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Articolo metodologico

Un approccio di clonazione senza soluzione di continuità per la costruzione di vettori di espressione del virus della sindrome riproduttiva e respiratoria dei suini

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DOI:

10.3791/66320

⸱

17 maggio 2024

 ,  , 
1College of Life Sciences, China West Normal University, 2Sichuan Sports College, 3Pathology Department, Suining Central Hospital

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere il vettore di espressione di pVAX1-PRRSV introducendo opportuni siti di restrizione all'estremità 3' degli inserti. Possiamo linearizzare il vettore e unire i frammenti di DNA al vettore uno per uno attraverso la tecnologia di ricombinazione omologa.

Abstract

La costruzione di vettori di espressione genica è una componente importante del lavoro di laboratorio in biologia sperimentale. Con i progressi tecnici come Gibson Assembly, la costruzione vettoriale diventa relativamente semplice ed efficiente. Tuttavia, quando il genoma completo del virus della sindrome riproduttiva e respiratoria suina (PRRSV) non può essere facilmente amplificato da una singola reazione a catena della polimerasi (PCR) dal cDNA, o è difficile acquisire un vettore di espressione genica a lunghezza intera mediante ricombinazione omologa di più inserti in vitro, l'attuale tecnica di assemblaggio di Gibson non riesce a raggiungere questo obiettivo.

Di conseguenza, abbiamo mirato a dividere il genoma del PRRSV in diversi frammenti e a introdurre siti di restrizione appropriati nel primer inverso per ottenere frammenti amplificati con PCR. Dopo aver unito il precedente frammento di DNA nel vettore mediante la tecnologia di ricombinazione omologa, il nuovo vettore ha acquisito il sito di scissione dell'enzima di restrizione. Pertanto, possiamo linearizzare il vettore utilizzando il sito di scissione enzimatica appena aggiunto e introdurre il successivo frammento di DNA a valle del frammento di DNA a monte.

Il sito di scissione dell'enzima di restrizione introdotto all'estremità 3' del frammento di DNA a monte sarà eliminato e un nuovo sito di scissione sarà introdotto all'estremità 3' del frammento di DNA a valle. In questo modo, possiamo unire i frammenti di DNA al vettore uno per uno. Questo metodo è applicabile per costruire con successo il vettore di espressione PRRSV ed è un metodo efficace per assemblare un gran numero di frammenti nel vettore di espressione.

Introduzione

Come tecnica essenziale per costruire strumenti sperimentali basati sul DNA per l'espressione in cellule procariotiche ed eucariotiche, il clonaggio molecolare è una componente molto importante della biologia sperimentale. Il clonaggio molecolare prevede quattro processi: l'acquisizione del DNA dell'inserto, la legatura dell'inserto nel vettore appropriato, la trasformazione del vettore ricombinante in Escherichia coli (E. coli) e l'identificazione dei cloni positivi1. Finora, sono stati adottati diversi metodi per unire le molecole di DNA utilizzando gli enzimi di restrizione 2,3 e la ricombinazione mediata da PCR 4,5,6. La ricombinazione omologa, nota come tecnologia di clonazione senza soluzione di continuità, è l'insieme dei metodi di clonaggio, che consente l'inserimento indipendente dalla sequenza e senza cicatrici di uno o più frammenti di DNA in un vettore. Questa tecnologia include il clonaggio indipendente dalla sequenza e dalla legatura (SLIC), l'estratto di clonazione per ligazione senza soluzione di continuità (SLiCE), l'In-Fusion e l'assemblaggio Gibson. Impiega un'esonucleasi per degradare un filamento dell'inserto e un vettore per generare estremità coesive, e la riparazione in vivo o la ricombinazione in vitro per unire covalentemente l'inserto al vettore formando legami fosfodiestere. La possibilità di unire un singolo inserto a un vettore in qualsiasi sequenza senza cicatrici è molto interessante. Inoltre, la tecnologia ha la capacità di unire 5-10 frammenti in un ordine predeterminato senza restrizioni di sequenza.

