applicazioni cliniche.

Introduction

Le metastasi cerebrali (BM) rappresentano i tumori più comuni del sistema nervoso centrale (SNC), che si verificano in quasi la metà dei casi di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), con una prognosi sfavorevole¹. Si stima che il 10%-20% dei pazienti con NSCLC abbia già BM al momento della diagnosi iniziale e circa il 40% dei casi di NSCLC svilupperà BM durante il corso del trattamento². Il microambiente tumorale (TME) è strettamente associato all'insorgenza di NSCLC e al midollo osseo, compresi vari componenti, come vasi sanguigni, fibroblasti, macrofagi, matrice extracellulare (ECM), cellule immunitarie linfoidi, derivate dal midollo osseo e molecole di segnalazione ^3,4. Le cellule immunitarie microambientali svolgono un ruolo cruciale nell'influenzare la crescita e lo sviluppo delle cellule tumorali. Le metastasi cerebrali presentano numerosi potenziali bersagli terapeutici caratterizzati da complessi microambienti immunologici e processi di segnalazione. Ad esempio, gli inibitori di PD-1 hanno mostrato efficacia clinica per i pazienti con metastasi cerebrali da carcinoma polmonare (LCBM) come inibitore del checkpoint immunitario (ICI). Tuttavia, la frequenza delle risposte alla terapia con PD-1 varia tra NSCLC primario e LCBM⁵, suggerendo che il microambiente immunitario del tumore agisce come un regolatore critico dell'ICI.

L'immunoistochimica (IHC) è uno strumento inestimabile nei campi della biologia, della medicina di base e della patologia⁶. Questo metodo di rilevamento visualizza l'espressione dell'antigene attraverso l'interazione antigene-anticorpo su un vetrino tissutale⁷. L'IHC viene utilizzato per diagnosticare marcatori predittivi, valutare i marcatori prognostici, guidare terapie mirate ed esplorare le funzioni biologiche delle cellule tumorali⁸. Tuttavia, il metodo IHC tradizionale è in grado di rilevare un solo biomarcatore alla volta. Per ovviare a questa limitazione, l'innovazione della tecnologia immunoistochimica ha portato allo sviluppo dell'immunoistochimica a fluorescenza multiplex (mfIHC), che consente l'identificazione simultanea di più marcatori proteici sullo stesso vetrino tissutale, sia in campo chiaro che in campo fluorescente⁹. Questo progresso fornisce un'analisi accurata della composizione cellulare e delle interazioni molecolari tra le cellule stromali, le cellule immunitarie e le cellule tumorali all'interno della TME.

In questo studio, presentiamo un protocollo per l'immunoistochimica ciclica multiplex per analizzare la distribuzione spaziale delle cellule immunitarie. Due anticorpi primari di specie diverse, come coniglio e ratto, vengono scelti per l'incubazione contemporaneamente, seguiti da anticorpi secondari marcati con fluorescenza. Il recupero dell'antigene viene eseguito dopo ogni ciclo di reazione antigene-anticorpo. L'autofluorescenza viene bloccata e il 4', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) viene utilizzato per colorare i nuclei. Il pannello include la rilevazione sequenziale di CD3, CD8, CD20 e CK, le cellule sono classificate in base ai marcatori: cellule tumorali (CK+), cellule T mature (CD3+), cellule T citotossiche (CD3+CD8+), cellule B (CD20+)^10,11.

Protocol

La ricerca è stata approvata dal comitato etico medico dello Yunnan Cancer Hospital/il terzo ospedale affiliato dell'Università di Medicina di Kunming. Tutti i soggetti/tutori legali hanno firmato il consenso informato.

1. Preparazione dei vetrini

1. Tagliare sezioni di blocchi di paraffina appaiati contenenti cellule di metastasi cerebrali di tumore polmonare primario o cancro del polmone a uno spessore di 4 μm utilizzando un microtomo. Rimuovere le sezioni dall'acqua e separarle con una pinzetta, scegliere la migliore e farla aderire al vetrino rivestito in polilisina.
2. Mettere i vetrini di fazzoletti in forno a 65 °C per 30 minuti per migliorare l'adesione dei tessuti.
3. Immergere i vetrini nello xilene attraverso tre cambi, ciascuno della durata di 10 minuti.
4. Ridurre gradualmente la concentrazione di alcol e incubare i vetrini in etanolo al 100% per 5 minuti, etanolo al 90% per 5 minuti, etanolo al 75% per 5 minuti e in acqua deionizzata per 3 minuti.

