Modellazione di ligandi in mappe derivate dalla criomicroscopia elettronica

Summary

Questo protocollo introduce gli strumenti disponibili per la modellazione di ligandi a piccole molecole nelle mappe cryoEM di macromolecole.

Abstract

Decifrare le interazioni proteina-ligando in un complesso macromolecolare è fondamentale per comprendere il meccanismo molecolare, i processi biologici sottostanti e lo sviluppo di farmaci. Negli ultimi anni, la microscopia elettronica criogenica su campione (cryoEM) è emersa come una potente tecnica per determinare le strutture delle macromolecole e per studiare la modalità di legame del ligando a risoluzione quasi atomica. L'identificazione e la modellazione di molecole non proteiche nelle mappe cryoEM è spesso impegnativa a causa della risoluzione anisotropa attraverso la molecola di interesse e del rumore intrinseco nei dati. In questo articolo, i lettori vengono introdotti a vari software e metodi attualmente utilizzati per l'identificazione dei ligandi, la costruzione di modelli e il perfezionamento delle coordinate atomiche utilizzando macromolecole selezionate. Uno dei modi più semplici per identificare la presenza di un ligando, come illustrato con l'enzima enolasi, è quello di sottrarre le due mappe ottenute con e senza il ligando. È probabile che la densità extra del ligando risalti nella mappa delle differenze anche a una soglia più alta. Ci sono casi, come mostrato nel caso del recettore metabotropico del glutammato mGlu₅, in cui tali semplici mappe di differenza non possono essere generate. Il metodo recentemente introdotto per derivare la mappa di omissione Fo-Fc può servire come strumento per convalidare e dimostrare la presenza del ligando. Infine, utilizzando come esempio la ben studiata β-galattosidasi, viene analizzato l'effetto della risoluzione sulla modellazione dei ligandi e delle molecole di solvente nelle mappe cryoEM e viene presentata una prospettiva su come la cryoEM può essere utilizzata nella scoperta di farmaci.

Introduction

Le cellule svolgono le loro funzioni eseguendo innumerevoli reazioni chimiche simultaneamente e in modo indipendente, ciascuna meticolosamente regolata per garantire la loro sopravvivenza e adattabilità in risposta a stimoli ambientali. Ciò si ottiene mediante il riconoscimento molecolare, che consente alle biomolecole, in particolare alle proteine, di formare complessi transitori o stabili con altre macromolecole e con piccole molecole o ligandi¹. Pertanto, le interazioni proteina-ligando sono fondamentali per tutti i processi in biologia, che includono la regolazione dell'espressione e dell'attività proteica, il riconoscimento di substrati e cofattori da parte degli enzimi, nonché il modo in cui le cellule percepiscono e trasmettono i segnali ^1,2. Una migliore comprensione delle proprietà cinetiche, termodinamiche e strutturali del complesso proteina-ligando rivela le basi molecolari dell'interazione tra ligando e facilita anche la progettazione razionale di farmaci ottimizzando l'interazione e la specificità dei farmaci. Un approccio economico e più veloce allo studio dell'interazione proteina-ligando consiste nell'utilizzare il docking molecolare, che è un metodo computazionale che esamina virtualmente una vasta gamma di piccole molecole e prevede la modalità di legame e l'affinità di questi ligandi per le proteine bersaglio³. Tuttavia, le prove sperimentali provenienti da strutture ad alta risoluzione determinate dalla diffrazione a raggi X (XRD), dalla risonanza magnetica nucleare (NMR) o dalla criomicroscopia elettronica (cryoEM) forniscono la prova essenziale per tali previsioni e aiutano nello sviluppo di attivatori o inibitori più nuovi e più efficaci per un determinato bersaglio. Questo articolo utilizza l'abbreviazione "cryoEM" come viene comunemente chiamata la tecnica. Tuttavia, c'è un dibattito in corso sulla scelta della nomenclatura corretta e, recentemente, il termine criogenico-campione Electron Microscopia (cryoEM) è stato proposto per indicare che il campione è a temperatura criogenica e visualizzato con elettroni⁴. Allo stesso modo, le mappe derivate dalla cryoEM sono state chiamate potenziale elettronico, potenziale elettrostatico o potenziale di Coulomb e, per semplicità, qui usiamo le mappe cryoEM 5,6,7,8,9,10.

Sebbene l'XRD sia stata la tecnica gold standard nella determinazione della struttura ad alta risoluzione dei complessi proteina-ligando, la cryoEM post-rivoluzione¹¹ ha guadagnato slancio, come indicato dall'ondata di mappe di potenziale di Coulomb o mappe crioEM depositate nel database di microscopia elettronica (EMDB)^12,13 negli ultimi anni¹⁴. A causa dei progressi nella preparazione dei campioni, nell'imaging e nei metodi di elaborazione dei dati, il numero di deposizioni di Protein Data Bank (PDB)¹⁴ che utilizzano cryoEM è aumentato dallo 0,7% al 17% tra il 2010 e il 2020, con circa il 50% delle strutture riportate nel 2020 determinate con una risoluzione di 3,5 Å o migliore^{di 15,16}. La CryoEM è stata rapidamente adottata dalla comunità della biologia strutturale, compresa l'industria farmaceutica, in quanto consente lo studio di macromolecole biologiche flessibili e non cristalline, in particolare proteine di membrana e complessi multiproteici, a risoluzione quasi atomica, superando il processo di cristallizzazione e ottenendo cristalli ben diffranti necessari per la determinazione della struttura ad alta risoluzione mediante XRD.

Una modellazione accurata del ligando nella mappa cryoEM è fondamentale, in quanto funge da modello del complesso proteina-ligando a livello molecolare. Esistono diversi strumenti automatizzati per la costruzione di ligandi utilizzati nella cristallografia a raggi X che dipendono dalla forma e dalla topologia della densità del ligando al fine di adattare o costruire il ligando nella densità elettronica 17,18,19,20. Tuttavia, se la risoluzione è inferiore a 3 Å, questi approcci tendono a produrre risultati meno desiderabili perché le caratteristiche topologiche da cui dipendono per il riconoscimento e la costruzione diventano meno definite. In molti casi, questi metodi si sono dimostrati inefficaci nel modellare accuratamente i ligandi in mappe cryoEM, poiché queste mappe sono state determinate nell'intervallo di risoluzione medio-bassa, tipicamente tra 3,5 Å-5 Ź⁷.

Il primo passo nella determinazione della struttura 3D di un complesso proteina-ligando mediante cryoEM prevede la co-purificazione del ligando con la proteina (quando il ligando ha un'elevata affinità di legame con la proteina) o l'incubazione della soluzione proteica con il ligando per un periodo specifico prima della preparazione della griglia. Successivamente, un piccolo volume di campione viene posizionato su una griglia TEM forata pulita al plasma, seguito dal congelamento rapido in etano liquido e infine dall'imaging con un crio-TEM. Le immagini di proiezione 2D da centinaia di migliaia a milioni di singole particelle vengono mediate per ricostruire una mappa del potenziale di Coulomb tridimensionale (3D) della macromolecola. L'identificazione e la modellazione di ligandi e molecole di solvente in queste mappe pone sfide significative in molti casi a causa della risoluzione anisotropa in tutta la mappa (cioè, la risoluzione non è uniforme in tutta la macromolecola), della flessibilità nella regione in cui il ligando è legato e del rumore nei dati. Molti degli strumenti di modellazione, perfezionamento e visualizzazione che sono stati sviluppati per XRD vengono ora adattati per l'uso in cryoEM per gli stessi scopi 18,19,20,21. In questo articolo viene presentata una panoramica dei vari metodi e software attualmente utilizzati per identificare i ligandi, costruire modelli e perfezionare le coordinate derivate dalla crioEM. È stato fornito un protocollo passo-passo per illustrare i processi coinvolti nella modellazione dei ligandi utilizzando specifici complessi proteina-ligando con risoluzione e complessità variabili.

Il primo passo nella modellazione dei ligandi nelle mappe cryoEM include l'identificazione della densità del ligando (non proteico) nella mappa. Se il legame del ligando non induce alcun cambiamento conformazionale nella proteina, allora il calcolo di una semplice mappa di differenza tra il complesso proteina-ligando e l'apo-proteina evidenzia essenzialmente le regioni di densità extra, suggerendo la presenza del ligando. Tali differenze possono essere osservate immediatamente, poiché sono necessarie solo due mappe, e anche mappe intermedie durante il processo di affinamento 3D possono essere utilizzate per verificare se il ligando è presente. Inoltre, se la risoluzione è sufficientemente alta (<3,0 Å), la mappa delle differenze può anche fornire informazioni sulla posizione delle molecole d'acqua e degli ioni che interagiscono con il ligando e i residui proteici.

In assenza della mappa apo-proteica, è ora possibile utilizzare Servalcat²², che è disponibile come strumento autonomo ed è stato anche integrato nella suite software CCP-EM ^23,24 come parte del perfezionamento di Refmac e nella versione^25,26 di CCP4 8.0. Servalcat consente il calcolo di una mappa di differenza ponderata FSC (Fo-Fc) utilizzando come input le semimappe non nitide e il modello dell'apoproteina. La mappa di omissione Fo-Fc rappresenta la disparità tra la mappa sperimentale (Fo) e la mappa derivata dal modello (Fc). In assenza di un ligando nel modello, una densità positiva in una mappa Fo-Fc che si sovrappone alla mappa EM sperimentale suggerisce tipicamente la presenza del ligando. L'ipotesi qui è che la catena proteica sia ben adattata nella mappa e la densità positiva rimanente indichi la posizione del ligando. Tuttavia, è importante esaminare meticolosamente se la densità positiva deriva da imprecisioni di modellazione, come il rotamero sbagliato di una catena laterale proteica.

