Articolo metodologico

Un metodo semplice, rapido ed efficace per l'analisi dello xenotrapianto tumorale in embrioni trasparenti di zebrafish

2.2K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/66164

⸱

12 luglio 2024

 ,  ,  , 
1Nuclear Dynamics and Cancer Program, Fox Chase Cancer Center

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un protocollo per lo xenotrapianto nel tuorlo di embrioni trasparenti di zebrafish ottimizzato con un metodo di stadiazione semplice e rapido. Le analisi post-iniezione includono la sopravvivenza e la valutazione del carico di malattia delle cellule xenotrapiantate mediante citometria a flusso.

Abstract

Gli studi in vivo sul comportamento dei tumori sono un punto fermo della ricerca sul cancro; Tuttavia, l'uso dei topi presenta sfide significative in termini di costi e tempo. Qui, presentiamo il pesce zebra larvale come un modello di trapianto che presenta numerosi vantaggi rispetto ai modelli murini, tra cui facilità di manipolazione, bassa spesa e breve durata sperimentale. Inoltre, l'assenza di un sistema immunitario adattativo durante gli stadi larvali ovvia alla necessità di generare e utilizzare ceppi immunodeficienti. Sebbene esistano protocolli consolidati per lo xenotrapianto in embrioni di zebrafish, presentiamo qui un metodo migliorato che coinvolge la stadiazione degli embrioni per un trasferimento più rapido, l'analisi della sopravvivenza e l'uso della citometria a flusso per valutare il carico della malattia. Gli embrioni vengono messi in scena per facilitare l'iniezione rapida di cellule nel tuorlo delle larve e la marcatura delle cellule per monitorare la consistenza del bolo cellulare iniettato. Dopo l'iniezione, l'analisi della sopravvivenza dell'embrione viene valutata fino a 7 giorni dopo l'iniezione (dpi). Infine, il carico di malattia viene valutato anche marcando le cellule trasferite con una proteina fluorescente e analizzando mediante citometria a flusso. La citometria a flusso è resa possibile da un metodo standardizzato di preparazione di sospensioni cellulari da embrioni di zebrafish, che potrebbe essere utilizzato anche per stabilire la coltura primaria di cellule di zebrafish. In sintesi, la procedura qui descritta consente una valutazione più rapida del comportamento delle cellule tumorali in vivo con un numero maggiore di animali per braccio di studio e in modo più economico.

Introduzione

L'analisi del comportamento dei tumori in risposta ad alterazioni genetiche o al trattamento farmacologico in vivo è un elemento essenziale della ricerca sul cancro 1,2,3,4. Tali studi comportano il più delle volte l'uso di modelli murini immunocompromessi (Mus musculus)5; Tuttavia, gli studi sugli xenotrapianti nei topi sono limitati sotto molti aspetti, tra cui capacità limitata, durata prolungata, spese significative e la necessità di sofisticate apparecchiature di imaging per monitorare la progressione dei tumori interni 6,7. Al contrario, il modello del pesce zebra (Danio rerio) consente una maggiore capacità, una durata più breve, una spesa inferiore e, grazie alla loro trasparenza, un semplice monitoraggio della progressione della malattia 8,9.

Il pesce zebra è un sistema modello di vertebrato ben sviluppato con sviluppo ex-utero e alta fecondità, con singole femmine che producono più di 100 embrioni10. Inoltre, gli embrioni di zebrafish sono trasparenti e consentono una facile visualizzazione dei processi di sviluppo utilizzando tecniche legate alla fluorescenza come i reporter. Infine, la conservazione dei processi critici di sviluppo li rende un modello ideale per molti tipi di studi, incluso il comportamento delle cellule maligne trapiantate11,12. Gli embrioni di zebrafish wild-type sviluppano melanociti, che li rendono otticamente opachi entro le 2 settimane di età, ma questo è stato superato dalla generazione di embrioni di casper (roya9; mitfaw2), che rimangono trasparenti per tutta la vita13. A causa delle loro proprietà ottiche, i pesci zebra casper sono riceventi ideali di cellule tumorali trapiantate 14,15,16. Lo xenotrapianto di cellule tumorali in zebrafish ha acquisito importanza negli ultimi 2 decenni 17,18,19,20,21. Gli embrioni di pesce zebra hanno un'immunità innata; Tuttavia, mancano di immunità adattativa durante il loro stadio larvale, rendendoli immunocompromessi dal punto di vista funzionale, il che consente loro di fungere da ospiti efficaci per gli xenotrapianti tumorali trapiantati22.

Sono stati sviluppati protocolli per l'attecchimento tumorale in embrioni di zebrafish e adulti che hanno considerato una serie di variabili diverse 23,24,25,26,27. Questi hanno esplorato numerosi siti di deposizione tumorale nel pesce zebra, comprese le iniezioni nel tuorlo, nello spazio peri-vitellino e nel cuore e in diversi stadi di sviluppo16,28. Anche la temperatura ambiente dell'acquacoltura per gli xenotrapianti di pesce zebra è importante poiché l'allevamento del pesce zebra avviene in genere a 28 °C, mentre le cellule dei mammiferi crescono a 37 °C. Di conseguenza, deve essere impiegata una temperatura di compromesso che sia tollerata dai pesci ma che supporti la crescita del tumore, e 34 °C sembra raggiungere entrambi gli obiettivi29. L'analisi del comportamento e della progressione dei tumori a seguito di xenotrapianto è un'altra importante area di interesse, e ciò comporta l'uso di una varietà di modalità di imaging e l'analisi della sopravvivenza30. Uno dei principali vantaggi del modello zebrafish è la disponibilità di un gran numero di animali in studio per fornire un'immensa potenza statistica agli studi in vivo del comportamento tumorale; Tuttavia, gli approcci precedenti hanno fortemente limitato questo potenziale a causa della necessità di noiose procedure di montaggio per le iniezioni.