2. Recupero dell'epitopo indotto dal calore (HIER)

1. Diluire una soluzione tampone di citrato di sodio 100x (pH 6,0) in 1x (10 mM) in acqua deionizzata, preparando una soluzione tampone sufficiente per immergere completamente i vetrini.
2. Mettere i vetrini in una pentola a pressione, sottoponendoli a calore elevato (100 °C) e pressione (~30 psi) per 2 min. Dopo il riscaldamento, lasciare raffreddare i vetrini a temperatura ambiente in acqua distillata per 3 minuti.
3. Sciogliere una bustina da 52 g di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; in polvere) in 5 L di acqua deionizzata per la preparazione della soluzione tampone PBS (pH 7,0). Mettere i vetrini in soluzione tampone PBS per 5 minuti, con 3 cambi.

3. Blocco della perossidasi

1. Coprire le sezioni con perossido di idrogeno al 3% e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare i vetrini in PBS, 3 volte per 5 minuti ciascuno.
2. Utilizzare carta da filtro per assorbire l'acqua in eccesso lontano dal perimetro del tessuto. Nel frattempo, assicurati che il tessuto sia umido.

4. Incubazione degli anticorpi primari per il primo ciclo

1. Preparare una miscela di lavoro degli anticorpi primari per CD8 (anticorpo monoclonale di coniglio, clone SP16) e CD20 (anticorpo monoclonale di topo, clone L26), diluita 1:50 in diluente per anticorpi primari Bond.
2. Aggiungere il complesso anticorpale sulle sezioni e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
3. Preparare una soluzione salina tamponata con interpolazione/fosfato allo 0,1%: 1 mL di Tween in 1 L di soluzione tampone PBS.
4. Lavare le sezioni con soluzione salina tamponata con tween/fosfato allo 0,1%, 3 volte per 5 minuti ciascuna. Usa la carta da filtro per allontanare l'acqua in eccesso dal perimetro del fazzoletto, nel frattempo assicurati che il fazzoletto sia umido.

5. Incubazione secondaria degli anticorpi per il primo ciclo

1. Preparare una miscela di anticorpo anti-coniglio di capra marcato con fluorescenza (eccitazione (Ex): 495 nm) e anticorpo anti-topo di capra (Ex: 578 nm), diluito 1:50 in soluzione salina tampone fosfato. L'anticorpo anti-coniglio di capra si attacca all'anticorpo primario di CD8 e l'anticorpo anti-topo di capra si attacca all'anticorpo primario di CD20.
2. Aggiungere la miscela di anticorpi secondari goccia a goccia e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.

6. Recupero dell'epitopo indotto dal calore e blocco della perossidasi

1. Diluire 100x citrato di sodio (pH 6,0) a 1x (10 mM) in acqua deionizzata, preparando una soluzione tampone sufficiente per immergere completamente i vetrini.
2. Mettere i vetrini in una pentola a pressione e sottoporli a calore elevato (100 °C) e pressione (~30 psi) per 1 min. Dopo il riscaldamento, mettere i vetrini in acqua distillata a raffreddare a temperatura ambiente per 3 minuti.
3. Eseguire il blocco della perossidasi come descritto al punto 3.

7. Incubazione degli anticorpi primari per il secondo ciclo

1. Preparare una miscela di lavoro degli anticorpi primari per CD3 (anticorpo monoclonale di coniglio, clone SP7) e CK (anticorpo monoclonale di topo, MX005), diluita 1:50 in diluente anticorpale primario.
2. Aggiungere il complesso anticorpale sulle sezioni e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
3. Lavare con soluzione salina tamponata con tween/fosfato allo 0,1%, 3 volte per 5 minuti ciascuna. Usa la carta da filtro per allontanare l'acqua in eccesso dal perimetro del fazzoletto, nel frattempo assicurati che il fazzoletto sia umido.

8. Incubazione secondaria degli anticorpi per il secondo ciclo

1. Preparare una miscela di anticorpi anti-coniglio di capra (Es: 652 nm) e anticorpi anti-topo di capra (Es: 590 nm), diluizione 1:50 in soluzione salina tampone fosfato. L'anticorpo anti-coniglio di capra si attacca all'anticorpo primario di CD3 e l'anticorpo anti-topo di capra si attacca all'anticorpo primario di CK.
2. Aggiungere la miscela di anticorpi secondari goccia a goccia, incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare con soluzione salina tamponata con tween/fosfato allo 0,1%, 3 volte per 5 minuti ciascuna.