Il secondo passo consiste nell'ottenere o creare un file di coordinate cartesiane del legante con una geometria ben definita dalle informazioni chimiche disponibili. I ligandi standard (ad esempio, ATP e NADP⁺) già disponibili nella libreria di monomeri CCP4 possono essere utilizzati per il raffinamento recuperando i file di coordinate e geometrie tramite il loro codice di accesso ai monomeri. Tuttavia, per i ligandi sconosciuti o non standard, sono disponibili vari strumenti per creare i file di geometria. Alcuni degli esempi includono l'eLBOW²⁷ - (generatore di ligandi elettronici e banco di ottimizzazione) in Phenix²⁸, Lidia - uno strumento integrato in Coot²⁹, JLigand/ACEDRG ^30,31, CCP-EM^23,24, Ligprep^32-un modulo di Glide all'interno della suite Schrodinger. Il file di coordinate del ligando viene quindi inserito nella densità, guidato sia dalla mappa sperimentale cryoEM che dalla mappa delle differenze in Coot. Questo è seguito dal raffinamento nello spazio reale in Phenix²⁸ o dal raffinamento reciproco in Refmac³³. È necessaria una workstation Linux o un laptop dotato di una buona scheda grafica e del software sopra menzionato. La maggior parte di questi programmi sono inclusi in varie suite. CCP-EM²⁴ e Phenix²⁸ sono disponibili gratuitamente per gli utenti accademici e includono una varietà di strumenti utilizzati in questo articolo, tra cui Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, ecc. Allo stesso modo, Chimera³⁷ e ChimeraX³⁸ forniscono licenze gratuite agli utenti accademici.

Protocol

1. Modellazione del fosfoenolpiruvato (PEP) nell'enolasi da Mycobacterium tuberculosis

1. Identificazione della densità del ligando nella mappa cryoEM del complesso PEP-enolasi
   1. Scarica le semimappe non nitide (emd_30988_additional_1.map e emd_30988_additional_2.map) dell'apo-enolasi dai dati aggiuntivi in EMDB (vedi Tabella dei materiali).
   2. Apri ChimeraX (vedi Tabella dei Materiali). Apri le semimappe dell'apo-enolasi facendo clic su Apri dalla barra degli strumenti e selezionando i nomi dei file. Digita vop add #1 #2 nella riga di comando per combinare entrambe le semimappe per ottenere la mappa non nitida apo-enolasi.
      NOTA: #1 e #2 denotano le due semimappe per l'enzima apo-enolasi, come menzionato nel passaggio 1.1.1.
   3. Rinomina la mappa combinata (ID mappa ChimeraX: #3) digitando rename #3 Apo-enolase-unsharpened-map. Colora la mappa di grigio dal pannello del modello. La mappa indica che l'enolasi è ottamerica nella soluzione con simmetria D4.
   4. Ripetere i passaggi 1.1.1-1.1.3 utilizzando le seguenti semimappe emd_30989_additional_1.map (ID mappa: 4) e emd_30989_additional_2.map (ID mappa: 5) per ottenere PEP-enolase-unsharpened-map (ID mappa: #6).
   5. Per calcolare una mappa delle differenze, prima adattare le due mappe (mappe non nitide PEP-enolasi e apo-enolasi dal passaggio 1.1.3 e dal passaggio 1.1.4) l'una sull'altra facendo clic su Adatta (mappa nella mappa) nel pannello Mappa (barra degli strumenti) in ChimeraX.
      NOTA: la normalizzazione non viene eseguita tra le due mappe. In alcuni casi, potrebbe essere necessaria la normalizzazione per portare le mappe alla stessa scala.
   6. Sottrai la mappa PEP-enolasi dalla mappa apo-enolasi digitando vop sottrai #6 #3 nella riga di comando.
      NOTA: #6 = Mappa non nitida PEP-enolasi, #3 = Mappa non nitida Apo-enolasi.
   7. Colora la mappa sottratta (ID mappa: 7) in verde, denotando la densità positiva (secondo la convenzione della cristallografia a raggi X)³⁹.
   8. Scarica le coordinate di M. tuberculosis octameric enolase (PDB: 7e4x) dalla Protein Data Bank (PDB), fai clic su Apri dalla barra degli strumenti e seleziona il nome del file.
   9. Rinominare il modello 7e4x.pdb digitando rename #8 Apo_enolase.pdb nella riga di comando. #8 indica il Apo_enolase.pdb in ChimeraX.
   10. Seleziona il modello dal pannello del modello. Fare clic con il pulsante destro del mouse dalla barra degli strumenti. Fare clic su Sposta molecola per posizionare il modello in prossimità della mappa PEP-enolasi (#6) e allineare il modello rispetto alla mappa. Inserire questo modello nella mappa PEP-enolase-unsharpened-map digitando fit #8 in #6 nella riga di comando. Qui, la mappa è numerata 6 e il modello è numerato 8.
       NOTA: In alcuni casi, l'adattamento locale in ChimeraX potrebbe non essere sufficiente per allineare il modello. In questi casi, è possibile eseguire una fase aggiuntiva di adattamento globale (DockinMap, vedere Tabella dei materiali) in Phenix.
   11. Salvare il modello adattato digitando save Apo-enolase.pdb #8 nella riga di comando.
2. Modellazione e perfezionamento della PEP nella mappa crioEM nitida con fattore B del complesso PEP-enolasi
   1. Apri "coot" (vedi Tabella dei materiali) dal terminale digitando ./Coot &.
   2. Visualizza "Apo-enolase.pdb" facendo clic su File > Apri coordinate Apo-enolase.pdb. Il file di coordinate viene visualizzato in base ai legami (colore in base all'atomo).
   3. Scarica la mappa nitida Enolase legata a PEP, ovvero emd_30989.map da EMDB. Visualizza lo stesso facendo clic su File > Apri mappa > emd_30989.map . Impostare la soglia su 7,00 σ scorrendo il pulsante centrale del mouse.
   4. Per trovare i BLOB non modellati, fare clic su Convalida > BLOB non modellati > Trova BLOB.
   5. Localizzare la densità del ligando non modellata vicino ai residui del sito attivo, Ser 42, Lys-386 e Arg-364 del modello enolasi.
   6. Ottieni il file del modello di monomero PEP dalla libreria dei monomeri Coot facendo clic su File > Ottieni monomero e inserendo PEP come codice di 3 lettere.
   7. Sposta la molecola PEP alla densità utilizzando l'opzione Ruota/Trasla/Zona/Catena/Molecola nel menu della barra laterale. Usa la raffinazione nello spazio reale in Coot per adattare la molecola PEP alla densità facendo clic su Real Space Refine Zone nel menu della barra laterale. Unire il ligando adattato con il file Apo-enolase.pdb utilizzando l'opzione unisci molecola nella scheda di modifica . Salvare il modello come PEP-Enolase.pdb.
      NOTA: È inoltre possibile utilizzare l'opzione ligando> Jiggle-Fit Ligand per adattarsi al ligando.
   8. Per aggiungere ligandi al resto dei monomeri nel file di coordinate, fare clic su Calcola > NCS Tools > i ligandi NCS. Apparirà una finestra separata denominata Trova ligandi correlati a NCS. Per l'opzione Proteina con NCS, selezionare il file di coordinate Apo-enolase.pdb e l'ID catena A come catena master NCS.
      1. Per la molecola contenente il ligando, selezionare Apo-enolase.pdb come file di coordinate e l'ID della catena, J e il numero di residui da 1 a 1. Fare clic su Trova posizioni di candidato. Apparirà una finestra chiamata Fitted Ligands con un elenco di posizioni candidate. Valutare l'adattamento facendo clic sui singoli ligandi candidati e analizzare visivamente l'adattamento.
         NOTA: In Servalcat/Refmac, può essere fornito solo un modello monomerico e la simmetria utilizzata nella ricostruzione può essere data per ottenere un modello espanso.
   9. È stata osservata anche una densità aggiuntiva per le molecole di solvente vicino al ligando. Le strutture cristalline ad alta risoluzione dell'enolasi provenienti da vari omologhi suggeriscono la presenza di due ioni Mg^{2+ 40,41}, che probabilmente stabilizzano la carica negativa dell'intermedio di reazione. Modella due ioni Mg²⁺ nella densità del sito attivo facendo clic su posiziona atomo sul puntatore e selezionando MG dall'elenco del tipo di atomo puntatore.
      NOTA: La geometria e la distanza del legame possono essere utilizzate come guida per selezionare lo ione metallico. Nel caso di Mg²⁺ legato ad atomi di ossigeno in residui proteici, la distanza di legame varia tra 2,1 Å -2,4 Å, con una geometria ottaedrica. Tuttavia, nel caso di mappe a bassa risoluzione, la sfera di coordinazione è spesso incompleta e anche la distanza può variare a causa delle limitazioni nella risoluzione.
   10. Ripetere il passaggio 1.2.8 per aggiungere gli ioni Mg²⁺ nei monomeri correlati alla simmetria.
   11. Salva il modello cliccando su File > Salva coordinate > Seleziona nome file > e digitando Enolase+PEP+Mg.pdb.
   12. Aprire l'interfaccia grafica di Phenix (vedere la tabella dei materiali). Eseguire un processo di raffinamento dello spazio reale con Enolase+PEP+Mg.pdb e emd_30989.map rispettivamente come modello di input e mappa, utilizzando i parametri predefiniti. Questo passaggio viene eseguito in modo iterativo con Coot per ottenere un buon adattamento e geometria del modello di mappa.
       NOTA: La mappa delle differenze non nitida viene utilizzata per dimostrare la presenza di ligando, ad esempio in una figura. A scopo di modellazione, è stata utilizzata la mappa nitida del fattore B, consigliata. La mappa nitida con fattore B può essere utilizzata anche per calcolare la mappa delle differenze a scopo dimostrativo rispetto alla mappa non nitida. Tuttavia, se la risoluzione è inferiore nella regione in cui il ligando è legato, il singolo fattore B utilizzato per rendere più nitida l'intera mappa potrebbe non rivelare chiaramente la densità del ligando.
3. Visualizzazione e generazione di figure del ligando modellato
   1. Aprire il modello Enolase+PEP+Mg raffinato dal lavoro finale di raffinazione di Phenix in PyMOL⁴² (vedere Tabella dei materiali) facendo clic su File > Apri e selezionando il nome del file.
   2. Caricare il file emd-30989.map (mappa nitida legata a PEP) facendo clic su File > Apri e selezionando il nome del file.
   3. Rinomina la mappa come nitida PEP facendo clic sulle azioni > rinominarla rispetto all'oggetto emd_30989 e digitando PEP nitido.
      NOTA: Nella maggior parte dei casi, ad esempio enolase, le mappe quando vengono aperte in pymol vengono normalizzate poiché l'opzione normalizza mappa è selezionata per impostazione predefinita in pymol. Poiché le mappe cryoEM sono centrate su una scatola più grande, la normalizzazione includerà tutto ciò che è contenuto nella scatola. Pertanto, la normalizzazione può essere disattivata prima dell'apertura in pymol.
   4. Selezionare i ligandi facendo clic su visualizza > sequenza.
   5. Digita isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 nella riga di comando e premi invio.
   6. Colora il mesh_ligand di blu cliccando sull'ultima casella, C, accanto all'oggetto mesh_ligand.
   7. Visualizza i residui del sito attivo, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 e Lys-386 che interagiscono con il PEP e il Mg²⁺ nella rappresentazione a bastoncino e sfera, rispettivamente, e l'enzima enolasi nella rappresentazione del cartone animato.
   8. Ray trace digitando ray 3600, 3600 per generare immagini di qualità di pubblicazione e salvarle come file png facendo clic su File > salvare e scegliendo PEP.png come nome del file.