Qui, affrontiamo questa limitazione attraverso lo sviluppo di un metodo semplice e rapido con cui mettere in scena gli embrioni che consente un'elevata produttività e il monitoraggio della qualità dell'iniezione utilizzando la linea trasparente casper zebrafish. Ciò comporta l'iniezione di xenotrapianti nel sacco vitellino degli embrioni di pesce zebra casper a 2 giorni dalla fecondazione (dpf). Osserviamo la sopravvivenza degli embrioni dopo lo xenotrapianto come parte dell'analisi del comportamento tumorale. Mostriamo inoltre la valutazione del carico di malattia dopo xenotrapianto effettuando sospensioni di singole cellule e analizzando mediante citometria a flusso (Figura 1).

Protocollo

Il mantenimento, l'alimentazione e l'allevamento del pesce zebra sono avvenuti in condizioni di acquacoltura standard a 28,5 °C, come descritto31. Tutti gli esperimenti relativi al pesce zebra sono stati fatti a questa temperatura; tuttavia, dopo lo xenotrapianto, gli animali sono stati coltivati a 34 °C per tutta la durata dell'esperimento, in conformità con le procedure approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC).

1. Allevamento (3 giorni prima dell'iniezione)

  1. Fornire mangime secco (mangime extra; 5-6 granuli per pesce) alle coppie di pesci una settimana prima della riproduzione per massimizzare la salute degli animali e aumentare il numero di embrioni prodotti dalle coppie riproduttrici.
  2. La sera prima del prelievo degli embrioni, sistemare gli animali riproduttori in vasche di riproduzione con un divisorio che separa i pesci maschi e femmine, utilizzando accoppiamenti harem di 2 femmine per ogni maschio.
    NOTA: Per esperimenti con 4 braccia di 100 animali per braccio, impiegare 20 coppie riproduttive per esperimento. Per determinare il numero di coppie riproduttive necessarie, una buona stima è di 50 embrioni per coppia riproduttiva casper . Un'altra opzione è quella di utilizzare un ceppo di pesce zebra più robusto e pigmentato e trattare con 1-fenil 2-tiourea (PTU) per prevenire la pigmentazione31. In pratica, l'esperimento dovrebbe essere ridimensionato in modo tale da avere abbastanza embrioni per iniettare il doppio del numero desiderato a 1 giorno dopo l'iniezione (dpi).

2. Raccolta degli embrioni (2 giorni prima dell'iniezione)

  1. La mattina dopo, rimuovere i divisori, permettendo ai pesci di riprodursi.
  2. Visualizzare gli embrioni nelle vasche 20 minuti (min) dopo aver rimosso i divisori.
  3. Raccogli gli embrioni usando un setaccio in una capsula di Petri da 90 mm contenente acqua per embrioni fatta come descritto nel Libro del pesce zebra31.
    1. Per preparare l'acqua dell'embrione, aggiungere 1,5 ml di sali di riserva a 1 litro di acqua distillata e blu di metilene allo 0,1% finale. Preparare la soluzione salina brodo sciogliendo 40 g di sali marini (Tabella dei materiali) in 1 L di acqua distillata. La composizione ionica dell'acqua embrionale è K+ (0,68 mg/L), Cl− (31,86 mg/L), Na+ (17,77 mg/L), SO4− (4,47 mg/L), Mg2+ (2,14 mg/L) e Ca2+ (0,68 mg/L).
  4. Lasciate che il pesce zebra si riproduca per un'ora in più e raccogliete gli embrioni risultanti.
  5. Raggruppa gli embrioni per l'esperimento.
  6. La sera, rimuovere tutti gli embrioni non fecondati o morti, che sono riconoscibili per la loro morfologia anormale, e fornire acqua fresca agli embrioni.

3. Mantenimento dell'embrione e preparazione degli strumenti per le iniezioni (1 giorno prima dell'iniezione)

  1. La mattina seguente, rimuovi eventuali embrioni morti e fornisci acqua fresca agli embrioni.
  2. Preparare una piastra di agarosio riscaldando l'1,5% di agarosio in acqua embrionale e versare la miscela riscaldata in una piastra Petri da 90 mm. Una piastra da 90 mm richiede 30-35 ml di miscela.
  3. Estrarre gli aghi non filamentosi dai capillari di vetro (borosilicato) utilizzando l'estrattore dell'ago. Gli aghi vengono tirati (sotto pressione termica) producendo un'estremità chiusa; Agganciali con una pinza per generare un orifizio ottimale. Valutare l'idoneità dell'orifizio dell'ago determinando il volume di fluido spostato per unità di tempo (vedere sotto, paragrafo 6.3).
    NOTA: I capillari in vetro possono essere acquistati con o senza filamenti centrali. I capillari privi di filamenti centrali sono preferiti per le iniezioni cellulari.
  4. Posizionare gli aghi in una piastra di Petri coperta da 90 mm nelle scanalature realizzate con l'argilla (argilla da modellare per bambini) fino all'uso (Figura 2A).