9. Estinzione in autofluorescenza e colorazione DAPI

1. Aggiungere il reagente (0,15 M/L KMnO₄ ) alla sezione tissutale per 1 min. Risciacquare con acqua corrente per 5 min.
   ATTENZIONE: KMnO₄ è tossico e danneggia la pelle. Assicurarsi di indossare i guanti quando si maneggiano i vetrini. Se il liquido gocciola sulla pelle, pulirlo rapidamente con tovaglioli puliti e sciacquare con acqua corrente.
2. Asciugare il vetrino con concentrazioni crescenti di alcol (70%, 90%, 100%), per 3 minuti in ciascuna concentrazione.
3. Aggiungi DAPI e vetrino coprioggetto per l'imaging multispettrale. La quantità di DAPI dipende dalle dimensioni del tessuto. Assicurarsi che il tessuto sia completamente coperto da DAPI dopo l'aggiunta del vetrino coprioggetto.

10. Scansione di vetrini

1. Posizionare i vetrini su un vassoio e spingere fino a quando non è possibile spingerlo ulteriormente.
2. Per avviare il programma, fare doppio clic sull'icona del programma sul desktop. Durante l'avvio, viene visualizzata la finestra di selezione della modalità. La finestra di selezione mostra due modalità in campo chiaro e fluorescente: modalità automatica e modalità manuale. In modalità di scansione fluorescente, fare clic su Modalità automatica.
3. Spostare il cursore del mouse su ? per visualizzare le informazioni sulle impostazioni. Fare clic su Impostazione filtro > Canale filtro per scegliere il numero di canale > lo pseudo colore. Definisci il colore e salva.
4. Fare clic su Lavoro di routine > Modalità di scansione > Completamente automatica. Fare clic su Lavoro di routine > Nome diapositiva per definire il nome della diapositiva per l'output. Fare clic su Lavoro di routine > Impostazioni canale per scegliere i filtri.
5. Fare clic su Lavoro di routine > Opzioni di scansione per determinare la qualità risultante e la posizione di archiviazione del vetrino virtuale.
6. Fare clic su Anteprima per l'impostazione della soglia e la selezione dell'intervallo da scansionare.
7. Fare clic su Filtri > hardware > Messa a fuoco automatica > dal vivo > esposizione automatica > guadagno digitale > Tick utilizzare il tempo di esposizione manuale > Tick che limitano l'intervallo > Imposta corrente.
8. Fare clic su Lavoro di routine > avviare la scansione. Selezionare il livello di ingrandimento 20x o 40x. Scegli 20x per le dimensioni dei file appropriate. L'estensione MRXS è definita dallo scanner MIDI 3D Pannoramic . L'estensione dell'immagine può anche essere modificata in immagine TIFF.
9. Fare clic su Visualizzatore diapositive > Multiview Toolbox per scegliere l'immagine per la confocale, quindi allineare e integrare l'immagine.

11. Valutazione quantitativa della densità cellulare

1. Quantifica le percentuali di cellule immunitarie positive (CD3+, CD3+CD8+, CD20+) nelle aree tumorali e stromali con il software dello scanner Halo 10. Convalidare la colorazione CK per definire il tessuto tumorale.

Results

Presentiamo un protocollo per la rilevazione dell'antigene ciclico utilizzando la fluorescenza multiplex a 5 colori su un singolo vetrino. Attraverso l'ottimizzazione del test, consentiamo l'incubazione di due anticorpi di specie diverse (Figura 1). I dispositivi necessari per la procedura dell'esperimento includono una pentola a pressione e una scatola per l'immunocolorazione (Figura 2A).

Dopo aver completato il saggio, definiamo lo pseudo colore dei quattro marcatori prima di scansionare i vetrini. Gli pseudo colori di CD3, CD8, CD20 e CK sono rispettivamente giallo, rosso, verde e ciano. I nuclei sono marcati con DAPI. Le regioni rappresentative del tumore e dello stroma vengono selezionate per l'analisi. Lo spettro fluorescente a 495 nm, 578 nm, 652 nm e 590 nm viene catturato utilizzando uno scanner per vetrini digitale automatico 3D. Nella Figura 2B sono mostrate un'immagine rappresentativa della pila e immagini marcate singolarmente nel tessuto delle metastasi cerebrali del cancro del polmone. Sulla base di immagini contenenti un singolo segnale di fluorescenza marcatore, il software dello scanner ha estratto le caratteristiche del fenotipo cellulare in base allo pseudo colore. Sono stati contati anche i numeri corrispondenti di cellule immunitarie positive e di cellule immunitarie totali. I livelli di ciascuna proteina colorata sono quantificati nei tessuti rilevati calcolando l'H-score¹². Dopo queste procedure, vengono contati e analizzati il numero di ciascun tipo di linfociti infiltranti il tumore e la proporzione di ciascun tipo di cellula nel numero totale di cellule bersaglio. La proporzione di ciascun tipo di cellula immunitaria presenta la percentuale effettiva di linfociti infiltranti il tumore. La percentuale di cellule T CD3+, CD3+CD8+ e cellule B CD20+ è stata analizzata nelle metastasi cerebrali del cancro del polmone rispetto alle sezioni di carcinoma polmonare primario. I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 3. La densità delle cellule immunitarie (cellule T CD3+, cellule T CD3+ CD8+) è inferiore nelle metastasi cerebrali del cancro del polmone rispetto al carcinoma polmonare primario. Le cellule B CD20+ sono più alte nel gruppo delle metastasi cerebrali rispetto al gruppo del cancro del polmone primario. Tuttavia, i risultati non differiscono in modo significativo tra questi due gruppi per i campioni limitati.

