Method Article

Utilizzo di un sistema di perfusione tissutale in vitro per rilevare le attività funzionali dei tubi intestinali isolati in tempo reale

DOI:

10.3791/66243

⸱

July 26th, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Basic Medical College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Medical and Life Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Chengdu Integrated TCM and Western Medicine Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo un metodo per isolare i tubi intestinali di ratto e valutare l'impatto dei farmaci sulla loro tensione, frequenza e ampiezza in vitro. Questo metodo offre un approccio prezioso per i ricercatori che studiano i tubi intestinali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le malattie gastrointestinali, che hanno un'elevata incidenza, rappresentano sfide considerevoli per l'uomo. L'intestino tenue è parte integrante della digestione e dell'assorbimento di alimenti e farmaci e svolge un ruolo cruciale nel trattamento di queste malattie. L'esperimento del movimento del tubo intestinale, un metodo in vitro comune ed essenziale, viene utilizzato per studiare la dinamica gastrointestinale. Ciò include la preparazione del tubo intestinale isolato, nonché la sospensione del tubo intestinale preparato nella vasca da bagno e il suo collegamento a un rilevatore di segnale. Segue la registrazione e l'analisi di una serie di parametri, come la tensione, che possono essere utilizzati per valutare la funzione motoria intestinale, nonché le considerazioni per mantenere attivo il tubo intestinale in vitro. Il programma standardizzato dal campionamento alla raccolta dei dati migliora notevolmente la ripetibilità dei dati sperimentali e garantisce l'autenticità della registrazione della tensione intestinale dopo interventi fisiologici, patologici e farmacologici. Qui presentiamo le principali problematiche in fase sperimentale e un valido protocollo sperimentale di riferimento per lo studio di farmaci che regolano la motilità gastrointestinale.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le malattie gastrointestinali, una condizione prevalente, hanno un grave impatto sulla vita e sulla salute umana1. Il disturbo della motilità gastrointestinale è una parte importante delle malattie gastrointestinali funzionali, che si manifesta principalmente con sintomi debilitanti, svuotamento gastrico ritardato e gravi problemi gastrici2. Può interrompere la coordinazione gastrointestinale, ostacolare lo svuotamento gastrico, influire sull'intolleranza alimentare intestinale e persino causare ostruzione funzionale nell'intestino tenue ocrasso. Per i pazienti sottoposti a chirurgia gastrointestinale, questo disturbo può portare direttamente all'insufficienza intestinale. Inoltre, i disturbi intestinali non sono solo correlati alle malattie gastrointestinali, ma anche ai fattori patogeni di varie altre malattie, come l'epatite e le malattie del sistema nervoso centrale. Le comunità microbiche intestinali svolgono un ruolo cruciale nella fisiologia intestinale, compresa la motilità, che successivamente influenza la colonizzazione all'interno dell'ecosistema microbico4. Man mano che l'infezione da virus dell'epatite B progredisce verso l'epatite B cronica, ci sono vari gradi di cambiamenti nella flora intestinale. La modulazione della flora intestinale ha dimostrato benefici nel trattamento del virus dell'epatite B5. Inoltre, il sistema nervoso centrale può influenzare l'intestino e alterarne la composizione microbica. I recenti progressi nella tecnologia di sequenziamento della microflora hanno scoperto interazioni bidirezionali tra la microflora intestinale e la funzione del sistema nervoso centrale, strettamente associate all'insorgenza e alla progressione delle malattie del sistema nervoso centrale 6,7.

Con l'invecchiamento della società, l'incidenza del disturbo della motilità gastrointestinale è in aumento, legato al declino o alla perdita della funzione neuronale nel sistema nervoso enterico e nell'innervazione intrinseca dell'intestino8. Man mano che la nostra comprensione delle malattie gastrointestinali si amplia, emergono numerose nuove idee e approcci, che potenzialmente portano allo sviluppo di nuovi farmaci. Tuttavia, molte di queste idee sono ancora ipotetiche o attendono risultati positivi degli studi clinici per concretizzarsi 9,10. Metodi di ricerca efficaci sono fondamentali per superare le malattie gastrointestinali. Negli ultimi anni, un'ampia ricerca si è concentrata sui farmaci gastrointestinali e sulla regolazione della motilità. I farmaci gastrointestinali e le dinamiche gastrointestinali sono inseparabili e molti altri farmaci sistemici hanno effetti variabili sulle dinamiche gastrointestinali. Ad esempio, i farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) sono utilizzati per il dolore e l'infiammazione e per rallentare il movimento gastrointestinale, aumentando il rischio di ulcera peptica11. D'altra parte, alcuni antidepressivi possono influenzare la motilità gastrointestinale12. Attualmente, il principale esperimento farmacologico in vitro che studia gli effetti dei farmaci gastrointestinali e di altri farmaci sistemici sulla motilità gastrointestinale è il saggio di movimento intestinale in vitro 13. Simulando le condizioni fisiologiche, osservano l'impatto diretto dei farmaci sulla contrazione e sul rilassamento della muscolatura liscia intestinale, valutandone gli effetti gastrointestinali. Tuttavia, la causa precisa dei disturbi della motilità gastrointestinale rimane poco chiara, probabilmente una complessa interazione di fattori genetici, ambientali, dietetici e neuroendocrini. Di conseguenza, il trattamento dei disturbi della motilità gastrointestinale continua a porre sfide significative.