4. Preparazione ed etichettatura delle cellule leucemiche con CM-Dil (giorno dell'iniezione)

  1. Mantenere le cellule da trapiantare in condizioni ottimali per la loro crescita. Le cellule di leucemia murina qui impiegate erano sufficienti (M82; Rpl22+/+) o carente (M109; Rpl22-/-) per la proteina ribosomiale Rpl22, che funziona come soppressore tumorale32.
  2. Celle a pellet in provetta conica da 50 mL. Contare, quindi centrifugare a 300 x g a temperatura ambiente (RT) per 5 min. Scartare il surnatante.
    NOTA: Il numero di celle necessarie sarà dettato dall'ambito e dalle condizioni sperimentali, ma 1 x 106 celle è un buon punto di partenza.
  3. Eseguire la colorazione CM-Dil
    NOTA: La colorazione CM-Dil consente il monitoraggio del bolo di iniezione.
    1. Preparare una soluzione madre di CM-Dil risospendendo un flaconcino da 50 μg di CM-Dil in 50 μL di dimetilsolfossido (DMSO; 1 mg/mL o ~1 mM finale).
    2. Produrre una soluzione di lavoro diluendo il brodo (4,8 μL di colorante/mL) in siero fetale bovino all'1% (FBS)/soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente eventuali integratori di supporto necessari alle cellule da utilizzare.
  4. Risospendere le cellule a 1 x 106/100 μL nella soluzione di lavoro del colorante.
  5. Incubare a 37 °C per 10 min.
    NOTA: Le condizioni di colorazione devono essere ottimizzate per le celle impiegate (tempo, ecc.). Le cellule utilizzate qui hanno richiesto due distinte incubazioni di 10 minuti a temperature diverse per ottenere una colorazione ottimale.
  6. Lavare con 10 ml di 1x HBSS a temperatura ambiente (RT).
  7. Cellule a pellet (centrifugazione a 300 x g per 5 minuti a RT), decantare il surnatante, quindi risospendere con 10 mL di HBSS e ripetere lo stesso per un secondo lavaggio.
  8. Risospendere le cellule tumorali colorate a 40.000 cellule/μL in FBS/PBS all'1% e in qualsiasi integratore di supporto necessario e mantenere la sospensione cellulare a 34 °C fino all'iniezione.
    NOTA: Sono stati necessari integratori di supporto per il mantenimento delle linee cellulari utilizzate in questo studio (ad esempio, FBS all'1% e citochine). Gli integratori e gli xenotrapianti potrebbero dover essere adattati alle particolari linee cellulari in studio. La PBS è stata selezionata qui al posto dei terreni per evitare qualsiasi potenziale tossicità nel tuorlo.

5. Dechorionation

  1. Dechorionare manualmente gli embrioni di pesce zebra casper a 2 dpf utilizzando siringhe per iniezione di insulina con ingrandimento 2x in un microscopio ottico. Forare il corion con un ago mentre si usa l'altro ago per immobilizzare il corion.
    NOTA: L'uso della pronasi per la decorionazione non è raccomandato perché a volte provoca una riduzione della salute dell'embrione. La decelerazione degli embrioni a 2 dpf è preferibile perché è più facile e gli embrioni sono meno fragili rispetto ai tempi precedenti (1 dpf).
  2. Durante la decorionazione, fare attenzione a non toccare gli embrioni con gli aghi. Toccare o danneggiare il tuorlo degli embrioni mediante il contatto involontario con gli aghi potrebbe causare la morte.
  3. Rimuovere i corioni spogliati cambiando l'acqua dell'embrione.

6. Impostazione del microiniettore e dell'ago

  1. Accendere il microiniettore e la pompa e creare le condizioni adatte per le microiniezioni di cellule. Una pressione di iniezione di 9-11 psi e un tempo di iniezione di 0,5 secondi (s) sono un buon punto di partenza per agganciare l'ago e impostare l'orifizio.
  2. Caricare con cura la sospensione della linea cellulare tumorale (~5 μL) nel microago in un unico passaggio, evitando la formazione di bolle d'aria, che interromperanno il flusso cellulare all'interno dell'ago.
  3. Tagliare l'estremità dell'ago con una pinza (numero di Dumont 5) per produrre un orifizio che supporterà l'espulsione di 10-15 nanolitri (nL) di sospensione cellulare per 0,2-0,3 s.
    NOTA: Il calcolo di cui sopra del volume nL viene eseguito utilizzando capillari di calibrazione, dove 1 mm = 30 nL. In breve, impostare il tempo a 0,5 s e, dopo ogni clip dell'ago, premere inietta e raccogliere il volume nel capillare di calibrazione. Quindi, la lunghezza del volume raccolto viene misurata utilizzando la scala al microscopio e il taglio dell'ago viene interrotto quando vengono iniettati 30 nL in 0,5 s. Quindi, impostare il tempo delle iniezioni su 0,2-0,3 s. (iniettando ~10-15 nL di cellule)

7. Preparazione dell'embrione per l'iniezione

  1. Seleziona gli embrioni sani al microscopio, eliminando quelli con anomalie dello sviluppo come edema cardiaco o un tronco corto o curvo.
  2. Anestetizzare gli embrioni utilizzando tricaina metansolfonato (MS-222; 0,16 g/L di acqua embrionale) per 1 minuto in una piastra di Petri da 90 mm.
  3. Usa una pipetta di vetro Pasteur per raccogliere gli embrioni. Disporre 10-15 embrioni in posizione laterale sulla piastra di agarosio all'1,5% (Figura 2B-D).
  4. Rimuovere l'acqua in eccesso utilizzando la pipetta Pasteur, lasciando la quantità minima di acqua per embrioni necessaria per mantenere in vita gli embrioni.