Come una delle tante tecniche di DNA ricombinante, la tecnica di assemblaggio di Gibson, attualmente il metodo di clonazione più efficace 7,8, è un metodo robusto ed elegante basato sull'esonucleasi per assemblare uno o più frammenti di DNA linearizzati senza soluzione di continuità. La reazione di assemblaggio di Gibson viene eseguita in condizioni isoterme utilizzando una miscela di tre enzimi, vale a dire l'esonucleasi 5', la polimerasi ad alta fedeltà e una DNA ligasi termostabile. Le sporgenze a filamento singolo di 3' create dall'esonucleasi 5'-3' contribuiscono alla ricottura di frammenti che condividono complementarità a un'estremità. La polimerasi ad alta fedeltà riempie efficacemente le lacune nelle regioni a singolo filamento ricotto aggiungendo dNTP e la DNA ligasi termostabile sigilla le tacche per formare molecole di DNA congiunte8. Pertanto, questo metodo tecnico è stato ampiamente utilizzato per la costruzione di vettori di espressione genica.

La sindrome riproduttiva e respiratoria dei suini (PRRS) è una malattia virale che porta a compromissione riproduttiva e insufficienza respiratoria nei suini causata da PRRSV a qualsiasi età di9 anni. La sindrome si manifesta con febbre, anoressia, polmonite, letargia, depressione e distress respiratorio. Inoltre, in alcune epidemie sono stati osservati segni clinici, tra cui la colorazione rosso/blu delle orecchie. Come membro della famiglia degli arterivirus, il PRRSV è ampiamente trasmesso ai paesi produttori di carne suina attraverso il contatto diretto e lo scambio di fluidi, tra cui urina, colostro e saliva. A causa della diffusione del PRRSV negli Stati Uniti, le perdite economiche totali dell'industria suina sono state stimate in circa 664 milioni di dollari all'anno, sulla base della scala di allevamento di 5,8 milioni di scrofe e 110 milioni di suini10,11. Il rapporto dell'Animal and Plant Health Inspection Service mostra che il 49,8% dei suini non vaccinati mostra la presenza di PRRSV nel siero12 e bassi livelli di PRRSV nei suini infetti vengono escreti attraverso la saliva, le secrezioni nasali, l'urina e le feci13. Sono state implementate diverse strategie per controllare la propagazione del PRRSV 14,15,16. Oltre alle procedure di eliminazione per creare popolazioni completamente negative al virus o migliorare la biosicurezza e la gestione, la somministrazione di vaccini è un mezzo efficace per controllare la PRRS.

Il PRRSV è un virus a RNA a senso positivo con involucro, a filamento singolo, con una lunghezza di circa 15 kilobasi (kb). Il genoma del PRRSV è costituito da almeno 10 frame di lettura aperti (ORF), una breve regione non tradotta di 5' (5' UTR) e una coda di poli(A) al terminale di 3' (Figura 1A)17. Il genoma di un virus a RNA a filamento negativo non è infettivo, mentre il genoma dei virus a RNA a filamento positivo è infettivo. Esistono due strategie principali per la trasfezione dell'RNA e del DNA per generare la progenie virale18. Tuttavia, la clonazione del frammento a lunghezza intera corrispondente al genoma dell'RNA è fondamentale per la costruzione di cloni infettivi. A causa della natura lunga e complessa del genoma del PRRSV, il genoma completo non può essere facilmente ottenuto attraverso la PCR in una sola volta. Inoltre, sebbene la sintesi artificiale dei geni del PRRSV sia una soluzione efficace, la sintesi di frammenti lunghi è spesso costosa. Quindi, per ottenere il vettore di espressione a lunghezza intera del PRRSV, abbiamo tentato di crearlo con il metodo di ricombinazione omologa a inserti multipli19,20. Sfortunatamente, non siamo stati in grado di ottenere il vettore di espressione genica a lunghezza intera. Pertanto, in questo studio, abbiamo aggiunto siti di restrizione appropriati al primer inverso e abbiamo ottenuto con successo il vettore di espressione pVAX1-PRRSV mediante diversi cicli di reazioni di ricombinazione omologa. Inoltre, questo metodo può anche ottenere la delezione o la mutazione di geni bersaglio e unire in modo efficiente un gran numero di frammenti di DNA al vettore di espressione.