L'intestino tenue, essendo un sito cruciale per la digestione, l'assorbimento e il metabolismo dei farmaci, ha un'importanza significativa nella funzione gastrointestinale. Di conseguenza, il test del movimento del tubo intestinale isolato è uno strumento essenziale per lo studio delle malattie gastrointestinali. Ciò comporta la preparazione e il posizionamento del tubo intestinale isolato dell'animale in un bagno, il collegamento a uno scambiatore di energia, l'utilizzo di un trasduttore per convertire i movimenti meccanici in segnali elettrici per l'amplificazione e la registrazione da parte di un registratore fisiologico. Vari parametri come la frequenza, l'ampiezza media della vibrazione, la tensione e l'area sotto la curva possono essere misurati per valutare la funzione motoria del tubo intestinale. Questo metodo offre vantaggi quali semplicità, fattibilità economica, facile controllo delle condizioni sperimentali, fattori di influenza minimi, elevata riproducibilità e risultati accurati e affidabili. Inoltre, è particolarmente utile per studiare il meccanismo d'azione dei farmaci. Tuttavia, ci sono notevoli sfide nel funzionamento dell'esperimento del tubo intestinale isolato, ad esempio, l'attività intestinale è difficile da mantenere a lungo. Per affrontare questi problemi e attingere alle esperienze negli esperimenti in vitro , questo articolo fornirà un'introduzione dettagliata ai problemi chiave nel funzionamento sperimentale e presenterà un valido protocollo sperimentale di riferimento per lo studio di farmaci che regolano la motilità gastrointestinale.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo è derivato dalla letteratura precedentemente pubblicata 14,15,16,17. Per il presente studio sono stati utilizzati ratti maschi Sprague Dawley (SD) (260-300 g, 8-10 settimane di età). Il protocollo sugli animali è stato rivisto e approvato dal Comitato di Gestione dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (Record No. 2023017). Prima dell'esperimento, i ratti sono stati istruiti a digiunare per 24 ore. Durante l'esperimento, i ratti sono stati tenuti in una camera per animali e hanno avuto libero accesso a cibo e acqua.

1. Preparazione della soluzione

  1. Preparare una soluzione salina fisiologica (PSS) contenente 118 mM di NaCl, 4,7 mM di KCl, 2,5 mM di CaCl2, 1,2 mM di KH2PO4, 1,2 mM di MgCl2∙6H2O, 25 mM di NaHCO3, 11 mM di D-glucosio e 5 mM di HEPES (vedere la Tabella dei materiali).
  2. Saturare le soluzioni e far bollire con un gas misto di 95% O2 e 5% CO2. Nel frattempo, mantenere i valori di pH della soluzione tra 7,38 e 7,42 con 2 mM di NaOH.
  3. Preraffreddare 1/3 del PSS a 4 °C e preriscaldare il resto a 37 °C per gli esperimenti successivi.
    NOTA: il PSS è stato originariamente preparato a temperatura ambiente nei passaggi 1.1-1.2

2. Dissezione del canale intestinale di ratto

  1. Raccogli piastre di Petri riempite con PSS a 4°C, pinzette chirurgiche e forbici. Somministrare isoflurano al 2% per anestetizzare il ratto attraverso l'inalazione per circa 5 minuti. Verificare che il ratto sia profondamente anestetizzato conducendo un test di pizzicamento delle dita. Se necessario, somministrare ulteriori anestetici. Successivamente, esporre il canale intestinale aprendo la cavità addominale su un tavolo operatorio.
  2. Posizionare rapidamente i tubi dello stomaco e dell'intestino in una capsula di Petri riempita con PSS a 4 °C (pH 7,40) con il 95% di O2 e il 5% di CO2 saturi. Individua il duodeno, che è l'inizio dell'intestino tenue, nel piloro dello stomaco. Usando una pinzetta, solleva delicatamente il tessuto adiacente e taglialo con cura lontano dal bordo dell'intestino con le forbici. Successivamente, dividere l'intestino in segmenti di 1-2 cm; l'intero processo è illustrato nella Figura 1.