8. Procedura di iniezione

  1. Controllare al microscopio ottico per assicurarsi che le cellule si siano accumulate nella punta dell'ago.
  2. Iniettare gli embrioni utilizzando l'ago calibrato per 0,2-0,3 s (con 10-15 nL corrispondenti a 400-600 cellule) nel tuorlo degli embrioni.
  3. Ripetere l'iniezione per tutti gli embrioni, quindi raccoglierli in acqua fresca per embrioni.
    NOTA: Poiché le cellule tendono ad accumularsi sulla punta dell'ago, la punta dovrà essere riagganciata leggermente ogni 15-20 iniezioni. Ciò richiederà anche il ripristino della pressione e del tempo ad ogni ritaglio per garantire che venga iniettato un volume simile.
  4. Per assicurarsi che il confronto del comportamento di due set distinti di cellule trasferite sia valido, monitorare il bolo delle cellule trasferite. A tale scopo, selezionare gli embrioni in base alla colorazione CM-Dil (nel canale RFP) a 1 ora dopo l'iniezione (hpi), separando quelli con colorazione ottimale ("bolo buono") da quelli con colorazione inferiore ("bolo inferiore"; Figura 3, freccia gialla).
  5. Scartare gli embrioni con un bolo inferiore o utilizzarli per valutare l'impatto di una diversa dose di cellule sulla progressione della malattia.
  6. Rimuovere gli embrioni morti entro la fine della giornata poiché la loro morte è correlata a un trauma da iniezione piuttosto che alla crescita del tumore. Rimuovere dall'analisi gli embrioni che non trattengono le cellule poiché le cellule probabilmente sono fuoriuscite dal sito di iniezione.
  7. Mantenere gli embrioni iniettati a 34 °C per tutta la durata dell'esperimento in una piastra da 90 mm con ~60 embrioni per piastra.
    NOTA: Dopo 5 dpf, il tuorlo sarà stato consumato dagli embrioni in crescita, quindi agli embrioni deve essere fornito cibo paramecium per tutta la durata dell'esperimento. Per garantire una corretta nutrizione, i parameci devono essere somministrati agli embrioni ogni giorno da 6 dpf (4 dpi) a 9 dpf (7 dpi). I parameci si propagano per coltura in fiaschi in condizioni ottimali di nutrizione e temperatura, come descritto31.

9. Analisi di sopravvivenza

  1. Monitora gli embrioni per i successivi 7 dpi, cambiando l'acqua dell'embrione ogni giorno. I cambi d'acqua possono essere ridotti a giorni alterni per comodità se lo studio prevede un trattamento farmacologico.
  2. Controllare la salute dell'embrione e valutare la morte per tutta la durata dell'analisi.
    NOTA: La durata dell'esperimento è stata di 7 giorni per questo esperimento, ma può essere più breve o più lunga a seconda dell'aggressività del tumore xenotrapiantato.
  3. Utilizzare la fluorescenza CM-Dil per valutare il carico di malattia (Figura 4A) e determinare l'impatto delle alterazioni genetiche o dei trattamenti farmacologici sulla sopravvivenza utilizzando l'analisi Kaplan Meier e la rappresentazione grafica (ad esempio, con GraphPad Prism; Figura 4B) 33.

10. Sospensione di embrioni su singola cellula per analisi di citometria a flusso

NOTA: Il carico di malattia può essere valutato mediante analisi di citometria a flusso dopo xenotrapianto; Tuttavia, per farlo è necessaria una marcatura indelebile delle cellule tumorali. La proteina fluorescente rossa (RFP) o mCherry consegnata retrovialmente o lentiviralmente è efficace in quanto fornisce un buon segnale sull'autofluorescenza delle cellule di zebrafish, che oscura il segnale della proteina fluorescente verde.