2. Modellazione di ligandi nel recettore metabotropico del glutammato mGlu₅

1. Identificazione e modellazione della densità del ligando nella mappa cryoEM di mGlu legato all'agonista e all'antagonista₅
   1. Scarica le due semimappe insieme ai file di coordinate corrispondenti per ciascuno dei complessi mGlu₅ legati all'agonista (EMD-31536, 7fd8.pdb) e all'antagonista (EMD-31537,7fd9.pdb).
   2. Apri ChimeraX
      1. Aprire il file di coordinate 7fd8.pdb facendo clic su Apri e selezionando 7fd8.pdb.
      2. Digita delete ligand nella riga di comando e premi Invio.
      3. Allo stesso modo, utilizzare il comando delete/B per eliminare la catena B.
         NOTA: I ligandi e le catene possono essere eliminati utilizzando il menu a discesa in alto utilizzando le azioni di selezione e > atomi/legami > eliminare.
      4. Salvare il pdb non ligato digitando quanto segue nella riga di comando: save 7fd8_noligand_chainA.pdb #1. #1 indica l'ID del modello.
      5. Ripetere i passaggi 2.1.2.1-2.1.2.4 per 7fd9.pdb.
   3. Aprire CCP-EM. Crea un nuovo progetto chiamato mGlu₅ e specifica la directory del progetto e il nome utente.
      1. Apri Relion dalle opzioni nel pannello di sinistra.
         1. Vai alla scheda Creazione maschera .
         2. Fornire una delle semimappe per EMD-31536 come input.
            NOTA: Relion accetta mappe con .mrc come suffisso e le mappe EMD hanno il suffisso .map. I file mappa possono essere aperti in ChimeraX per l'esame e salvati nel formato .mrc.
         3. Nella scheda maschera , specificare la dimensione in pixel come 0,89 Å e la soglia di binarizzazione iniziale come 0,007.
         4. Eseguire il processo con l'alias 31536 (o qualsiasi altro nome facile da seguire).
         5. Allo stesso modo, creare una maschera per la semimappa EMD - 31537.
      2. Apri il programma Refmac Servalcat dalle opzioni nel pannello di sinistra in CCPEM.
         1. Fornisci il nome come mGlu₅_agonist.
         2. Importare il file 7fd8_noligand_chainA con estensione pdb come descritto nella sezione 2.1.2.4 del modello. Fornisci la posizione delle due mezze mappe e la maschera corrispondente creata in Relion.
         3. Specificare la risoluzione su 3,8 Å.
         4. Vai alle impostazioni di perfezionamento > Simmetria rigorosa e menziona C2 come simmetria del gruppo di punti Relion.
         5. Avviare il programma premendo il pulsante di avvio in alto.
   4. Una volta terminato il lavoro, apri il risultato in Coot (opzione disponibile in alto nella sezione dei risultati). Questo visualizzerà un diffmap.mtz in Coot per impostazione predefinita, dove i colori rosso e verde indicano rispettivamente densità negative e positive.
      1. Andare su Display manager > le proprietà della mappa delle differenze etichettata DELFWT PHDELWT e modificare il livello di contorno a 4.0 (valore assoluto).
         NOTA: La scelta della soglia dipende dalla mappa e dalla risoluzione.
      2. Nascondi la mappa etichettata FWT PHWT e la molecola etichettata refined.pdb.
      3. Sposta la mappa usando il mouse per visualizzare la densità positiva (colorata in verde) e portare il blob più grande al centro.
      4. Vai su File > Ottieni monomero, digita QUS e premi invio.
      5. Vai su Calcola > molecola Modeling > Rigid Body Fit e fai doppio clic sul monomero QUS per regolare la molecola in modo che si adatti alla densità Fo-Fc.
      6. Utilizzare l'opzione unisci molecola nella scheda di modifica per aggiungere la molecola QUS al file di coordinate, refined.pdb.
      7. Ripetere i passaggi 2.1.4.3-2.1.4.6 per adattare il ligando con il codice monomerico NAG e CHS nel blob più piccolo nell'extracellulare e nella parte superiore del dominio transmembrana, rispettivamente.
      8. Salvare le coordinate come refined_ligands.pdb.
         NOTA: La risoluzione del dominio transmembrana (TM) è inferiore e, quindi, non viene discussa qui.
2. Affinamento della struttura ligata mGlu₅
   1. Aprire CCPEM e clonare il processo di perfezionamento precedente (passaggio 2.1.3.2) ed eseguirlo con il file refined_ligands.pdb e la mappa più nitida (emd. 31536.mrc) come input, utilizzando i parametri predefiniti e la simmetria C2.
      NOTA: Se il programma non riconosce il ligando, è necessario fornire i file CIF. Questi file CIF possono essere scaricati dal PDB o generati utilizzando vari programmi (vedere il passaggio 3.1.1 per i dettagli).
3. Visualizzazione e generazione di figure in PyMOL
   1. Aprire il modello refined_expanded.pdb dall'ultimo processo di perfezionamento Refmac in PyMOL.
   2. Vai su File > Apri e vai alla directory del lavoro Refmac per caricare il file diffmap_normalised_fofc.mrc (mappa delle differenze dal lavoro Servalcat nel passaggio 2.1.3.2).
      NOTA: Se i file con estensione .mrc non sono visibili durante la navigazione, modificare il tipo di file in tutti i file e sfogliare.
   3. Selezionare i leganti utilizzando la sequenza di visualizzazione >.
   4. Vai al pulsante Azioni e rinomina la selezione come ligandi.
   5. Digita quanto segue nella riga di comando e premi invio: isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligands, carve=2.5.
      NOTA: La larghezza della maglia può essere regolata. In questo caso, viene utilizzata la larghezza della mesh di 0,2, che viene impostata utilizzando il seguente comando: set mesh_width=0,2.
   6. Fare clic con il pulsante destro del mouse su uno dei monomeri e andare su catena > colore per specificare il colore di ciascun monomero. Colora il ligando e la mesh usando l'ultima casella etichettata c nel ligando e mesh_ligands oggetti. Il dimero del recettore mGlu₅ è mostrato in una rappresentazione a fumetti e i monomeri sono colorati in verde acqua e grano. I ligandi sono mostrati in bastoncino e la maglia che li contorna è colorata di verde.
   7. Usa le azioni >opzione orienta/centra/ingrandisci contro gli oggetti e regola manualmente per visualizzare la mesh e chiaramente. Selezionare i residui vicini che potrebbero interagire con il ligando, ad esempio Tyr64, Trp100 per QUS e, se necessario, visualizzare la loro catena laterale o la catena principale o entrambe come rappresentazione a bastoncino.
   8. Ray tracing per generare immagini ad alta risoluzione e salvarle come file png.
      NOTA: I passaggi precedenti vengono ripetuti per la mappa associata all'antagonista EMD-31537 e il corrispondente file di coordinate PDB-7fd9.

