Interferenza dell'RNA nel parassitoide dell'uovo, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Long-xi Zhang; Qian-jin Dong; Shuai Yang; Wu-nan Che; Li-sheng Zhang; Jin-cheng Zhou; Hui Dong

doi:10.3791/66250

Articolo metodologico

Interferenza dell'RNA nel parassitoide dell'uovo, Trichogramma dendrolimi Matsumura

DOI:

10.3791/66250

⸱

21 novembre 2023

Long-xi Zhang¹ , Qian-jin Dong¹ , Shuai Yang¹ , Wu-nan Che¹ , Li-sheng Zhang² , Jin-cheng Zhou¹^,² , Hui Dong¹

¹College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, ²State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences

In questo articolo

Sommario

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La manipolazione dell'interferenza dell'RNA (RNAi) rappresenta una sfida formidabile in molte specie di parassitoidi di dimensioni ridotte, come le vespe Trichogramma . Questo studio ha delineato un metodo RNAi efficiente in Trichogramma denrolimi. La presente metodologia fornisce un modello robusto per lo studio della regolazione genica nelle vespe Trichogramma .

Abstract

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I parassitoidi dell'uovo, Trichogramma spp, sono riconosciuti come efficaci agenti di controllo biologico contro vari parassiti lepidotteri in agricoltura e foreste. Gli stadi immaturi della prole di Trichogramma si sviluppano all'interno dell'uovo ospite, mostrando una notevole piccolezza (circa 0,5 mm di lunghezza da adulto). La metodologia dell'interferenza dell'RNA (RNAi) è emersa come uno strumento cruciale per chiarire le funzioni dei geni in numerosi organismi. Tuttavia, la manipolazione dell'RNAi in alcune piccole specie di parassitoidi, come Trichogramma, ha generalmente posto sfide significative. In questo studio, presentiamo un metodo RNAi efficiente in Trichogramma denrolimi. La procedura delineata comprende l'acquisizione e l'isolamento di singoli campioni di T. dendrolimi da uova ospiti, la progettazione e la sintesi di RNA a doppio filamento (dsRNA), il trapianto e la coltivazione in vitro di pupe di T. dendrolimi , la micro-iniezione di dsRNA e la successiva valutazione del knockdown del gene bersaglio attraverso l'analisi RT-qPCR. Questo studio fornisce una procedura completa e visivamente dettagliata per condurre esperimenti di RNAi in T. dendrolimi, consentendo così ai ricercatori di studiare la regolazione genica in questa specie. Inoltre, questa metodologia è adattabile per studi di RNAi o micro-iniezioni in altre specie di Trichogramma con piccoli aggiustamenti, rendendola un prezioso riferimento per condurre esperimenti di RNAi in altre specie endoparassitarie.

Introduzione

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Trichogramma spp. è un gruppo di parassitoidi delle uova che sono stati ampiamente utilizzati come agenti di controllo biologico altamente efficienti contro un ampio spettro di parassiti lepidotteri negli ecosistemi agricoli e forestali di tutto il mondo 1,2,3,4. L'applicazione di Trichogramma allevato in massa fornisce un approccio ecologico per la gestione sostenibile dei parassiti ^5,6,7. La comprensione della biologia molecolare....

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Protocollo

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NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, strumenti, software e reagenti utilizzati in questo protocollo.

1. Raccolta e mantenimento della coltura degli insetti

Far aderire un gruppo di ~5.000 uova di Corcyra cephalonica (Stainton) su un cartoncino di 9 cm per 16 cm utilizzando una soluzione 1:5 (v/v) di gomma arabica in polvere e acqua^25,26.
NOTA: Evitare di attaccare troppe uova ospiti alla scheda in quanto il sovraffollamento rende impraticabile le successive procedure di trasferiment....

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Risultati

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Il tasso di emergenza delle pupe di T. denrolimi iniettate con dsFerhch è stato significativamente inferiore a quello di quelle iniettate con dsGFP o di quelle senza iniezione (Tabella 1). Tra le vespe emerse, il 51,85% delle vespe T. denrolimi sottoposte a dsFerhch ha sviluppato piccole ali deformate. Le vespe deformi non sono state osservate nelle vespe iniettate con dsGFP o senza alcuna iniezione (Tabella 1). Inoltre, gli addomi de.......