  1. Isolare gli embrioni allo stadio dpi di scelta. Qui viene visualizzato 5 dpi (Figura 5).
  2. Raccogli 30-40 embrioni per condizione come punto di partenza, ma il numero di embrioni può variare a seconda dello stadio e dell'aggressività delle cellule trapiantate. Anestetizzare gli embrioni come descritto sopra.
    NOTA: Gli embrioni possono essere suddivisi in repliche per fornire una significatività statistica, come mostrato qui (Figura 5B).
  3. Trasferire gli embrioni in provette da centrifuga da 1,5 mL.
  4. Utilizzare 100 μl di soluzione di Ringer priva di calcio (ricetta31) per campione per sciogliere il tuorlo poiché il basso contenuto di calcio ammorbidisce i tessuti embrionali, consentendo una dissociazione tissutale più efficace.
  5. Pipettare su e giù a intermittenza per 5 minuti per rimuovere il tuorlo utilizzando un puntale per pipetta da 200 μl.
  6. Preriscaldare lo 0,05% di tripsina/PBS (senza indicatore rosso fenolo) a 29 °C e integrarlo con 27 μL di collagenasi IV (100 mg/mL) per mL di soluzione di tripsina. Sarà necessario un volume di 1 mL di soluzione per ogni campione di embrioni.
  7. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina/collagenasi a ciascun campione di embrioni detuolati e incubare a 29 °C per 30-35 minuti.
  8. Pipettare gli embrioni su e giù in questa soluzione utilizzando un puntale per pipetta da 1 ml ogni 5 minuti fino a quando la struttura degli embrioni (spina dorsale) non è più visibile.
  9. Arrestare la reazione utilizzando 200 μL di FBS.
  10. Mescolare bene e incubare a 29 °C per altri 5 minuti per garantire la completa inattivazione della tripsina.
    NOTA: Una temperatura di 29 °C viene impiegata per il protocollo di dissociazione tissutale per prevenire la morte indotta dallo shock termico delle cellule di zebrafish, che si verifica a 37 °C; tuttavia, se non è richiesta la conservazione delle cellule di zebrafish, la digestione può essere eseguita a 37 °C.
  11. Pellettare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
  12. Risospendere il pellet della cella in PBS a 4 °C e il pellet come sopra.
  13. Ripetere il lavaggio, quindi filtrare le cellule attraverso un colino da 70 μm.
  14. Pellet e procedere con la colorazione per l'analisi di citometria a flusso.
    NOTA: Se è necessaria la coltura di cellule primarie di zebrafish, lavare altre due volte con PBS a 4 °C e risospendere in terreno L15 (con antibiotici e FBS al 10%).

11. Selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS): colorazione e selezione di cellule xenotrapiantate

  1. Risospendere la sospensione cellulare in un mezzo di colorazione (HBSS con FBS all'1%) e pellettare a 300 x g per 5 minuti.
  2. Risospendere il pellet cellulare nel mezzo di colorazione con un anticorpo reattivo con le cellule trapiantate per fornire un secondo marcatore (oltre a RFP o mCherry) con cui distinguere le cellule trapiantate dalle cellule di zebrafish. In questo caso, sono stati impiegati 50 μL di CD45 anti-topo (APC-CD45) per campione a una diluizione di 1:50 (Figura 5).
  3. Incubare per 20 minuti a 4 °C prima di lavare come sopra con 1 mL di mezzo colorante per rimuovere l'anticorpo non legato.
  4. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 200 μl di mezzo di colorazione contenente il colorante vitale Helix NP Blue (1 μM), che consentirà la distinzione vivo/morto.
  5. Trasferire la miscela cellulare in provette in policarbonato a fondo tondo da 5 mL per l'analisi della citometria a flusso.
    NOTA: La colorazione di un controllo di cellule tumorali in parallelo fornisce chiarezza per il disegno dei cancelli durante l'analisi della citometria a flusso.

12. Citometria a flusso

  1. Accendere il citometro a flusso disponibile utilizzando una bassa velocità di flusso (500 eventi al secondo o meno) per impostare i parametri.
  2. Utilizzare il controllo delle cellule tumorali (le stesse cellule utilizzate per lo xenotrapianto) per impostare la tensione per i canali FSC (forward scatter), SSC (side scatter), BV421/CasB (vitalità), CE-594 (mCherry) e APC (CD45.2).
    NOTA: I campioni colorati singolarmente saranno necessari per stabilire le impostazioni di compensazione che eliminano la sovrapposizione del fluorocromo tra i distinti coloranti.
  3. Utilizzare il campione di embrione non iniettato per stabilire impostazioni che accolgano sia le cellule trapiantate che quelle di pesce zebra.
  4. Aumenta la velocità di flusso a 8000 eventi al secondo e registra 1 milione di eventi per ogni campione.
  5. Analizzare i dati risultanti utilizzando un software di analisi appropriato, selezionando prima i singoletti tracciando FSC-H v/s FSC-A (altezza v/s area), quindi un grafico per la selezione delle celle vitali. Il software FlowJo è ampiamente utilizzato per tale analisi.
  6. Utilizzando il controllo delle cellule tumorali, tracciare un cancello attorno alle cellule trapiantate mediante FSC-A v/s SSC-A, quindi utilizzare le colorazioni indicatori, in questo caso, CD45 e mCherry (Figura 5B).
    NOTA: Il cancello dimensionale selezionato per il tumore conterrà anche cellule di zebrafish, che forniscono la base per la normalizzazione e la determinazione del carico di malattia.
  7. Analizza i campioni di embrioni utilizzando le stesse impostazioni del cancello di cui sopra. Il grafico finale della colorazione tumorale e l'indicatore della proteina fluorescente forniranno una misura del carico di malattia (Figura 5C).
    NOTA: Qui, la differenza nel carico di malattia è stata tracciata per gli embrioni che ricevono un buon bolo di cellule iniettate rispetto a quelli che ricevono un bolo inferiore.
  8. Se necessario, selezionare le cellule tumorali negli embrioni mediante citometria a flusso per l'analisi molecolare a valle.