3. Sospensione e fissazione del canale intestinale (Figura 2)

  1. Accendere il sistema di perfusione tissutale in vitro e regolare la temperatura del bagno nello strumento a 37 °C. Introdurre il PSS (37 °C) nella vasca da bagno.
  2. Preparare una sutura chirurgica di 15 cm (vedi Tabella dei Materiali) e immergerla in PSS a 4 °C cioè satura con il 95% di O2 + 5% di CO2. Usando la sutura, fissare un'estremità del canale intestinale e utilizzare un gancio per aghi in acciaio per fissare l'altra estremità.
  3. Installare il tubo intestinale. Montare il segmento con il gancio dell'ago in acciaio sul fondo della vasca e fissare l'altra estremità della linea chirurgica al trasduttore. Accendere l'interruttore del gas per consentire alle bolle di emergere nella vasca da bagno.
  4. Aprire il software di acquisizione dati (vedere la Tabella dei materiali) e fare clic su Avvia per assicurarsi che il segnale di percorso corrispondente venga registrato.

4. Normalizzazione

  1. Ruotare l'asse a spirale del bagno in senso antiorario per rilassare i tubi intestinali al loro stato naturale. Fare clic su Setup-Zero All Inputs per assicurarsi che la tensione iniziale del tubo intestinale sia impostata su 0 g nel software.
  2. Ruotare l'asse a spirale del bagno in senso antiorario per portare il valore di tensione a 1 g e stabilizzarlo nel pH = 7,40, 95% O2 + 5% CO2 saturo 37 °C PSS per 30 min.
    NOTA: La normalizzazione del tubo intestinale serve a regolare il suo precarico a uno stato ottimale. Per i campioni di cavità, era necessario un precarico ottimale per mantenere un'attività eccezionale in vitro. Il precarico ottimale del tubo intestinale di ratto era di 1 g18.

5. Rilevamento della reattività

  1. Osservare le onde di contrazione ritmiche spontanee nel software e procedere all'esperimento successivo poiché ciò indica una risposta sufficiente.

6. Osservazione sperimentale

  1. Aggiungere il farmaco in esame (come l'acetilcolina, ecc.) al bagno per studiare l'effetto del farmaco sulla funzione del tubo intestinale.
    NOTA: L'effetto del farmaco è stato valutato confrontando i cambiamenti pre e post somministrazione nella curva di costrizione intestinale. Quando il farmaco viene aggiunto, è opportuno aumentare la bolla per mescolare il farmaco, quindi regolare la bolla alla normalità dopo la miscelazione.

7. Analisi dei dati

NOTA: Il sistema di perfusione tissutale in vitro ha quattro canali che possono condurre simultaneamente test sugli effetti di quattro farmaci identici o diversi su quattro provette intestinali. Poiché i parametri sperimentali e i metodi di analisi sono gli stessi per tutti i canali, un canale viene selezionato come esempio per l'analisi dei dati.

  1. Arrestare il software di acquisizione dati ed eseguire l'analisi dei dati su questo software di acquisizione dati. Modificare la scheda dati e selezionare i parametri di analisi come segue: Fare clic su Window-Data Pad e scegliere la tensione media per il canale.
  2. Selezionare la curva di contrazione prima della somministrazione e fare clic su Aggiungi al data pad; selezionare la curva di contrazione dopo la somministrazione e fare clic su Aggiungi al data pad. Il valore medio di tensione prima e dopo la somministrazione apparirà a turno sul data pad.
  3. Fare clic su Window-Data Pad per copiare i dati su altri software di analisi statistica (vedere la Tabella dei materiali) per l'analisi statistica.
  4. Analizza altri parametri, come l'ampiezza media, la frequenza media e l'integrale (area sotto la curva), sostituisci semplicemente la tensione media con il rispettivo parametro e l'operazione è la stessa dei passaggi 6.1-6.3.
  5. Salva curva di contrazione: Seleziona la curva di contrazione, fai clic su Modifica-Copia dati Labchart per copiare i dati nel software di disegno (vedi la Tabella dei materiali) per disegnare la curva di contrazione.

8. Trattamento post-chirurgico

  1. Dopo l'intervento chirurgico, sopprimere gli animali seguendo protocolli approvati istituzionalmente.
    NOTA: Per il presente studio, gli animali sono stati soppressi inalando un eccesso di isoflurano.