3. Modellazione dell'inibitore, della desossigalatto-nojirimicina (DGN) e delle molecole di solvente in una mappa nitida ad alta risoluzione della β-galattosidasi

1. Identificazione del ligando, DGN, utilizzando le semimappe di cryoEM
   1. Preparazione di un dizionario di ligandi sconosciuti per la modellazione [Deossigalacto-nojirimicina(DGN)]
      NOTA: Il file del dizionario Deossigalacto-nojirimicina è incluso nella libreria di monomeri CCP4 come DGJ (3 letter ligand ID). Tuttavia, qui è considerato un ligando nuovo e sconosciuto per illustrare il processo di generazione di file di dizionario per ligandi sconosciuti, DGN è usato come codice di 3 lettere.
      1. Apri il riepilogo del composto per la deossigalatto-nojirimicina (DGN) nella pagina web di PubChem e copia la stringa dei sorrisi per il composto deossigalatto-nojirimicina.
      2. Aprire Phenix > Ligands > eLBOW.
      3. Specificare la stringa dei sorrisi come input.
      4. Specificare il metodo di ottimizzazione della costruzione dei liganti appropriato. In questo caso, viene utilizzata l'ottimizzazione semplice.
      5. Incolla la stringa chimica dei sorrisi nella sezione della definizione del ligando.
      6. Fornisci un titolo di lavoro, il prefisso del file di output e l'ID del ligando in modo appropriato e premi Esegui.
         NOTA: l'output del lavoro contiene un file di coordinate, DGN.pdb, e un file di dizionario, DGN.cif. Jligand²⁹ può essere utilizzato anche per creare il file cif.
   2. Scarica il file delle coordinate della β-galattosidasi (6tsh.pdb) dal PDB e rimuovi le coordinate per le catene proteiche (B, C, D), il ligando, il DGN e altre molecole di solvente utilizzando un editor di testo o l'opzione di eliminazione della catena/zona in Coot. Salvare il file di coordinate come apo-betaGal_chainA.pdb.
      NOTA: ChimeraX o Pymol possono essere utilizzati anche per rimuovere la molecola ligando/solvente.
   3. Scaricare le semimappe (emd_10563_half_map_1.map e emd_10563_half_map_2.map) dai dati aggiuntivi della voce EMD-10563 da EMDB.
   4. Aprire CCPEM e utilizzare Relion per creare la maschera per la mappa a una soglia di 0,01 (come descritto nei passaggi 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4).
   5. Eseguire Servalcat (all'interno della suite CCPEM come descritto nel passaggio 2) con le semimappe ottenute nel passaggio 3.1.3 e il modello apo nel passaggio 3.1.2 e la simmetria D2.
      NOTA: Il modello deve essere allineato a una delle semimappe o mappe complete per localizzare la densità del ligando. Questo può essere fatto adattando il modello alla mappa utilizzando ChimeraX e quindi salvando le coordinate relative alla semimappa. In questo esempio, le semimappe e la mappa primaria in EMDB hanno dimensioni/griglie di caselle diverse e il modello deve essere posizionato nella semimappa.
   6. Apri la folaga.
      1. Aprire DGN.cif per il dizionario dei ligando, come generato nel passaggio 3.1.1 con Phenix eLBOW. Questo viene fatto andando su File > Importa dizionario CIF e sfogliando la directory dei lavori eLBOW.
      2. Aprire i file delle coordinate della proteina e del ligando, apo-betaGal_chainA.pdb dal passaggio 3.1.2 e DGN.pdb dal passaggio 3.1.6 rispettivamente.
      3. Aprire automaticamente il file diffmap.mtz dal lavoro Servalcat (passaggio 3.1.5) e visualizzare la mappa etichettata DELFWT PHDELWT in Coot. Contornare la mappa a una soglia di ~ 4 valore assoluto.
         NOTA: È importante controllare le statistiche della mappa digitando l'intestazione map.mrc o utilizzando gli strumenti in Chimera. È possibile ottenere tutte le informazioni necessarie sulla dimensione dei pixel, la dimensione della casella, la densità minima, media e massima e la deviazione rms dalla densità media. È fondamentale controllare la dimensione dei pixel e la dimensione della scatola delle mappe cryoEM. La mappa 3D rappresenta il volume della mappa proteina-ligando in una griglia di voxel 3D. In ogni voxel viene memorizzato il valore potenziale dell'elettrone o la probabilità di trovare l'elettrone in quella posizione. Quando viene scelta una certa soglia, i voxel, che hanno una densità inferiore al valore specificato, vengono impostati a zero. Questo aiuta a ridurre al minimo il rumore sperimentale nella mappa e a visualizzare meglio le caratteristiche della mappa⁴³. Pertanto, la mappa deve essere sagomata a una soglia in cui le caratteristiche della mappa siano facilmente visibili e il rumore nella mappa sia minimo.
      4. Vai su Ligando > trova i ligandi. Nella nuova finestra visualizzata, selezionare il ligando, la mappa delle differenze e il modello apo-betaGal_chainA.pdb. Lascia le altre opzioni alle impostazioni predefinite e fai clic su Trova ligandi per avviare la ricerca.
      5. Viene visualizzato un elenco di risultati principali che mostrano la potenziale densità del ligando con una copia posizionata in ciascuna delle densità. Controlla manualmente tutti i colpi in cui è stato posizionato il ligando. Mantieni i colpi più probabili e rimuovi quelli ambigui.
         NOTA: La differenza nella densità della mappa ad una soglia alta suggerisce chiaramente la presenza del ligando nel sito attivo.
2. Modellazione del ligando DGN e delle molecole di solvente
   1. Eseguire un affinamento dello spazio reale in Coot per adattare il ligando (DGN.pdb) nella mappa di densità delle differenze, quindi unire le coordinate del ligando con il apo-betaGal_chainA.pdb e salvarlo come betaGal_chainA+ligand.pdb.
      NOTA: I ligandi che sono stati posizionati in regioni di altre catene possono essere rimossi e non vengono uniti durante il salvataggio del file di coordinate unito. I ligandi in altre catene possono essere generati da NCS Ligands come mostrato nell'esempio 1, passaggio 1.2.8, o in Refmac/Servalcat utilizzando l'espansione della simmetria.
   2. Eseguire un altro processo Servalcat come sopra (passaggio 3.1.5) con betaGal_chainA+ligand.pdb come modello di input e le semimappe (dal passaggio 3.1.3) con simmetria D2.
   3. La differenza di densità (rispetto al lavoro di Servalcat al passaggio 3.2.2) che circonda il ligando modellato suggerisce la presenza delle molecole di solvente che si coordinano con la molecola del ligando. La densità centrale vicino al legante sembra essere troppo grande per le molecole d'acqua.
   4. Sulla base di precedenti dati biochimici e strutturali che indicano la presenza di Mg²⁺ in quella posizione, lo ione Mg²⁺ viene modellato qui facendo clic sull'opzione posiziona atomo e specificando l'atomo come MG.
   5. Modella le molecole d'acqua nella differenza di densità nel sito attivo che indicano la presenza della molecola di solvente facendo clic sull'atomo posizionato al puntatore e selezionando l'acqua.
      NOTA: Coot ha anche la possibilità di raccogliere automaticamente le molecole d'acqua. In questo caso, poiché l'attenzione è solo sul sito attivo, le molecole d'acqua vengono aggiunte manualmente.
   6. Unisci le coordinate per Mg²⁺ e acqua con il file betaGal+ligand.pdb e salvalo come betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb.
   7. Con il betaGal+ligando+solvent_chainA.pdb, eseguire il raffinamento di Refmac in Servalcat con simmetria D2.
      NOTA: La mappa delle differenze di output di questo lavoro può servire come mezzo per convalidare se il ligando è stato modellato accuratamente, poiché la mappa delle differenze dovrebbe mostrare una densità minima residua positiva o negativa.
3. Visualizzazione e generazione di figure con PyMOL
   NOTA: I passaggi descritti di seguito forniscono alcuni esempi di creazione di figure utilizzando modelli e mappe che possono essere utilizzati per illustrare la presenza di ligandi e solventi.
   1. Aprire il file refined_expanded.pdb dell'ultimo lavoro Servalcat (passaggio 3.2.6) con il ligando e il solvente modellati.
   2. Seleziona diverse catene separatamente per colorarle di magenta, giallo, verde e verde acqua, come descritto nell'esempio 2.
   3. Vai su Visualizza sequenza >, effettua selezioni separate per le molecole d'acqua, magnesio e DGN e rinomina gli oggetti rispettivamente come acqua, MG e DGN.
   4. Visualizza MG e molecole d'acqua come sfere selezionando gli oggetti, facendo clic con il pulsante destro del mouse e mostra > sfera. Allo stesso modo, visualizzare il ligando nella rappresentazione a bastoncino e colorare i ligandi e i solventi in modo appropriato. In questo caso, il ligando è stato colorato di giallo da un eteroatomo, lo ione magnesio è colorato di viola e le molecole d'acqua sono colorate di rosso.
   5. Selezionate DGN, MG e molecole d'acqua. Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare le azioni > copiare nell'oggetto e denominarlo come ligandi.
   6. Aprire il file diffmap_normalised_fo.mrc dal processo Servalcat nel passaggio 3.2.6 e rinominarlo come ligand_fo.mrc. Digita il seguente comando: isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligands, carve=2.
      NOTA: L'opzione di intaglio di 2 Å viene applicata intorno agli atomi e, a seconda della risoluzione e della qualità delle mappe, è possibile utilizzare valori da 3 a 5. Inoltre, quando si aprono le mappe cryoEM in PyMOL, è consigliabile impostare normalize_ccp4_maps su off.
   7. Utilizzare le azioni > le opzioni di orientamento/zoom e regolare manualmente per visualizzare i leganti e i residui interagenti nelle vicinanze (ove applicabile) come mostrato nel passaggio 2.3.7.
   8. Ray tracing di queste scene per salvare immagini ad alta risoluzione utilizzando il comando ray 3600, 3600.
   9. Salva la scena come file .png.
      NOTA: I seguenti passaggi sono facoltativi e delineano il processo per visualizzare (1) la differenza di densità (Fo-Fc) per il ligando non modellato, DGN, (2) la densità (Fo) del ligando modellato, DGN e la differenza di densità (Fo-Fc) per i solventi non modellati e infine per (3) la densità (Fo) per il ligando modellato, DGN e le molecole di solvente nel sito attivo.
   10. Per dimostrare la presenza del ligando, del DGN e delle molecole di solvente circostanti utilizzando la mappa delle differenze, aprire diffmap_normalised_fofc.mrc dal lavoro Servalcat nel passaggio 3.1.5. Rinominare il file della mappa come unliganded_fofc.mrc facendo clic su azioni > rinominare accanto all'oggetto mappa. Digita quanto segue nella riga di comando: isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligands, level=6, carve=2.
   11. Per dimostrare la densità del ligando modellato, DGN, e la densità del solvente non modellato circostante, aprire il diffmap_normalised_fo.mrc e il diffmap_normalised_fofc.mrc dal lavoro servalcat nel passaggio 3.2.2. Rinominare il diffmap_normalised_fo.mrc come DGN_fo e il diffmap_normalised_fofc.mrc come DGN_unmodelled_solvents_fofc.
   12. Selezionare MG e acqua da Visualizza sequenza >, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare le azioni > copiare nell'oggetto e denominarle come solventi.
   13. Digitare quanto segue nella riga di comando: isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, level=3, carve=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, solventi, level=6, carve=2.
       NOTA: Il mesh_DGN_fo mostrerà la densità del ligando e il mesh_solvent_fofc mostrerà la densità omessa per il MG e l'acqua.
   14. Infine, per visualizzare i ligandi modellati e le molecole di solvente circostanti nel sito attivo, aprire il diffmap_normalised_fo.mrc dal lavoro Servalcat nel passaggio 3.2.6 e rinominarlo come ligand_fo.mrc.
   15. Digita quanto segue nella riga di comando: isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligands, level=3, carve=2.
       NOTA: Qui, abbiamo usato diffmap_normalised_fo.mrc, ma la mappa finale più nitida può essere utilizzata per mostrare la densità dei leganti e i residui circostanti. È buona norma menzionare il tipo di mappa utilizzata, i valori di nitidezza del fattore B nella legenda della figura.
   16. La larghezza della mesh e la dimensione della sfera possono essere impostate digitando i seguenti comandi: set mesh_width=0.2 e set sphere_scale=0.25 per ridurre la dimensione della sfera.
   17. Colora la rete fo blu e la rete fofc verde.
   18. Utilizzare le azioni > le opzioni di orientamento/zoom e regolare manualmente per visualizzare i leganti e i residui interagenti nelle vicinanze (ove applicabile), come mostrato nel passaggio 2.3.7.
   19. Ray tracing di queste scene per salvare immagini ad alta risoluzione utilizzando il comando ray 3600, 3600.
   20. Salvare le singole scene come file .png.