Risultati

Xenotrapianto
Una visione completa dell'intero esperimento e dell'analisi è illustrata nella Figura 1, che va dalla produzione di embrioni alla valutazione della progressione della malattia mediante analisi della sopravvivenza e del carico di malattia mediante citometria a flusso. Questo approccio apporta diversi miglioramenti che migliorano la riproducibilità e la scalabilità dello xenotrapianto, oltre ad aggiungere un nuovo modo di valutare il carico di malattia. Il successo di questi esperimenti dipende fortemente dalla salute delle cellule trapiantate, poiché le cellule che non sono sane e in fase logaritmica non riescono a propagarsi dopo il trapianto. Anche la durata della sessione di iniezione è un parametro critico. Dopo che le cellule tumorali sono state preparate, è fondamentale completare l'iniezione nel pesce zebra entro 3-4 ore. L'approccio utilizzato in questo studio consente di iniettare un numero maggiore di embrioni durante questo lasso di tempo attraverso la semplice modifica di stadiarli direttamente su un lato su una piastra di agarosio e iniettarli nel tuorlo (Figura 2C, D). Inoltre, è imperativo che venga selezionato l'orifizio dell'ago ottimale in modo che vengano iniettate abbastanza cellule (400-600 cellule) ma che l'orifizio non sia così grande da ferire gli embrioni. Un'altra considerazione è la pressione di iniezione. Troviamo che pressioni superiori a 12-13 psi interrompono il tuorlo degli embrioni, causando la morte. Infine, un'altra variabilità insita in questa procedura è la consistenza dell'iniezione. Le cellule da iniettare si depositano all'estremità dell'ago per iniezione, rendendo difficile un controllo preciso nel bolo di iniezione. Quando le cellule vengono xenotrapiantate, tutti gli embrioni hanno il potenziale per ricevere lo stesso bolo di iniezione, ma in pratica non lo fanno (Figura 3). Il numero di cellule trasferite può variare notevolmente a seconda del comportamento delle cellule tumorali (ad esempio, aggregazione) e del livello di abilità dell'operatore. Abbiamo affrontato questa incertezza attraverso la colorazione CM-Dil/marcatura mCherry, che consente la categorizzazione post-iniezione degli animali che hanno ricevuto un bolo cellulare appropriato e coerente, nonché di quelli che hanno ricevuto un bolo inferiore. La colorazione CM-Dil, ma più efficace con una proteina fluorescente, ha l'ulteriore vantaggio di facilitare il monitoraggio della progressione della malattia, sia al microscopio che alla citometria a flusso (Figura 4 e Figura 5).

Analisi del comportamento tumorale
La progressione del tumore può essere facilmente monitorata utilizzando una semplice microscopia a fluorescenza focalizzata sulla RFP (Figura 4A). Allo stesso modo, il monitoraggio tradizionale della sopravvivenza può essere eseguito mediante l'analisi di Kaplan-Meier (Log-rank e test di Wilcoxon) (Figura 4B). Sorprendentemente, a differenza degli studi di xenotrapianto basati sui topi, in cui ci sono tipicamente 8-10 animali per braccio di studio, utilizzando il metodo zebrafish qui descritto, non è difficile ottenere bracci di studio con più di 60 animali ciascuno (Figura 4B). Ciò migliora notevolmente il potere risolutivo degli studi in vivo . Infine, abbiamo implementato un altro approccio per l'analisi del carico di malattia utilizzando la citometria a flusso. Ciò comporta la distruzione di un numero equivalente di embrioni e l'analisi del contenuto di cellule tumorali della sospensione unicellulare risultante mediante citometria a flusso. Combinando un marcatore di superficie cellulare specifico per il tumore con l'indicatore della proteina fluorescente, i topi/cellule umane xenotrapiantati possono essere identificati con sicurezza mediante citometria a flusso come approccio per valutare il carico di malattia (Figura 5). A questo scopo, le proteine fluorescenti rosse sono superiori poiché le proteine fluorescenti verdi non sono riuscite a fornire un segnale sull'autofluorescenza delle cellule di zebrafish ospiti. Qui, mCherry è stato impiegato per la marcatura e il monitoraggio delle cellule nel corso dello xenotrapianto per l'analisi FACS insieme al CD45. La doppia marcatura ci ha permesso di misurare le differenze nel carico tumorale tra l'inoculazione in bolo buona e quella inferiore (Figura 5B, C).