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Protocollo

1. Preparazione del modello del gene PRRSV

  1. Scongelare lo stock virale in 1 mL di reagente per l'estrazione dell'RNA (vedere la Tabella dei materiali).
  2. Aggiungere 0,2 mL di cloroformio e mescolare accuratamente. Incubare per 3 min.
  3. Centrifugare la miscela per 15 minuti a 12.000 × g a 4 °C.
    NOTA: La miscela è divisa in tre fasi, vale a dire una fase acquosa incolore, un'interfase e una fase fenolo-cloroformio rosso.
  4. Pipett la fase acquosa incolore e trasferirla in un nuovo tubo.
  5. Miscelare accuratamente la fase acquosa con 0,5 mL di isopropanolo e incubare per 10 minuti a 4 °C.
  6. Centrifugare per 10 minuti a 12.000 × g a 4 °C.
    NOTA: Il fondo della provetta ha un precipitato di RNA bianco.
  7. Utilizzare una micropipetta per scartare il surnatante della provetta.
  8. Aggiungere 1 ml di etanolo al 75% per risospendere il pellet e agitare brevemente.
  9. Centrifugare per 5 minuti a 7.500 × g a 4 °C. Utilizzare una micropipetta per scartare il surnatante della provetta.
  10. Asciugare l'RNA per 5 minuti, aggiungere 20-50 μL di acqua priva di RNasi per risospendere l'RNA e mescolare accuratamente.
  11. Procedere all'esecuzione della trascrizione inversa; impostare le reazioni per eseguire la trascrizione inversa come mostrato nella Tabella 1.
    NOTA: Per garantire il successo della trascrizione inversa, utilizzare modelli di RNA di alta qualità.
  12. Utilizzare il cDNA risultante per la PCR o conservarlo a -20 °C.

2. Progettazione del primer PCR

  1. Progettazione del primer in avanti
    1. Apri il software e scegli Nuovo file DNA.
    2. Incolla la sequenza genica PRRSV (GenBank: FJ548852.1) da NCBI nel software. Fare clic su OK per generare i file di sequenza.
    3. Analizza la sequenza e segna le giunzioni dei frammenti. Progetta il primer di sequenza specifico in avanti dei frammenti. Nella maggior parte dei casi, la temperatura di fusione (Tm) preferibile è compresa tra 55 °C e 62 °C e il contenuto di GC è del 40-60%.
    4. Fare clic su Primer e scegliere Aggiungi primer.
    5. Incolla la sequenza specifica e aggiungi le sequenze sovrapposte del vettore al primo nucleotide 5' del primer di sequenza specifica. Vicino a ciascuna giunzione, scegli 20-40 bp come regione di sovrapposizione tra i due frammenti adiacenti.
    6. Assegnare un nome all'innesco in avanti contenente le sporgenze e la sequenza specifica (vedere la Figura S1 supplementare).
    7. Fare clic su Aggiungi primer al modello.
  2. Progettazione del primer inverso
    1. Analizza la sequenza e contrassegna le giunzioni dei frammenti nel software. Progetta il primer della sequenza specifica inversa dei frammenti.
    2. Fare clic su Primer e scegliere Aggiungi primer.
    3. Incolla la sequenza specifica e aggiungi il sito di restrizione al primo nucleotide 5' del primer della sequenza specifica.
      NOTA: I siti di restrizione aggiunti devono essere assenti dal frammento di inserimento e dal vettore, ad eccezione dei siti di clonazione multipli.
    4. Aggiungere sequenze di 20-40 bp di vettori al primo nucleotide 5' del sito di restrizione.
    5. Nominare il primer inverso contenente le sporgenze e la sequenza specifica (vedi Figura supplementare S1).
    6. Fare clic su Aggiungi primer al modello.

3. PCR per amplificare i frammenti

  1. Impostare sei reazioni PCR individuali (Tabella 2): per il frammento 1, utilizzare i primer P1 e P2 (vedere la Figura S2 supplementare); per il frammento 2, utilizzare i primer P3 e P4 (vedi Figura Supplementare S2); per il frammento 3, utilizzare i primer P5 e P6 (vedi Figura S2 supplementare); per il frammento 4, utilizzare i primer P7 e P8 (vedi Figura S2 supplementare); per il frammento 5, utilizzare i primer P9 e P10; e utilizzare i primer P11 e P12 per amplificare il frammento 6 (vedi Figura supplementare S2).
    NOTA: Scongelare, mescolare e centrifugare brevemente ogni componente prima dell'uso.
  2. Eseguire la PCR utilizzando il protocollo in tre fasi nella Tabella 2.
  3. Aggiungere 1 μL di tampone di caricamento DNA 6x a 5 μL di prodotto PCR, mescolare e centrifugare brevemente il contenuto.
  4. Analizzare i campioni utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio all'1%.