4. Effetto della risoluzione sul modello del ligando nella β-galattosidasi

1. Apri Terminale e vai alla directory contenente le due mezze mappe.
2. Apri le due semimappe (passaggio 3.1.3) in formato .map in ChimeraX, visualizzale e salvale come emd10563_half1_1_unfil.mrc e emd10563_half2_1_unfil.mrc.
3. La maschera creata nel passaggio 3.1.4 può essere utilizzata come input.
4. Esegui un processo di post-elaborazione in Relion utilizzando le semimappe e le maschere dei passaggi 4.2-4.3, con i parametri predefiniti.
5. Ripetere il passaggio 4.4, ora con una pesata FSC di salto abilitata e specificando un filtro passa-basso ad-hoc di 3 Å.
6. Ripetere il passaggio 4.4 con un filtro passa-basso ad-hoc da 3,5 Å.
7. Apri le mappe (postprocess.mrc) dai passaggi 4.4-4.6, filtra a diverse risoluzioni e le coordinate del modello, 6tsh.pdb (allineato alle semimappe in ChimeraX) dal passaggio 3.1.2 in PyMOL. Rinominare le diverse mappe come 3.0, 3.5 e 2.3 in base alle relative risoluzioni.
   NOTA: Si può confermare il filtro passa-basso delle mappe visualizzandole in ChimeraX o Coot.
8. Visualizza l'effetto della risoluzione sulla densità delle molecole del ligando e del solvente creando una maglia di 2 Å attorno alle molecole del ligando e del solvente a una soglia di 6σ come descritto nel passaggio 3.3.6 con mappe filtrate a diverse risoluzioni.

Results

Esempio 1
L'enzima enolasi di M. tuberculosis catalizza il penultimo passaggio della glicolisi e converte il 2-fosfoglicerato in fosfoenolpiruvato (PEP), che è un intermedio essenziale per diverse vie metaboliche^44,45. I dati CryoEM per i campioni di apo-enolasi e enolasi legata al PEP sono stati raccolti alla stessa dimensione di pixel di 1,07 Å e l'elaborazione delle immagini è stata eseguita con Relion 3.1^46,47. Le strutture apo-enolasi e PEP-enolasi sono state determinate a 3,1 Å e 3,2 Å, rispettivamente^{a 48}. Le mappe e i modelli sono stati depositati in EMDB e PDB^49,50 (EMD-30988, EMD-30989, PDB-7e4x e PDB-7e51). La mappa cryoEM dell'enzima mostra che si tratta di un ottamero nella soluzione (Figura 1A). Al fine di identificare la densità del ligando nella mappa della PEP-enolasi, sono state selezionate le mappe non nitide dell'apoenzima e dell'enzima legato alla PEP, ed è stata calcolata una mappa delle differenze in ChimeraX, sottraendo la mappa della PEP-enolasi dalla mappa dell'apoenzima. È stata osservata una densità distinta (verde) ad una soglia alta, che suggeriva la presenza del ligando (Figura 1B). La modellazione della catena proteica nella mappa non nitida ha indicato chiaramente che la densità extra è presente nel sito attivo della proteina (Figura 1C). Il ligando, PEP, è stato quindi modellato nella mappa nitida del fattore B utilizzando Coot, e il modello proteina+ligando è stato raffinato nello spazio reale con Phenix. Due ioni Mg²⁺ sono stati modellati nella densità osservata in prossimità del ligando (Figura 1D). Il ligando, PEP, adotta un orientamento simile a quello osservato in altri omologhi dell'enolasi e diversi residui del sito attivo, come Lys-386, Arg-364, formano interazioni di legame idrogeno con il ligando PEP. Gli ioni Mg²⁺ formano legami di coordinazione metallica con Asp-241, Glu-283, Asp-310 e il fosfato di PEP (Figura 1D).

Esempio 2
In assenza di una struttura apo-proteica disponibile o se la proteina subisce un grande cambiamento conformazionale, non è possibile calcolare le mappe delle differenze come descritto sopra. Nel 2021, il gruppo di Garib Murshudov presso il Laboratory of Molecular Biology di Cambridge ha introdotto Servalcat²², che implementa un flusso di lavoro di raffinamento utilizzando Refmac e calcola anche una mappa delle differenze Fo-Fc dopo il raffinamento. Una densità di differenza Fo-Fc positiva suggerisce la presenza di molecole/ligandi che non sono stati inclusi nel modello durante l'affinamento, essenzialmente una mappa di omissione. Tuttavia, si consiglia di valutare prima l'adattamento del modello alla mappa in generale e quindi di valutare la mappa della densità di differenza.