figure-results-1
Figura 1: Schema di tutte le procedure di xenotrapianto e analisi post-iniezione. (A) Impostazione dell'allevamento, raccolta degli embrioni e 2 giorni dopo la fecondazione (dpf) La morfologia è schematizzata. (B) Preparazione, colorazione e iniezioni di cellule leucemiche per xenotrapianto nel tuorlo di embrioni di zebrafish. (C) Analisi post-xenotrapianto, compresa la sopravvivenza e la citometria a flusso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Immagini rappresentative degli strumenti utilizzati per le iniezioni. (A) Aghi estratti in una piastra di Petri. (B) La piastra di agarosio per la stadiazione dell'embrione. (C, D) Una tavola che mostra gli embrioni stadiati (diagramma rappresentativo nel pannello C e embrioni reali (cerchiati in rosso) nel pannello D) per le iniezioni sulla piastra di carico degli embrioni. Il riquadro nell'angolo in basso a destra del pannello D mostra una vista con un ingrandimento maggiore degli embrioni in stadi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Immagini rappresentative di embrioni xenotrapiantati. Immagini in campo chiaro e immunofluorescenti sono mostrate di cellule CM-Dil colorate (rosse) positive nel tuorlo degli embrioni di casper a 1 dpi (immagine della frizione). Gli embrioni con un bolo inferiore sono indicati con una freccia gialla, mentre quelli con morfologia disturbata sono indicati con un asterisco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Valutazione della progressione della malattia mediante imaging a fluorescenza e analisi di sopravvivenza. (A) Immagine rappresentativa di embrioni xenotrapiantati a 4 dpi e 7 dpi. (B) Il grafico di Kaplan Meier che mostra l'analisi della sopravvivenza di embrioni con due linee leucemiche geneticamente distinte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 5: Analisi citofluorimetrica del carico di malattia in zebrafish xenotrapiantato. (A) Rappresentazione schematica della preparazione della sospensione cellulare e analisi di citometria a flusso. In breve, gli embrioni a 4 dpi vengono disaggregati in sospensioni unicellulari utilizzando tripsina e collagenasi, seguiti da citometria a flusso. (B) Grafici rappresentativi per l'analisi della citometria a flusso in cui l'immagine a sinistra in ciascun pannello è FSC-A v/s SSC-A plot e l'immagine a destra è CD45 v/s segnali mCherry. (C) Grafico a barre che mostra le statistiche cellulari per le cellule xenotrapiantate ottenute dal grafico di Cherry CD45 v/s mCherry per embrioni non iniettati, buoni e inferiori (n = 45, 40 e 40 per ogni replicato (n = 3); valore p * ≤ 0,05, calcolato utilizzando il t-test non accoppiato con la correzione di Welch in GraphPad Prism 9). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Lo xenotrapianto di pesce zebra è emerso come un'alternativa rapida, robusta ed economica agli studi sui topi12. Sebbene siano stati riportati diversi approcci allo xenotrapianto di pesce zebra, il nostro adattamento ha portato a miglioramenti significativi. Oltre a standardizzare i parametri relativi alla procedura, questi miglioramenti si concentrano specificamente sull'accelerazione della velocità con cui possono essere eseguite le iniezioni tumorali, consentendo così un aumento del numero di animali per braccio di studio e utilizzando la marcatura del tumore per monitorare la qualità del comportamento di iniezione e post-iniezione.

Sebbene i miglioramenti apportati a questo metodo qui descritti abbiano un grande potenziale, l'esecuzione di successo di questa strategia richiederà un professionista qualificato e l'ottimizzazione per l'applicazione specifica. Abbiamo impiegato cellule leucemiche. Di conseguenza, l'uso di tumori solidi può comportare ulteriori sfide. Tali tumori possono essere inclini all'aggregazione, che creerebbe variabilità nella consegna del bolo cellulare; tuttavia, anche in tali circostanze, l'etichettatura RFP dovrebbe consentire un adeguato controllo di qualità post-iniezione del bolo. Questo è superiore alla marcatura GFP o ai coloranti verdi, che sono oscurati dall'autofluorescenza. Infine, la standardizzazione qui descritta della maggior parte dei parametri che influenzano il successo (salute dell'embrione, temperatura dell'acquacoltura, orifizio dell'ago, pressione di iniezione, ecc.) riduce al minimo la variabilità di questo processo.

Una considerazione importante per gli esperimenti di xenotrapianto nel pesce zebra è il sito di iniezione. Qui, abbiamo dimostrato che le iniezioni nel tuorlo sono abbastanza facili rispetto ad altri siti tecnicamente più impegnativi, come lo spazio perivitelina34, il dotto di Cuvier35 e l'iniezione intracardica (ventricolo cardiaco)36. Lo svantaggio dell'iniezione del tuorlo è che è un organo vitale per gli embrioni in crescita, quindi è necessario prestare attenzione per garantire che il diametro e la pressione dell'ago siano attentamente controllati in modo che l'embrione non muoia a causa di un trauma da iniezione. L'approccio qui descritto mitiga questa preoccupazione riducendo al minimo le lesioni e scartando eventuali lesioni evidenti o morte di 1 dpi poiché tali problemi non sono correlati alla crescita del tumore. L'ultima considerazione riguardo al sito di iniezione è che microambienti distinti possono avere una maggiore o minore capacità di supportare la propagazione di tumori xenotrapiantati. Di conseguenza, forse le iniezioni di tuorlo possono essere eseguite prima di procedere a iniezioni ortotopiche più impegnative. Il principale vantaggio dell'iniezione di tuorlo è che non richiede una stadiazione precisa dell'embrione e quindi consente un'iniezione più rapida di un numero maggiore di embrioni, preservandone meglio la salute e aumentando la potenza statistica per risolvere le differenze nel comportamento delle cellule tumorali trapiantate.

Il monitoraggio post-iniezione della progressione della malattia è tipicamente valutato attraverso gli effetti sulla sopravvivenza utilizzando l'analisi di Kaplan-Meier37; Tuttavia, i test del carico di malattia possono anche essere molto informativi. Per le cellule trapiantate che rimangono nel sito di iniezione, il carico tumorale può essere quantificato utilizzando vari metodi di microscopia, a condizione che il metodo di marcatura delle cellule tumorali non sia oscurato dall'autofluorescenza29. La colorazione CM-Dil è facilmente risolvibile e non è influenzata dall'autofluorescenza, quindi funziona bene per quantificare il carico tumorale delle cellule localizzate. La sfida si verifica quando le cellule tumorali non rimangono nel sito di iniezione e si disseminano. In questi casi, la citometria a flusso, abbinata a una marcatura genetica indelebile utilizzando proteine fluorescenti rosse, è un modo molto efficace per monitorare il carico di malattia in covate standardizzate di embrioni poiché il tumore marcato può essere analizzato utilizzando colorazioni specie-specifiche diverse dalle cellule del pesce zebra. Un difetto del CM-Dil è che viene diluito dalla divisione cellulare38. Di conseguenza, l'adattamento mediante marcatura genetica dei tumori mediante RFP o mCherry comporta vantaggi significativi. L'espressione di mCherry, abbinata a un anticorpo specifico per il tumore, consente l'identificazione sicura delle cellule trapiantate tra quello che può essere un complesso modello di segnali di fondo forniti dalle cellule del pesce zebra ospite.

