Misurazione della colonizzazione batterica sulle radici di Arabidopsis thaliana in condizioni idroponiche

Esistono metodi quantitativi e qualitativi per rilevare la colonizzazione della rizosfera da parte di un singolo ceppo batterico. Per il metodo qualitativo, dovrebbe essere utilizzato un ceppo che esprime costitutivamente la fluorescenza e la distribuzione e l'intensità della fluorescenza dovrebbero essere esaminate al microscopio a fluorescenza o con strumenti confocali laser ^1,2. Queste strategie possono riflettere bene la colonizzazione batterica in situ³, ma non sono accurate come i metodi tradizionali di conteggio su piastra nella quantificazione. Inoltre, a causa della limitazione di visualizzare solo zone radicali parziali al microscopio, a volte può essere influenzato da pregiudizi soggettivi.

Qui descriviamo un metodo quantitativo, che include la raccolta delle cellule batteriche colonizzate e il conteggio delle CFU batteriche su una piastra. Questo metodo si basa sulla diluizione e sulla placcatura mediante la quale è possibile contare i ceppi colonizzati che sono stati strappati dalle radici delle piante e calcolare il numero totale di batteri colonizzati sulla radice ^4,5.

In primo luogo, A. thaliana è stata coltivata in condizioni idroponiche, quindi le cellule batteriche sono state inoculate nella rizosfera a una concentrazione finale di 0,01 OD₆₀₀. I tessuti radicali infetti sono stati raccolti 2 giorni dopo l'inoculazione e lavati in acqua sterile per rimuovere le cellule batteriche non colonizzate. Inoltre, le cellule batteriche colonizzate sulla radice sono state raccolte, diluite in tampone salino tamponato con fosfato (PBS) e piastrate su un terreno di agar Luria-Bertani (LB). Dopo l'incubazione a 37 °C per 10 ore, le singole colonie su piastre LB sono state contate e normalizzate per determinare le cellule batteriche colonizzate sulle radici.

Questo metodo è altamente applicabile, ha una buona ripetibilità ed è più adatto per un'accurata determinazione della colonizzazione batterica della rizosfera.

1. Coltivazione idroponica sterile di A. thaliana

1. Prepara le piantine di A. thaliana .
   1. Preparare il terreno di coltura delle piantine di A. thaliana , che consiste in 1/2 terreno MS (Murashige e Skoog) con il 2% (wt/vol) di saccarosio e lo 0,9% (wt/vol) di agar.
   2. Versare il terreno di sterilizzazione preparato in piastre di Petri quadrate sterili (13 cm x 13 cm) prima della solidificazione. Evitare l'asciugatura all'aria per mantenere l'umidità.
   3. Immergere i semi di A. thaliana in una provetta da microcentrifuga da 2 ml riempita con 1 ml di acqua sterile a 4 °C per oltre 12 ore, quindi sterilizzare i semi con 1 ml di NaClO al 2% (vol/vol) per 2 minuti.
   4. Lavare accuratamente i semi con acqua sterile sei volte per rimuovere la soluzione di NaClO. Semina i semi su piastre di Petri con terreno di coltura MS agar con punta sterile da 1 ml.
   5. Sigilla le piastre di Petri con nastro medico traspirante e mettile verticalmente in un'incubatrice leggera per crescere per 1 settimana. Impostare il rapporto giorno/notte dell'incubatrice luminosa a 16 h/8 h, mantenere la temperatura a 23 °C e l'umidità al 40%-60%.
2. Trapiantare A. thaliana.
   1. Tagliare fori da 5 mm su un coloratore per cellule con pori da 40 μm e sterilizzarli.
   2. Trapiantare tre piante di A. thaliana di 7 giorni attraverso i fori di un colino cellulare e metterle in una piastra a 6 pozzetti contenente 3 ml di terreno liquido sterile 1/2 MS con saccarosio allo 0,5%.
   3. Posizionare le piastre a 6 pozzetti in un'incubatrice leggera (Figura 1A) e incubare per 10 giorni.