4. Purificazione dei frammenti di PCR

NOTA: La purificazione dei prodotti PCR da un gel utilizzando un kit di estrazione del gel (vedere la Tabella dei materiali) è importante per la costruzione del vettore.

  1. Aggiungere 9 μL di tampone di caricamento DNA 6x a 45 μL di prodotti PCR, mescolare e centrifugare brevemente il contenuto.
  2. Eseguire l'elettroforesi con gel di agarosio/goldview all'1% per separare i frammenti di DNA.
    NOTA: Non riutilizzare il tampone di corsa TAE poiché il suo valore di pH influenzerà il recupero del frammento di DNA.
  3. Dopo un'adeguata separazione delle bande, utilizzare un bisturi affilato per asportare accuratamente le bande di DNA.
    NOTA: Ridurre al minimo le dimensioni della fetta di gel tagliando l'agarosio in eccesso.
  4. Pesare la fetta di gel in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 ml, aggiungere un volume uguale di tampone legante alla fetta di gel (ad esempio, 0,3 ml per una fetta di 0,3 g) e incubare a 60 °C per 7 minuti.
  5. Inserire una mini colonna in una provetta di raccolta da 2 mL. Aggiungere 700 μL di soluzione di DNA/agarosio dalla fase 4.4 alla mini colonna.
  6. Centrifugare a 10.000 × g per 1 minuto a temperatura ambiente. Eliminare il filtrato e riutilizzare la provetta di raccolta.
  7. Aggiungere 300 μl di tampone legante e centrifugare a 13.000 × g per 1 minuto a temperatura ambiente. Eliminare il filtrato e riutilizzare la provetta di raccolta.
  8. Aggiungere 700 μl di tampone di lavaggio e centrifugare a 13.000 × g per 1 minuto a temperatura ambiente. Eliminare il filtrato e riutilizzare la provetta di raccolta.
  9. Centrifugare la mini colonna vuota per 2 minuti alla massima velocità per asciugare la matrice della colonna. Posizionare la mini colonna in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 mL.
  10. Aggiungere 20 μL di acqua deionizzata direttamente al centro della membrana della colonna e lasciare riposare a temperatura ambiente per 2 minuti. Centrifugare a 13.000 × g di velocità per 1 min.
  11. Conservare il DNA a -20 °C.

5. Preparazione di un vettore linearizzato

NOTA: Dopo aver preparato il plasmide, gli enzimi selezionati possono essere utilizzati per tagliarlo. La digestione lunga o digestione a doppio enzima è fondamentale per garantire la digestione di tutto il DNA. Ciò ridurrà il numero di cloni falsi positivi negli esperimenti successivi.

  1. Linearizzazione pVAX1
    1. Preparare la miscela di reazione a temperatura ambiente nell'ordine indicato (Tabella 3).
      NOTA: Il volume d'acqua deve essere aggiunto per mantenere il volume totale di reazione indicato. Qui, 1 μg del plasmide è stato digerito con enzimi nella miscela di reazione. A seconda della concentrazione del plasmide, il volume del plasmide può essere regolato nella miscela di reazione.
    2. Mescolare delicatamente; Quindi gira verso il basso. Incubare a 37 °C in un blocco termico o in un termostato ad acqua per 60 min.
    3. Eseguire la purificazione su gel in modo simile alla purificazione dei frammenti della PCR nella sezione 4 utilizzando il kit di estrazione del gel (vedere la Tabella dei materiali).
  2. Linearizzazione pVAX1-F1
    NOTA: pVAX1-F1 è il vettore ottenuto dal primo ciclo di ricombinazione di pVAX1 (NdeI e HindIII) e frammento 1. pVAX1-F2 è il vettore ottenuto dal ciclo di ricombinazione di pVAX1-F1 (NdeI) e frammento 2. pVAX1-F3 è il vettore ottenuto dal ciclo di ricombinazione di pVAX1-F2 (NdeI) e frammento 3. pVAX1-F4 è il vettore ottenuto dal ciclo di ricombinazione di pVAX1-F3 (NdeI) e frammento 4. pVAX1-F5 è il vettore ottenuto dal ciclo di ricombinazione di pVAX1-F4 (EcoRV e NtoI) e dal frammento 5.
    1. Per ciascun vettore, preparare separatamente la miscela di reazione a temperatura ambiente nell'ordine indicato (tabella 3).
    2. Mescolare delicatamente; Quindi gira verso il basso. Incubare a 37 °C in un blocco termico o in un termostato ad acqua per 60 min.
    3. Eseguire la purificazione su gel in modo simile alla purificazione dei frammenti della PCR nella sezione 4 utilizzando il kit di estrazione del gel (vedere la Tabella dei materiali).