Results

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La prima parte dello studio si concentra sul processo di separazione dei tubi intestinali isolati dal corpo e sulla loro conversione in tubi di 2 cm in vitro. Questo processo è illustrato in dettaglio nella Figura 1. La seconda parte prevede la sospensione e la standardizzazione dell'anello del tubo intestinale isolato. Il successo di questo processo è dimostrato nella Figura 2, che mostra la contrazione ritmica automatica di un tubo normale. Infine, lo studio esamina gli effetti di agenti contrattili e rilassanti rappresentativi sull'anello del tubo intestinale isolato. È stato riscontrato che l'acetilcolina (0,3 μmol/L) e il cloruro di bario (1,2 mmol/L) aumentavano la tensione in queste provette, mentre l'atropina (300 μmol/L), l'epinefrina (1 μmol/L) e la nifedipina (10 μmol/L) inibivano la loro tensione, come illustrato nella Figura 3.

Questo metodo introduce principalmente la determinazione della funzione motoria del tubo intestinale isolato. I movimenti intestinali sono influenzati da una serie di fattori e la maggior parte degli effetti viene esercitata attraverso i recettori nell'intestino. Nel tratto gastrointestinale sono presenti vari recettori, tra cui i recettori M colinergici, i recettori α e β adrenergici, i recettori 5-HT, i recettori dell'istamina e i recettori ormonali gastrointestinali19. Lo spasmo nell'intestino isolato può essere causato dall'azione dell'acetilcolina sui recettori M. Questo effetto può essere bloccato dall'atropina, che agisce come agente bloccante per i recettori M (Figura 3A). Tuttavia, lo spasmo nella muscolatura liscia del segmento intestinale, causato dall'ingresso di ioni bario nel cloruro di bario e dal loro legame con la calmodulina, non può essere bloccato dall'atropina (Figura 3B). L'epinefrina funziona come agonista sia per i recettori α che per quelli β (Figura 3C). Eccita il recettore α e il recettore β2 dell'intestino tenue, con conseguente rilassamento della muscolatura liscia e indebolimento della contrazione dell'intestino tenue. Di conseguenza, la peristalsi è rallentata e il tasso di assorbimento è ridotto. Al contrario, la nifedipina previene il flusso interno di Ca2+ e favorisce il rilassamento intestinale (Figura 3D). Questo aiuta ad alleviare gli spasmi intestinali, a diminuire la pressione intestinale e a facilitare l'assorbimento dell'acqua nell'intestino.

figure-results-1
Figura 1: L'isolamento dei tubi intestinali. (A) tubi intestinali nei ratti; (B) I tubi intestinali sono stati rimossi dal corpo e posti in una capsula di Petri contenente una soluzione salina fisiologica a 4 °C; (C) tubo intestinale dopo la rimozione del tessuto circostante; (D) Tubo intestinale lungo 2 cm utilizzato nell'esperimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Il processo di sospensione e standardizzazione di anelli di tubi intestinali isolati. (A) Sistema di perfusione tissutale in vitro (vedi Tabella dei Materiali); (B) fissaggio di entrambe le estremità del tubo intestinale con un uncino di ferro e una linea chirurgica in una capsula di Petri contenente una soluzione salina fisiologica a 4 °C; C) fissaggio del tubo intestinale in quello dei bagni contenenti soluzione salina fisiologica a 37 °C; (D) fornire il precarico e registrare la forma d'onda normale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Effetti dei farmaci su tubi intestinali isolati. Effetti di (A) acetilcolina (0,3 μmol/L) e atropina (300 μmol/L), (B) cloruro di bario (1,2 mmol/L), (C) epinefrina (1 μmol/L) e (D) nifedipina (10 μmol/L) su provette intestinali isolate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

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La motilità gastrointestinale è ottenuta da una serie di contrazioni e rilassamenti della muscolatura liscia coordinati con precisione. Questo processo comporta la contrazione ritmica di un gruppo di gruppi muscolari, la contrazione coordinata di più gruppi e la speciale contrazione propulsiva20,21. L'insorgenza di disturbi della motilità gastrointestinale può essere associata a disfunzioni a diversi livelli, come il sistema nervoso centrale, il sistema nervoso autonomo, il sistema nervoso enterico e la muscolatura liscia gastrointestinale. Queste strutture tissutali funzionano insieme attraverso il rilascio di vari neurotrasmettitori e fattori umorali, che si legano ai recettori corrispondenti per svolgere diverse funzioni fisiologiche22. Pertanto, lo studio del meccanismo locale dell'azione dei farmaci è essenziale e la conduzione di esperimenti in vitro sull'intestino tenue può fornire informazioni più accurate escludendo l'interferenza di sostanze estranee e la regolazione del sistema nervoso centrale.