2. Coltivazione e inoculazione di batteri

1. Preparare la sospensione batterica per l'inoculazione.
   1. Per il Bacillus velezensis, inoculare le cellule batteriche in terreno LB sterile e incubare a 37 °C agitando a 170 giri/min fino a raggiungere OD₆₀₀ di 0,8-1,2.
   2. Raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione a 6000 x g per 2 min e risospendere le cellule in tampone PBS (2 mM KH₂PO₄, 8 mM Na₂HPO₄, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Ripetere le fasi di centrifugazione e risospensione 3 volte per rimuovere il terreno LB e i metaboliti batterici.
   3. Sospendere le cellule batteriche in un terreno fresco di 1/2 MS ad una concentrazione finale di OD₆₀₀ 0,01. Inoculare le sospensioni batteriche nelle piastre a 6 pozzetti che coltivano piantine di A. thaliana , posizionare le piastre a 6 pozzetti nell'incubatrice leggera e coltivarle per 2 giorni.

3. Misurazione dei batteri colonizzati sulle radici

1. Raccogliere il tessuto radicale e placcare le cellule colonizzate.
   NOTA: Tutti i passaggi devono essere condotti in condizioni gnotobiotiche
   1. Pesare le provette da 2 ml e registrare il peso come W₀.
   2. Raccogliere i tessuti radicali di A. thaliana co-coltivati e lavarli in acqua sterile 3 volte. Metti la radice su carta da filtro per rimuovere l'acqua in eccesso.
   3. Mettere la radice nella provetta da microcentrifuga pesata, pesare le radici insieme alla provetta e registrarla come W₁.
   4. Aggiungere 1 mL di PBS a ciascuna provetta e far vorticare le provette per 8 minuti alla massima velocità.
   5. Diluire le sospensioni con le cellule batteriche colonizzate dalle radici raccolte a 1 x ^10-1-1 x ^10-4 (in base alla capacità di colonizzazione batterica). Stendere le sospensioni batteriche diluite su piastre contenenti terreno di agar LB e incubare a 37 °C per 10 ore.
2. Contare le colonie e normalizzare i dati.
   1. Contare le colonie batteriche sulle piastre LB.
   2. Calcolare i CFU in base alla diluizione corrispondente e normalizzare i dati con peso fresco radicale (W_{1-W 0}). I risultati finali indicano il conteggio delle cellule batteriche colonizzate per grammo di radice a 2 giorni dall'inoculazione (Figura 1B).

Per testare l'accuratezza della capacità di colonizzazione batterica rilevata con questo metodo nella rizosfera di A. thaliana, abbiamo inoculato separatamente Bacillus velezensis SQR9 WT e un mutante derivato Δ8mcp nella rizosfera di A. thaliana . Il Δ8mcp è un mutante che manca di tutti i geni codificanti i chemocettori e ha una colonizzazione significativamente ridotta6. Abbiamo misurato la loro colonizzazione a 2 giorni dopo l'inoculazione con l'attuale test di colonizzazione radicale. I risultati hanno mostrato una significativa riduzione della colonizzazione radicale di Δ8mcp, indicando che questa condizione e questo metodo misurano efficacemente la colonizzazione batterica (Figura 1C).

Figura 1: Coltivazione di A. thaliana e colonizzazione radicale di Bacillus velezensis SQR9 e Δ8mcp. (A) La vista dall'alto di A. thaliana di 7 giorni che cresce in piastre a 6 pozzetti con coloratore di cellule in condizioni idroponiche. (B) La vista laterale di A. thaliana di 7 giorni che cresce in piastre a 6 pozzetti, ogni pozzetto contenente 3 piantine. (C) Colonizzazione di B. velezensis wild-type SQR9 e Δ8mcp misurata utilizzando il saggio presentato. Sono state incluse sei repliche e i dati sono presentati come media ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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