Per illustrare l'uso di Servalcat/Refmac, è stato scelto mGlu₅, un recettore accoppiato a proteina G dimerica che si lega al neurotrasmettitore, L-glutammato. Dopo il legame dell'agonista, L-quisqualato, il dominio extracellulare si riorienta, innescando la rotazione del 7TM, avvicinandoli per stabilizzare lo stato attivato. Pertanto, si osserva un grande cambiamento conformazionale tra l'apo/antagonista e l'apo/antagonista. stati legati all'agonista⁵¹ (Figura 2A e Figura 2E). Le due semimappe per i complessi legati all'agonista (EMD-31536) e all'antagonista (EMD-31537) sono state ottenute da EMDB e le mappe crioEM mostrano una risoluzione varia in tutta la molecola e un dominio extracellulare meglio risolto. Successivamente, questi sono stati utilizzati come input in Servalcat insieme all'apo-proteina come modello per calcolare la differenza o la mappa Fo-Fc per ogni set di dati. Questa mappa mostrava distintamente la presenza di varie molecole ligando (non proteiche). La risoluzione stimata da FSC (correlazione di Fourier Shell) per i complessi legati all'agonista e all'antagonista era rispettivamente di 3,8 Å e 4,0 Å. Nel caso dell'mGlu₅ legato all'agonista, la mappa delle differenze Servalcat Fo-Fc ha mostrato la presenza sia dell'agonista (L-quisqualato) (Figura 2B) che della N-acetilglucosamina (NAG) (Figura 2C) nell'ECD del recettore (a causa della minore risoluzione del TMD, qui ci concentriamo solo sull'ECD e sulla parte superiore del TMD). Si vede che i residui proteici, tra cui Tyr-64, Trp-100, Ser-151 e Thr-175, interagiscono con l'agonista. La densità vicino al residuo Asn-210 ha suggerito la presenza di N-acetil glucosamina (Figura 2C). Una densità coerente con il colesterolo emiuccinato, che è stata aggiunta durante la purificazione di mGlu_5, è stata osservata vicino alla sommità dell'elica transmembrana 1 (Figura 2D). Poiché la risoluzione è moderata e il ligando, L-quisqualato, può essere posizionato in diversi orientamenti, la struttura precedente del dominio extracellulare con il ligando (PDB-6N50) è stata utilizzata come guida per modellare il ligando. Il legame dell'antagonista stabilizza lo stato aperto o a riposo del recettore (Figura 2E). Una densità coerente con l'antagonista LY341495 è stata osservata alla cerniera del lobo I e del lobo II del dominio della trappola per mosche di Venere nell'ECD. L'antagonista interagisce con residui simili a quelli dell'agonista. L'interazione di impilamento tra Tyr-223 nel lobo II e l'antagonista stabilizza il recettore in uno stato aperto (Figura 2F). Analogamente alla struttura dell'agonista, la glicosilazione o la presenza di N-acetilglucosamina è stata osservata vicino ad Asn-210 (Figura 2G).

Esempio 3
Il terzo esempio chiarisce il protocollo per modellare ligandi e molecole di solvente di dimensioni ridotte o di frammenti in mappe CryoEM ad alta risoluzione. La scoperta di farmaci basati su frammenti (FBDD) è emersa come un metodo potente e innovativo nello sviluppo di nuove terapie basate su bersagli in varie aree patologiche, rendendola una strada promettente nella ricerca e sviluppo farmaceutica^52,53. La FBDD inizia con lo screening e l'attenta selezione di piccoli frammenti di molecole altamente solubili e a basso peso molecolare che si legano a specifiche proteine bersaglio o biomolecole di interesse. La determinazione delle strutture di questi complessi proteina-frammento rivela la modalità di legame di questi frammenti, che funge da guida per la progettazione di molecole simili a farmaci più grandi e complesse con crescente affinità e specificità verso la proteina^{bersaglio 54}. Tuttavia, questo metodo richiede una densità di ligando ad alta risoluzione per determinare con precisione la posa e posizionare correttamente i gruppi funzionali del ligando¹⁵.

La β-galattosidasi, una delle prime strutture ad alta risoluzione ad essere determinata dai progressi della tecnologia cryoEM, è un enzima omotetramerico 450kDa ben studiato che catalizza l'idrolisi del lattosio in glucosio e galattosio⁵⁵. Per mostrare l'uso della crioEM in FBDD, Astex, Regno Unito, ha determinato la struttura della β-galattosidasi con un inibitore delle dimensioni di un frammento, la deossigalatto-nojirimicina (DGN) legata nel sito attivo (EMDB-10563, PDB:6tsh)⁵⁶. Questo set di dati viene utilizzato per illustrare il protocollo per modellare in modo inequivocabile ligandi e solventi in mappe ad alta risoluzione. Per mostrare l'effetto della risoluzione sulla modellazione e la visualizzazione dei ligandi, le mappe sono state filtrate a 3,0 Å e 3,5 Å nella fase di post-elaborazione in Relion. Ciò evidenzia la qualità della densità della mappa a diverse risoluzioni e sottolinea la necessità di una risoluzione più elevata per la modellazione di ligandi e solventi.

L'enzima è un tetramero con simmetria D2 in soluzione (Figura 3A). La mappa delle differenze (tra mappa e modello), come calcolata da Servalcat, suggeriva la presenza di DGN e di diverse molecole di solvente nel sito attivo dell'enzima (Figura 3B). Con una risoluzione stimata di 2,3 Å, la densità ha mostrato caratteristiche ad alta risoluzione, che hanno aiutato nella modellazione accurata dell'inibitore nel sito attivo della proteina. Sono state osservate interazioni tra DGN e Tyr-503 e His-540 (Figura 3C). La differenza di densità ha anche suggerito la presenza di molecole di solvente che interagiscono con il DGN e con i residui proteici. Mg²⁺ e diverse molecole d'acqua sono state modellate nella densità (Figura 3D). Si osservano legami di coordinazione metallica tra Mg²⁺ e Glu-416, Glu-461 e diverse molecole d'acqua (Figura 3D). È stato osservato che Mg²⁺ interagisce con DGN attraverso una molecola d'acqua.

A una risoluzione inferiore di 3,5 Å e 3,0 Å, la densità del ligando assomiglia a un blob e manca di caratteristiche ad alta risoluzione cruciali per una modellazione accurata del ligando (Figura 4A, B). La densità delle molecole d'acqua era quasi inesistente a queste risoluzioni. In sintesi, con l'aumentare della risoluzione, soprattutto superiore a 3,0 Å, la densità ha permesso la modellazione di un maggior numero di molecole d'acqua (Figura 4C,D). Il corretto posizionamento del centro chirale del ligando è diventato realizzabile a ~2.3 Å (Figura 4C,D) a causa della presenza di caratteristiche distinte nella mappa che hanno guidato il posizionamento e la modellazione delle molecole d'acqua e Mg²⁺. In confronto, la densità per Mg²⁺ è rimasta distinguibile in tutto l'intervallo di risoluzione (Figura 4A-C).