Nel loro insieme, l'approccio ottimizzato allo xenotrapianto di pesce zebra e il metodo di analisi utilizzati in questo studio forniscono un miglioramento sostanziale a una piattaforma sperimentale già potente.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH R37AI110985 e P30CA006927, uno stanziamento del Commonwealth della Pennsylvania, della Leukemia and Lymphoma Society e del Bishop Fund. Questo studio è stato supportato anche dalle strutture principali di Fox Chase, tra cui la coltura cellulare, la citometria a flusso e la struttura per animali da laboratorio. Ringraziamo la dottoressa Jennifer Rhodes per aver mantenuto la struttura di zebrafish e microiniezione presso FCCC.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1-fenil 2-tiourea (PTU)SigmaP7629
Filtro cellulare da 70 micronCorning CLS431751-50EA
90 mm Piastra di PetriThermo Fisher ScientificS43565
AgarosioApex bioresearch20-102GP
APC APC anti-topo CD45.2 AnticorpoBiolegend109814
BD FACSymphony A5 Cell AnalyzerBD BiosciencesBD FACSipotonia A5
capillari di calibrazioneSigma P1424-1PAK
Cell tracker CM-dil coloranteInvitrogenC7001
Collageanse IVGibco17104019
Dumont pinza numero 55Strumenti per la scienza11255-20
FBSCorning 35-015-CV
Microscopio a fluorescenzamodello NikonSMZ1500
Capillari in vetro (borosilicato)World precision instruments1B100-4
HBSSCorning 21-023-CV
Helix NP BlueBiolegend425305
Instant Ocean Sea SaltInstant OceanSS15-10
Microscopio otticoNikonmodello SMZ1000
Blu di metileneSigmaM9140-100G
Microloader (punte lunghe per celle di laoding)eppendorf930001007
P1000 estrattore per micropipetteSutter instrumentsmodello P-97
PM 1000 microiniettore cellulareMicroData Instruments, Inc. (MDI)PM1000
Tricaina metanosolfato (Etile 3-amminobenzoato metansolfato)SigmaE10521-10G
Tripsina-EDTA (0,5%), senza fenolo rossoGibco15400054
Zebrafish dieta irradiata per adulti (mangime secco)Zeigler388763

Riferimenti

  1. Sharma, G., Goyal, Y., Bhatia, S. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. Preclinical Animal Models of Cancer: Applications and Limitations. , Springer. Singapore. (2022).
  2. Singhal, S. S., et al. Recent advancement in breast cancer research: Insights from model organisms-Mouse models to zebrafish. Cancers. 15 (11), 2961(2023).
  3. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 8 (1), 160(2023).
  4. Fuochi, S., Galligioni, V. Disease Animal Models for Cancer Research. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , Springer, Humana. New York, NY. (2023).
  5. Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
  6. Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
  7. Zeng, M., et al. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 23 (1), 120(2023).
  8. Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models. Heliyon. 9 (3), e14557(2023).
  9. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
  10. Choe, S. -K., Kim, C. -H. Zebrafish: A powerful model for genetics and genomics. Int J Mol Sci. 24 (9), 8169(2023).
  11. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  12. Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288(2023).
  13. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  14. Hill, D., Chen, L., Snaar-Jagalska, E., Chaudhry, B. Embryonic zebrafish xenograft assay of human cancer metastasis. F1000Res. 7, 1682(2018).
  15. Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
  16. Lin, J., et al. A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy. Blood. 128 (2), 249-252 (2016).
  17. Grissenberger, S., et al. High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma. Cancer Lett. 554, 216028(2023).
  18. Baxi, D. Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. , Springer. Singapore. (2022).
  19. Li, X., Li, M. The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents. Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).
  20. Yin, J., et al. Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery. Pharmaceuticals. 16 (4), 598(2023).
  21. Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish. Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).
  22. Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
  23. Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
  24. Casey, M. J., et al. Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response. J Vis Exp. (123), e55712(2017).
  25. Soh, G. H., Kögler, A. C., Müller, P. A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos. J Vis Exp. (174), e62767(2021).
  26. Martinez-Lopez, M., Póvoa, V., Fior, R. Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis. J Vis Exp. (172), e62373(2021).
  27. Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish. J Vis Exp. (122), e55459(2017).
  28. Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768(2011).
  29. Cabezas-Sáinz, P., Pensado-López, A., Sáinz Jr, B., Sánchez, L. Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment. Cells. 9 (9), 1978(2020).
  30. Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis. Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).
  31. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Oregon. (2000).
  32. Rao, S., et al. Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B. Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).
  33. Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate. Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).
  34. Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing. J Vis Exp. (195), e63744(2023).
  35. Murali Shankar, N., et al. Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer. Front Immunol. 14, 1254821(2023).
  36. Takahi, M., et al. Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart. Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).
  37. Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
  38. Regan, J. L., et al. RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence. iScience. 24 (6), 102618(2021).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Citometria a flussoIniezione cellulareCarico della malattiaAnalisi della sopravvivenza embrionaleMarcatura cellulare fluorescentePreparazione della sospensione cellulareTrapianto di cellule leucemicheRas MAP chinasi

Articoli correlati