Campioni isolati di ileo di cavia, digiuno di coniglio e duodeno sono comunemente usati negli animali da esperimento. Inoltre, l'ileo, il duodeno e il digiuno di ratti e gatti possono essere utilizzati anche per esperimenti in vitro . Questo metodo è adatto per tessuti isolati. La muscolatura liscia intestinale ha le caratteristiche della contrazione ritmica automatica ed è interessata dal plesso nervoso nella parete intestinale. I tubi intestinali isolati di molti animali possono mantenere la loro funzione motoria spontanea in un ambiente di sopravvivenza adeguato. L'esperimento in vitro con provetta intestinale presenta i vantaggi di un funzionamento semplice, un facile controllo delle condizioni sperimentali, pochi fattori di influenza, buona riproducibilità, risultati accurati e affidabili ed è più favorevole alla discussione del meccanismo d'azione del farmaco. Inoltre, questo metodo è considerato economico e fattibile.

L'esperimento in vitro con tubo intestinale ha anche i suoi limiti, come l'utilizzo di preparati grezzi di medicina cinese non purificati che contengono impurità, ioni inorganici, saponine e tannini, che possono influire sull'affidabilità dell'esperimento. Pertanto, è necessario valutare appieno l'influenza delle impurità e dei fattori fisico-chimici sui risultati sperimentali, incluso il pH del liquido e varie particelle elettrolitiche e di impurità. Inoltre, è necessario migliorare la stabilità dello strumento sperimentale in vitro e la tecnica di conservazione del tubo intestinale in vitro. Quando si progettano esperimenti in vitro, è essenziale considerare se i farmaci o i preparati utilizzati soddisfano i requisiti di questi esperimenti (ad esempio, i livelli di impurità).

In questo metodo, ci sono diverse precauzioni che devono essere osservate. Per cominciare, il tubo intestinale deve essere rimosso dalla cavità addominale del ratto e immerso in un PSS freddo prima dell'esperimento. Inoltre, è importante tagliare l'intero tubo in più pezzi e conservarli in frigorifero, riducendo al minimo qualsiasi stimolazione all'intestino. Durante il processo di dosaggio, è fondamentale assicurarsi che il tubo dosatore non entri in contatto con la linea su cui è sospeso il tubo intestinale. Inoltre, la quantità di farmaco aggiunta al bagno deve essere accurata e il farmaco non deve essere aggiunto alla parete del bagno o direttamente al tubo intestinale per evitare di influenzare i risultati. Quando si risciacqua il tubo intestinale, è necessario utilizzare un approccio delicato e evitare il risciacquo ad alta pressione per prevenire la contrattura dei tessuti. Si consiglia di maneggiare il tubo intestinale con una pinzetta ed evitare di esporlo all'aria per periodi prolungati per evitare qualsiasi perdita di attività.

Questo articolo presenta una dimostrazione della metodologia sperimentale per esperimenti con tubi intestinali isolati, utilizzando gli effetti di vari farmaci tradizionali che agiscono sui recettori intestinali per illustrare il loro impatto sul movimento del tubo intestinale, che fornisce un approccio efficace per studiare il meccanismo d'azione dei farmaci che regolano la motilità gastrointestinale sul tratto gastrointestinale.

Disclosures

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dallo Special Talent Program dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu per "Xinglin Scholars and Discipline Talents Research Promotion Plan" (33002324).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetilcolina Sigma, USAA6625
atropinaSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, CinaIA06501
cloruro di barioMacklin Biochemical Co., Ltd., Shanghai, CinaB861682
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, CinaA501330
D-glucosioSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, CinaA610219
software di disegnoGraphPad Software, San Diego, California, USA—
EpinefrinaSigma, USAE4642
HEPES Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, CinaS3872
Sistema di perfusione tissutale in vitroPowerLab, ADInstruments, AustraliaML0146
KClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, CinaA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, CinaA100781
LabChart Professional versione 8.3 ADInstruments, Australia—
MgCl2· 6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, CinaA100288
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, CinaA100241
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, CinaA100865
nifedipinaMacklin Biochemical Co., Ltd., Shanghai, CinaAnalisi statistica N5087
softwareGraphPad Software, San Diego, California, Stati Uniti...
Suture chirurgicheJohnson, USA—

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