Figura 1: Modellazione del ligando fosfoenolpiruvato in M. tuberculosis enolase. (A) mostra la mappa nitida del fattore B dell'enzima enolasi legato alla PEP. La mappa suggerisce che l'enolasi è ottamerica in soluzione e che ogni monomero nella mappa è colorato in modo diverso. (B) visualizza una mappa crioEM non nitida dell'enzima apo-Enolasi in grigio con la mappa di differenza (tra mappe legate al PEP e mappe non nitide dell'apo-Enolasi) sovrapposta in verde, suggerendo la presenza del ligando, PEP. Questa è una mappa dimostrativa per mostrare la presenza di ligandi. (C) visualizza l'adattamento del modello dell'enolasi nella mappa cryoEM non nitida, evidenziando la posizione della differenza di densità rispetto alla proteina. Il modello proteico è mostrato in una rappresentazione a fumetti e colorato in Chainbow. Questa figura mostra che la densità extra (verde) è presente nel sito attivo di ciascun monomero. (D) mostra il ligando, PEP, racchiuso nella mappa nitida del fattore B, colorata di blu. Inoltre, è stata osservata anche la densità di due ioni Mg²⁺, che forma legami di coordinazione metallica con diversi residui del sito attivo, tra cui Ser-42, Asp 241, Glu-283, Asp-310 e atomi di ligando. Il ligando crea interazioni di legame idrogeno con Lys-386, Lys-335 e Arg-364. I residui proteici sono mostrati nella rappresentazione a bastoncino e gli ioni Mg²⁺ sono mostrati come sfere viola. Le figure nei pannelli (A-D) sono state generate con Pymol. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Identificazione, modellazione e visualizzazione di vari ligandi nel recettore mGlu₅ . Le mappe di omissione Fo-Fc sono state ottenute utilizzando Servalcat. (A) mostra la struttura del dimero del recettore mGlu₅ (PDB-7fd8) in rappresentazione cartoonesca, con ciascun monomero colorato in verde acqua e grano, rispettivamente, e legato all'agonista L-quisqualato. Tutti i ligandi che sono stati identificati nell'extracellulare e nella parte superiore del dominio transmembrana del recettore sono racchiusi nella mappa di omissione Fo-Fc, colorati in verde e sagomati a 6σ. (B) evidenzia l'adattamento dell'agonista, L-quisqualato racchiuso nella mappa delle differenze. L-quisqualato interagisce con diversi residui di mGlu₅ tra cui Tyr-64, Trp-100, Ser-151, Thr-175 e Gly-280. Le interazioni del legame H sono rappresentate da trattini rossi. In (C), una densità aggiuntiva è evidente vicino ad Asn-210, che è presente nel dominio extracellulare del recettore, e la molecola di N-acetilglucosamina (NAG) è stata modellata in questa densità. Per chiarezza, il NAG non è collegato ad Asn nella cifra attuale. (D) mostra la differenza di densità per il colesterolo emiuccinato (CHS) in verde vicino alla superficie esposta ai lipidi del recettore. La molecola CHS, rappresentata nei bastoncini, è stata modellata in questa densità. (E) mostra la struttura del recettore mGlu₅ (PDB-7fd9) legata all'antagonista LY341495 nella rappresentazione dei cartoni animati. In (F), una densità extra nella mappa delle differenze Fo-Fc situata alla cerniera tra il lobo I e il lobo II del dominio extracellulare indica la presenza dell'antagonista. I residui chiave (Tyr-64, Trp-100, Ser-152, Ser-173, Thr-175 e Tyr-223) attorno all'antagonista sono mostrati in rappresentazioni a bastoncino e le potenziali interazioni del legame idrogeno con l'antagonista sono mostrate in trattini rossi. (G) mostra la differenza di densità indicativa della presenza di una molecola di NAG vicino ad Asn-210 nella struttura legata all'antagonista (si noti che il NAG non è collegato con Asn per chiarezza). Le figure sono state generate con Pymol. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Identificazione, modellazione e perfezionamento di un piccolo inibitore e di molecole di solvente nella mappa ad alta risoluzione della β-galattosidasi (EMD-10563). (A) mostra il modello di β-galattosidasi risolto a 2,3 Å (PDB: 6tsh) nella rappresentazione di un cartone animato, dove ogni monomero è colorato distintamente. Il riquadro grigio evidenzia il sito di legame del ligando. (B) visualizza la densità della differenza Fo-Fc (da Servalcat) in una maglia verde nel sito attivo dell'enzima. La differenza di densità suggerisce la presenza dell'inibitore (DGN) e di diverse molecole di solvente nel sito attivo. (C) dimostra che, guidato dalla mappa Fo-Fc, l'inibitore desossigalatto-nojirimicina (DGN) è modellato nel sito attivo. Questo ligando modellato è raffigurato in formato bastoncino e racchiuso nella densità Fo (di Servalcat), che è colorata in blue_mesh. Sono state osservate interazioni di legame idrogeno tra DGN e diversi residui proteici, tra cui Tyr-503 e His-540. La differenza di densità Fo-Fc aggiuntiva attorno al ligando (verde) è indicativa delle molecole di solvente. (D) La mappa mostra che diverse molecole di solvente, tra cui acqua e Mg²⁺, rappresentate rispettivamente come sfere rosse e viola, sono modellate nel sito attivo dopo aver assicurato che ogni molecola di solvente sia legata a proteine (Glu-416, His-418 e Glu-461) o residui di ligando. Le molecole d'acqua e il Mg²⁺ sono racchiusi nella densità di Fo (maglia blu). Si vede che Mg²⁺ interagisce con il ligando, DGN attraverso una molecola d'acqua. La mappa Fo-Fc (mesh verde) nei pannelli (B,C) è sagomata a 6σ, mentre la densità Fo - mesh blu in C e D (dal raffinamento di Servalcat dopo la modellazione) è contornata a 3σ. Le figure nei pannelli (A-D) sono state generate con Pymol. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Effetto della risoluzione sulla modellazione del ligando nella β-galattosidasi. Le semimappe di EMD-10563 sono state utilizzate come input nella fase di post-elaborazione Relion e le mappe di post-elaborazione combinate sono state filtrate a risoluzioni 2,3 Å, 3,0 Å e 3,5 Å con diversi fattori B. La mappa mostrata in tutti i pannelli è sagomata a 6σ. Per chiarezza, nei pannelli A, B e C viene mostrata solo la spina dorsale proteica senza catene laterali, ligandi o molecole di solvente. (A) La mappa viene filtrata a 3,5 Å e viene mostrato il sito attivo della β-galattosidasi. A questa risoluzione si vede una macchia simile al ligando, DGN, accompagnata da alcune macchie più piccole nelle vicinanze. Modellare il ligando con l'orientamento corretto si rivela impegnativo a causa della mancanza di caratteristiche distinte nella mappa. (B) Viene visualizzata la mappa filtrata con una risoluzione di 3,0 Å. Qui, il blob del ligando diventa leggermente più definito, ma manca ancora di caratteristiche in generale. Si osservano anche alcune altre piccole macchie che suggeriscono molecole di solvente. (C) La mappa filtrata con una risoluzione di 2,3 Å rivela la densità del legante con caratteristiche distinte, rivelando in particolare la conformazione a sedia dell'imminozucchero. A questa risoluzione si osserva un numero significativo di piccole macchie corrispondenti a molecole d'acqua. La stima/nitidezza automatica del fattore B nel post-process Relion fornisce un valore di -18 Ų per le mappe filtrate a 3 Å e 3,5 Å, mentre il valore è -52 Ų per la mappa filtrata a 2,3 Å. Diverse nitidezze del fattore B delle mappe EM possono essere eseguite anche con Coot e utili nella costruzione di modelli. (D) Il pannello illustra che il ligando DGN (rappresentazione a bastoncino), Mg²⁺, e le molecole d'acqua (come sfere) come modellato nel sito attivo e la mappa nitida a 2,3 Å, mostrata in una maglia blu che circonda questi atomi. Le figure nei pannelli (A-D) sono state generate con Pymol. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

I miglioramenti nell'hardware e nel software del microscopio hanno portato a un aumento del numero di strutture cryoEM negli ultimi anni. Sebbene la risoluzione più alta raggiunta al momento nella crioEM a singola particella sia 1,2 Å 57,58,59, la maggior parte delle strutture viene determinata intorno alla risoluzione di 3-4 Å. La modellazione di ligandi in mappe a media e bassa risoluzione può essere complicata e spesso piena di ambiguità. Dato l'uso diffuso della crioEM sia nel mondo accademico che nell'industria farmaceutica per la ricerca traslazionale e la scoperta di farmaci, è essenziale garantire che i ligandi siano modellati correttamente e senza ambiguità. Pertanto, è prudente quantificare la risolvibilità degli atomi di ligando calcolando i Q-score⁶⁰, che è ora disponibile nell'EMDB come metrica per valutare la qualità delle mappe e l'adattamento del modello, nonché in Chimera.

Nel primo esempio, ChimeraX è stato utilizzato per calcolare la mappa delle differenze nello spazio reale tra l'apo e le mappe legate al ligando nell'enzima enolasi M. tuberculosis. La densità aggiuntiva ad una soglia elevata suggerisce la presenza del ligando, fosfoenolpiruvato, nel sito attivo e, Mg²⁺ legato al ligando. È importante notare che, in questo caso, la mappa è di media risoluzione (3,2 Å) e le molecole d'acqua non possono essere modellate con sicurezza (Figura 1). Il limite associato a questo metodo è che può essere applicato solo quando il legame del ligando non induce cambiamenti conformazionali significativi nella proteina. In questo caso la normalizzazione della mappa non è stata eseguita poiché sia i set di dati apo che quelli legati al ligando sono stati acquisiti con la stessa dimensione di pixel ed elaborati con parametri identici in Relion. Tuttavia, vale la pena notare che quando si confrontano mappe generate da diversi programmi di ricostruzione, come Relion^46,47 e CryoSparc⁶¹, o con qualità diverse, la normalizzazione delle mappe diventa essenziale prima di poter effettuare confronti significativi.

L'esempio successivo è mGlu₅, che subisce una grande riorganizzazione molecolare dopo il legame con l'agonista, come evidente dalle strutture cryoEM^51,62 (Figura 2). In questo scenario, non è possibile calcolare una semplice mappa di differenza tra i recettori non legati (apo) e legati al ligando a causa delle differenze sostanziali tra le mappe. Qui, è stato utilizzato Servalcat, che utilizza semimappe non nitide e non ponderate come input per il raffinamento nello spazio reciproco e successivamente calcola una mappa di differenza tra la mappa sperimentale e la mappa derivata dal modello. A una soglia elevata, è possibile visualizzare le differenze e fungere da guida per la correzione e il miglioramento del modello. Diversi blob non modellati nel dominio extracellulare e vicino al dominio transmembrana di mGlu₅ sono stati osservati e utilizzati come guida per modellare i ligandi (Figura 2).

Il terzo esempio mostra come la risoluzione (2,3 Å) giochi un ruolo cruciale nell'interpretazione della mappa e nella modellazione di un inibitore delle dimensioni di un frammento nella β-galattosidasi. In questo caso, la sfida consisteva nell'identificare un ligando molto piccolo (<200 Da) nella mappa delle differenze di Servalcat in mezzo al rumore intrinseco nei dati e modellarlo accuratamente. Oltre all'elevata risoluzione globale determinata utilizzando la correlazione a guscio di Fourier (FSC), anche la risoluzione locale specifica del ligando era sufficientemente alta da garantire un posizionamento accurato dei centri chirali dei ligandi (Figura 3). La densità per le molecole di solvente è stata osservata nella mappa delle differenze in tutto l'enzima e in particolare intorno al ligando. È stato anche dimostrato l'effetto della risoluzione sui ligandi di modellazione e sugli atomi di solvente (Figura 4). È importante prestare attenzione quando si modellano molecole di acqua o solvente perché, a volte, il rumore a una soglia bassa può assomigliare a molecole di acqua o solvente, portando a potenziali interpretazioni errate.