Figura 1: Flusso di lavoro della colorazione immunoistochimica a fluorescenza ciclica multiplex. Le sezioni da 4 μm vengono tagliate e incollate su vetrino adesivo. Vengono eseguite le seguenti fasi operative: deparaffinazione e reidratazione, recupero dell'antigene, recupero dell'antigene, blocco dell'antigene, incubazione della miscela di anticorpi primari, incubazione secondaria degli anticorpi, quindi ripetizione delle fasi di recupero dell'antigene, blocco dell'antigene, incubazione della miscela di anticorpi primari e incubazione secondaria degli anticorpi, seguita dalla riduzione dell'autofluorescenza, dalla selezione del filtro appropriato per la scansione dei vetrini e dall'analisi dei risultati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Metodi operativi della colorazione immunoistochimica a fluorescenza multiplex. Il trattamento antigenico viene eseguito riscaldando le sezioni in una pentola a pressione. (A) La pentola a pressione viene utilizzata per il recupero dell'epitopo indotto dal calore. Nel processo di incubazione degli anticorpi, i vetrini vengono inseriti nella scatola di immunocolorazione. (B) Immagini composite e monocoloranti rappresentative per il pannello utilizzato nel tessuto delle metastasi cerebrali del cancro del polmone. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Proporzione di cellule immunitarie all'interno del carcinoma polmonare primario e metastasi cerebrali del cancro del polmone. La proporzione di cellule immunitarie CD3+, CD3+CD8+, CD20+ in quattro tessuti con metastasi cerebrali per carcinoma polmonare è inferiore rispetto ai tessuti con carcinoma polmonare primario appaiati (barre di errore: deviazione standard). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Abbiamo descritto il processo per la colorazione immunoistochimica a fluorescenza ciclica multiplex. La selezione degli anticorpi primari è un aspetto cruciale del test di immunoistochimica a fluorescenza e gli anticorpi monoclonali sono raccomandati per una migliore specificità e ripetibilità. Per ottimizzare la concentrazione di lavoro dell'anticorpo primario, sono state testate una serie di diluizioni attraverso esperimenti di immunoistochimica. Sia i controlli positivi (per valutare l'espressione dell'antigene bersaglio) che i controlli negativi (nessuna incubazione degli anticorpi primari) sono essenziali e devono essere istituiti.

In questo protocollo, gli anticorpi primari vengono diluiti e preparati per una miscela di specie diverse. Anche gli anticorpi secondari marcati con fluorescenza vengono raggruppati e incubati allo stesso modo, derivati da specie diverse. Quindi, il passaggio critico è la scelta della specie per i diversi anticorpi primari in base agli antigeni e l'anticorpo monoclonale è preferito rispetto all'anticorpo policlonale. Questi possono garantire che la combinazione tra anticorpo primario e anticorpo secondario sia specifica. Il liquido miscelato deve raggiungere la concentrazione di lavoro per entrambi gli anticorpi primari e la cross-reattività non deve esistere contemporaneamente tra i due anticorpi. Se gli anticorpi primari sono della stessa specie, viene incubato prima un anticorpo secondario, poi il secondo. Quando si determina la sequenza di incubazione degli anticorpi primari in un pannello, la priorità deve essere data agli anticorpi sensibili alla reazione antigene-anticorpo, per gli antigeni a bassa espressione, l'intensità si rafforzerebbe durante il secondo recupero dell'epitopo. Prima del secondo ciclo di incubazione degli anticorpi, il recupero ripetuto dell'antigene richiede meno tempo (1 minuto) rispetto alla prima operazione (2 minuti). L'intensità della fluorescenza della precedente colorazione ciclica non diminuirà anche se le sezioni subiscono due volte il recupero indotto dal calore. Per evitare l'immunoreattività aspecifica, le condizioni di incubazione devono essere ottimizzate, tra cui la concentrazione di lavoro degli anticorpi, il tempo di incubazione e la temperatura ambientale.