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Discussione

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Le vespe Trichogramma sono riconosciute come efficaci agenti di controllo biologico, mirati specificamente a una serie di parassiti lepidotteri in agricoltura e silvicoltura¹. Queste minuscole vespe subiscono i loro stadi immaturi all'interno dell'uovo ospite, una caratteristica che presenta sfide nella conduzione di esperimenti RNAi ^5,18. Questo studio offre una guida visiva completa per la conduzione di esperimenti di RNAi in

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata finanziata dai progetti della National Natural Science Foundation of China (32172476, 32102275), dal Programma di innovazione tecnologica e scientifica agricola (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) e dai Fondi centrali che guidano lo sviluppo scientifico e tecnologico locale (XZ202301YD0042C).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2x ES Taq MasterMix (Dye)	Cowin Biotech, China	CW0690H	Per amplificare le sequenze di dsRNA
20x PBS Buffer, trattato con DEPC (7.2-7.6)	Sangon Biotech, China	B540627-0500	Per diluire la striscia di agar dsRNA
	Shishi Globe Agar Industries Co., Ltd, China	n/a	Per produrre terreno di coltura
Ampicillina sodica	Sangon Biotech, Cina	A610028	Per fare terreno di coltura
Bioer Bagno metallico a temperatura costante	BIOER, Cina	MB-102	Per sintetizzare il dsRNA
Capillare in vetro borosilicato	WPI, USA	1B100-4	Per tirare l'ago di vetro capillare
Banco pulito	Airtech, Cina	SW-CJ-1FD	Per estrarre l'RNA
Doppia acqua distillata	Sangon Biotech, Cina	A500197-0500	Per diluire la camera di test ambientale del cDNA
	Panasonic, Giappone	MLR-352H-PC	Per la coltura T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge	Eppendrof, Germania	5418R	Per conservare il contenuto di RNA
Eppendorf FemtoJet 4i	Eppendrof, Germania	FemtoJet 4i	Per iniettare T. denrolimi
Eppendorf Centrifuga refrigerata	Eppendrof, Germania	5810R	Soluzione
etanolo per centrifuga (75%, senza RNasi)	Aladdin, Cina	M052131-500ml	Per estrarre
kit di estrazione su gel	Omega, USA	D25000-02	Per estrarre il cDNA
GUM Arabico	Solarbio, Cina	CG5991-500g	Per fare la carta dell'uovo
Isopropyl alchohol	Aladdin, China	l'RNA
Estrattore per micropipette basato su laser	SUTTER, USA	P-2000	Per tirare l'ago di vetro capillare
Microloader	Eppendrof, Germania	20 µ L	Per caricare dsRNA
Macinatore di tessuti multicampione	LICHEN, Cina	LC-TG-24	Per macinare T. denrolimi
Needle Grinder	SUTTER, USA	BV-10-E	Per macinare l'ago di vetro capillare
Acqua senza nucleasi	Sangon Biotech, Cina		Per diluire l'RNA
OLYMPUS Microscopio	OLYMPUS, Giappone	XZX16	Per osservare la macchina PCR di T. denrolimi
	Bio-rad, USA	S-1000	Per l'amplificazione del DNA
PowerPac Basic	Bio-rad, USA	PowerPacTM Basic	Per rilevare la qualità del dsRNA
Primer di dsGFP (Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer di dsGFP (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG
Primer di Ferhch for qPCR (Forward)			TGAAGAGATTCTGCGTTCTCTCTCT
Primer di Ferhch for qPCR ( Reverse)			CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer di Ferhch for RNAi (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC
Primer di Ferhch for RNAi(Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer di FoxO for qPCR (Forward)			CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer di FoxO per qPCR (inverso)			TGCTGTCGCCCTTGTCCT
Kit di reagenti PrimeScript RT con gomma per gDNA (Perfect Real Time)	TaKaRa, Giappone	RR047A
PCR quantitativa in tempo reale	Bio-rad, USA	CFX 96 Touch	Per eseguire la reazione a catena della polimerasi trascrittasi inversa (RT-PCR)
		progettazione di primer e sonde per PCR in tempo reale (TaqMan)	https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System	Promega, USA	P1700	Per sintetizzare dsRNA in vitro
TB Green Premix Ex TaqTM (Til RnaseH Plus)	TaKaRa, Giappone	RR820A	Per eseguire RT-qPCR
Triclorometano	KESHI, Cina	GB/T682-2002	Per estrarre
reagente RNA TRIzol	Ambion, USA	15596018	Per estrarre il contenuto totale di RNA dai campioni
Congelatore a bassissima temperatura	Thermo, USA	Forma 911

di il di RNA 80109218 Per estrarre Strumento di il

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
Zhou, J. C., et al.

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RNA Interference Trichogramma Dendrolimi Egg Parasitoid Gene Knockdown Double Stranded RNA Micro Injection Host Egg Parasitization RT qPCR Analysis Ferritin Heavy Chain Biological Control

Interferenza dell'RNA nel parassitoide dell'uovo, Trichogramma dendrolimi Matsumura

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