Un'altra considerazione importante è che le mappe cryoEM da sole potrebbero non essere sufficienti per identificare con precisione uno ione metallico da solo. Ulteriori metodi biofisici come l'Extended X-ray Absorption Fine Structure (EXAFS) o la spettroscopia a raggi X a dispersione di energia (EDX) sono spesso necessari per confermare la presenza e l'identità dello ione metallico. Sia nell'enzima enolasi che in quello β-galattosidasi, Mg²⁺ è stato modellato a causa della ricchezza di informazioni già disponibili su queste proteine, confermando l'identità dello ione metallico. Inoltre, la coordinazione degli ioni metallici in questi casi, esemplificata dalla classica geometria ottaedrica e dalle distanze di coordinazione quasi ideali di Mg²⁺, ha fornito una prova sostanziale della loro identità.

In generale, è necessario tenere conto di alcune considerazioni importanti durante la modellazione dei ligandi nelle mappe cryoEM. Per cominciare, è importante scegliere la mappa corretta per l'identificazione e la modellazione dei ligandi. In tutti i casi, è consigliabile una mappa o una mezza mappa non nitida e non ponderata rispetto a una mappa nitida e ponderata per visualizzare la densità del ligando, poiché la nitidezza e la ponderazione potrebbero comportare regioni poco nitide o eccessivamente nitide (rumore dovuto alla terminazione della serie) nella mappa. Ciò può comportare una densità del ligando non ottimale e l'uso di una diversa affilatura del fattore B può essere impiegato per valutare la densità durante la costruzione del modello in Coot. Sebbene vi sia un rischio nell'utilizzare la mappa nitida per identificare i ligandi in una mappa cryoEM, la mappa non nitida potrebbe non mostrare tutti i dettagli della densità del ligando, ma può essere utilizzata a scopo dimostrativo, come mostrato nella Figura 1B, C.

La posa del ligando modellato deve essere convalidata, soprattutto nei casi in cui i dati sono deboli. Come mostrato qui per mGlu₅, la risoluzione locale varia in tutta la mappa cryoEM e la modellazione imparziale del ligando può essere impegnativa. Servalcat può essere utilizzato come strumento prezioso per rilevare potenziali imprecisioni nella modellazione di proteine e ligandi²².

L'eterogeneità composizionale può essere presente in un complesso proteina-ligando in cui solo una popolazione specifica può avere il ligando presente (se il ligando è di basso peso molecolare, la fase di classificazione potrebbe non rimuovere l'eterogeneità). Tuttavia, è importante eseguire la classificazione 3D⁶³ in modo iterativo durante l'elaborazione delle immagini prima della modellazione del ligando e verificare se la densità del ligando migliora. Se sono presenti più copie di proteine, è necessario prestare attenzione quando si applica la simmetria sulla mappa durante la generazione e il perfezionamento iniziale del modello, poiché ciò potrebbe mediare la densità del ligando in tutte le molecole correlate alla simmetria. La simmetria dovrebbe essere imposta solo dopo che la mappa è stata accuratamente ispezionata per confermare la presenza di densità del ligando in tutte le catene proteiche.

A seconda dello stato (cristallo o soluzione) e della posizione (sepolto o superficie), gli atomi possono essere dinamici e, nel raffinamento del modello, questo viene indicato come parametro di spostamento atomico (ADP). Insieme alla mappa delle differenze, che fornisce indizi visivi su possibili imprecisioni nel modello, i valori ADP possono essere utilizzati per valutare l'accuratezza dei ligandi dopo l'affinamento 64,65,66,67. Tipicamente, il ligando dovrebbe avere valori di ADP simili a quelli dei residui circostanti, cioè se sono legati stabilmente e modellati accuratamente. Tuttavia, i ligandi alla periferia o gli atomi di un ligando (come i lipidi) che sono lontani dalle macromolecole possono avere valori di ADP più elevati. Oltre ad affinare le coordinate, sia Refmac^33,34 che Phenix permettono di affinare i valori ADP ^28,68. In Refmac, l'approssimazione di Mott-Bethe viene utilizzata per calcolare il fattore di scattering elettronico dei singoli atomi durante il calcolo della mappa. Nella recente versione di Phenix, è stato introdotto il raffinamento individuale del fattore B, simile alla cristallografia, per tenere conto del disordine atomico. Molto spesso, nei modelli raffinati derivati dalla crioEM, si osserva un'ampia gamma di valori ADP (a volte valori vicini allo zero), e anche il Q-score che viene utilizzato nell'EMDB per valutare l'adattamento del modello con la mappa dipende dalla mappa primaria depositata e dalla natura dell'affinamento del fattore B⁶⁰. Nella costruzione di modelli crioEM, vengono spesso utilizzate più mappe e, quindi, le mappe utilizzate nella modellazione e nel perfezionamento dovrebbero essere chiaramente menzionate nei metodi, poiché a causa della risoluzione anisotropa in molte macromolecole, una singola mappa potrebbe non essere sufficiente per spiegare tutti i dettagli. 

Nella modellazione dei ligandi nelle macromolecole, uno dei principali limiti delle mappe cryoEM (come in cristallografia) è che se il sito di legame del ligando è di bassa risoluzione o se il ligando legato è dinamico, allora accertare la corretta conformazione può rivelarsi difficile. Inoltre, la maggior parte delle strutture crioEM ha risoluzioni inferiori a 3 Å e la rappresentazione delle molecole d'acqua nelle mappe è limitata, rendendo difficile valutare il ruolo dell'idratazione nel legame del ligando o del farmaco (come mostrato qui con gli esempi di enolasi e mGluR). I metodi computazionali possono essere utilizzati in combinazione con i dati cryoEM per affrontare queste limitazioni⁶⁹. A differenza della cristallografia, solo il modello viene perfezionato, non la mappa. Attualmente, l'unico metodo per indicare la presenza di un ligando o garantire una modellazione accurata è la generazione di mappe di omissione (utilizzando strumenti come Servalcat). Pertanto, ci sono una serie di strumenti per aiutare i ricercatori a costruire e valutare il modello, ma ci sono diverse aree nel perfezionamento del modello in cui ci si può aspettare nuovi approcci o modifiche degli approcci attuali nel prossimo futuro.

In questo articolo, ci siamo concentrati sugli attuali approcci per la modellazione dei ligandi, che includono l'ispezione manuale della densità del ligando, la generazione del file di geometria del ligando, seguita dalla modellazione del ligando nella mappa cryoEM. Questo è un periodo entusiasmante per la biologia strutturale e la scoperta di farmaci, poiché i rivelatori diretti di elettroni con frame rate più elevati e l'uso di un'acquisizione dati più veloce^hanno portato all'ottenimento di mappe ad alta risoluzione (<2,8 Å) di diverse macromolecole spesso legate con ligandi di piccole molecole in un tempo relativamente breve. La recente introduzione di strumenti automatizzati per la modellazione dei ligandi come GEMspot⁶⁹ nella suite Schrodinger e EMERALD¹⁷ nella suite Rosetta, che tenta di trovare la posa legata più probabile del ligando tenendo conto dei dati sperimentali cryoEM, promette di semplificare e automatizzare questo processo. Analogamente alla cristallografia a raggi X, si prevede che l'identificazione delle modalità di legame dei ligandi a piccole molecole mediante cryoEM, forse due o più in un solo giorno, diventerà una possibilità realistica.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCP4-8.0	Consorzio di diversi istituti	https://www.ccp4.ac.uk	gratuito per gli utenti accademici e include Coot e l'elenco degli strumenti sviluppati per la cristallografia a raggi X
CCP-EM	Consorzio di diversi istituti	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	gratuito per gli utenti accademici e include Coot, Relion e molti altri
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	Software generale per la costruzione di modelli, ma disponibile anche con altre suite sopra descritte
DockinMap (Phenix)	Consorzio di diversi istituti	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Software all'interno della suite Phenix per l'aggancio del modello nelle mappe cryoEM
dati di microscopia elettronica...	Consorzio di diversi istituti	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Repository Pubblico per Mappe di Microscopia Elettronica
Falcon	Thermo Fisher Scientific"	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Commercial, fotocamera di Thermo Fisher
Phenix	Consorzio di diversi istituti	https://phenix-online.org/download	gratuito per utenti accademici e comprende Coot
Protein Data	Bank Consorzio di diversi istituti	https://rcsb.org	Database pubblico di strutture macromolecolari
Pymol	Schrodinger	https://pymol.org/2/	Strumento di viusalizzazione molecolare. La versione educativa è gratuita ma ha delle limitazioni. La versione completa può essere ottenuta con una piccola tassa.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	Software per l'elaborazione delle immagini cryoEM, disponibile anche con CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific.	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Commerciale, crioTEM da Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	Software generico per la visualizzazione, l'analisi e altro
UCSF Chimera X	UCSF, USA		https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Software generico per la visualizzazione, l'analisi e altro ancora