Negli ultimi decenni sono stati sviluppati vari metodi di recupero degli epitopi, principalmente suddivisi in recupero dell'epitopo indotto dal calore (HIER) e recupero dell'epitopo indotto dalla proteasi (PIER). Il riscaldamento è un metodo efficiente di recupero dell'antigene che espone gli epitopi dell'antigene, rendendoli più efficacemente rilevabili dagli anticorpi¹³. Le due opzioni principali per il recupero dell'antigene si basano sul tampone citrato e sul tampone EDTA¹⁴ ad alto pH. La condizione di recupero ottimizzato viene identificata in base all'antigene bersaglio.

L'autofluorescenza può interferire con l'imaging fluorescente su sezioni causate da fluorofori endogeni e reagenti utilizzati nel trattamento dei tessuti¹⁵. Per l'eluizione è necessario l'uso di un reagente associato. I fluorofori sono selezionati con picchi di emissione evitando picchi di autofluorescenza (circa 490 nm)^16,17. Sudan Black B e NaBH4 sono stati segnalati per l'autofluorescenza dei tessuti di quenching ^18,19. La combinazione di Sudan Black B e NaBH4 ha ridotto il fondo di fluorescenza nel tessuto mirato a cui è stata fissata in formalina il tessuto incorporato in paraffina²⁰. In questo protocollo, il trattamento tissutale di KMnO₄ in una concentrazione di 0,15 M/L consente di risparmiare tempo per 1 minuto. KMnO₄ copre uno strato sul tessuto per schermare la fluorescenza spontanea e riduce la fluorescenza di fondo, la colorazione specifica della proteina rilevata è più visualizzata.

I vetrini interi vengono scansionati in quattro diversi canali di filtri, è necessaria l'analisi dell'allineamento delle immagini, è una grande sfida allineare la localizzazione delle strutture unicellulari e subcellulari. Per le immagini multispettrali di questa tecnica, sono necessarie apparecchiature professionali per l'imaging della luce e un software di analisi quantitativa per evitare la diafonia spettrale. Il costo elevato dello strumento ne limita l'applicazione. La co-incubazione di due anticorpi consente di risparmiare tempo, soprattutto quando si ha a che fare con un pannello a 6 marcatori, che richiede 3 cicli di incubazione. Questa tecnica viene utilizzata per visualizzare una caratterizzazione più dettagliata delle cellule immunitarie nei microambienti immunitari tumorali. In futuro, il metodo sarà applicato per l'analisi quantitativa delle strutture linfoidi terziarie associate al tumore.

In sintesi, l'immunoistochimica a fluorescenza ciclica multiplex consente di colorare più bersagli con fluorofori marcati individualmente su un singolo vetrino. Questo test fornisce una migliore comprensione della distribuzione spaziale delle cellule nel microambiente immunitario del tumore e la vicinanza spaziale delle cellule immunitarie tumorali contribuisce allo screening dei pazienti che trarranno beneficio dall'immunoterapia.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,15 mol/L KmnO4	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MST-8005
100x citrato di sodio	Maixin Biotechnology Co., Ltd	MVS-0100
Perossido di idrogeno al 3%	Maixin Biotechnology Co., Ltd	SP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI	3D histech Ltd	Pannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488	Abcam	ab150113
Alexa Fluor 568	Abcam	ab175701
Alexa Fluor 594	Abcam	ab150116
Alexa Fluor 647	Abcam	ab150079
Bond diluente per anticorpi primari	Lecia	AR9352
CD20	Maixin Biotechnology Co., Ltd	kit-0001
CD3	Maixin Biotechnology Co., Ltd.	kit-0003
CD8	Fornitore verificato - Maixin Biotechnology Co., Ltd	RMA-0514
CK	Maixin Biotechnology Co., Ltd.	MAB-0671,
DAPI	sig-ma	D8417
etanolo	Sinopharm Group Reagente chimico Co., LTD	10009218
Histocore Multicut	lecia	2245
PBS (polvere)	Maixin Biotechnology Co., Ltd	PBS-0061
vetrino scorrevole	3D histech Ltd
xilene	Sinopharm Group Reagente chimico Co., LTD	10023418