6. Subclonazione su un nuovo vettore

NOTA: È possibile ottenere una buona efficienza di clonazione utilizzando 50-200 ng di vettore e inserti.

  1. Impostare la clonazione senza soluzione di continuità e la reazione di assemblaggio ExonArt (Tabella 4). Regolare il volume totale di reazione a 10 μl utilizzando H2O deionizzato sterilizzato e mescolare.
  2. Incubare la reazione in un termociclatore per 15-60 minuti a 50 °C. Conservare i campioni sul ghiaccio.
    NOTA: Estendere l'incubazione fino a 60 minuti può migliorare l'efficienza dell'assemblaggio.
  3. Scongelare le cellule DH5α chimicamente competenti sul ghiaccio.
  4. Aggiungere 10 μl di prodotto di assemblaggio alle celle competenti; Quindi, miscelare delicatamente pipettando su e giù.
  5. Mettere il composto sul ghiaccio per 30 minuti.
  6. Shock termico a 45 °C per 45 s e trasferire i tubi sul ghiaccio per 3 min.
  7. Aggiungere 900 μl di terreno SOC alla provetta.
  8. Agitare il tubo a 225 giri/min per 1 ora in un'incubatrice con agitazione a 37 °C.
  9. Centrifugare la reazione di trasformazione a 6.000 × g per 2 min. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 100 μl di terreno SOC fresco.
  10. Stendere la sospensione cellulare trasformata su una piastra LB separata con 50 μg/mL di kanamicina.
  11. Incubare tutte le piastre per una notte a 37 °C. Scegli le singole colonie isolate da ogni piastra sperimentale.

7. Analisi dei trasformanti

  1. Prelevare otto colonie in 20 μL di terreno LB contenente 50 μg/mL di kanamicina.
  2. Impostare la reazione di PCR della colonia ed eseguire la PCR (Tabella 5).
    NOTA: Per la reazione di PCR della colonia per il frammento 1, utilizzare i primer P1 e P2 (vedi File supplementare 1); per il frammento 2, utilizzare i primer P3 e P4 (vedi File supplementare 1); per il frammento 3, utilizzare i primer P5 e P6 (vedi File supplementare 1); per il frammento 4, utilizzare i primer P7 e P8 (vedi Figura S2 supplementare); per il frammento 5, utilizzare i primer P9 e P10; e utilizzare i primer P11 e P12 per rilevare il frammento 6 (vedi Figura supplementare S2).
  3. Aggiungere 1 μl di tampone di caricamento del DNA 6x a 5 μl del prodotto PCR, mescolare e centrifugare brevemente il contenuto.
  4. Analizzare i risultati utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio all'1%.
  5. Selezionare una colonia positiva in 5 mL di terreno LB contenente 50 μg/mL di kanamicina e far crescere per una notte a 37 °C.
  6. Ottenere il plasmide utilizzando un mini kit di DNA plasmidico (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
  7. Visualizzare i risultati utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio all'1%.

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Risultati

In questo articolo, presentiamo un sistema di ricombinazione in vitro per assemblare e riparare molecole di DNA sovrapposte utilizzando il primer inverso tramite siti di restrizione introdotti continuamente (Figura 1B). Questo sistema è una procedura semplice ed efficiente che comprende la preparazione del vettore lineare e dei frammenti di inserto contenenti sporgenze introdotte mediante PCR con primer aventi appropriate sequenze di estensione 5' e siti di restrizione; una singola ...

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Discussione

La tecnica di assemblaggio di Gibson è un metodo di clonaggio molecolare basato sulla ricombinazione in vitro per l'assemblaggio di frammenti di DNA8. Questo metodo consente l'assemblaggio di più frammenti di DNA in un plasmide circolare in una reazione isotermica a provetta singola. Tuttavia, uno degli ostacoli alla tecnica di assemblaggio di Gibson è l'acquisizione di lunghi frammenti dal cDNA. I frammenti lunghi sono difficili da amplificare con precisione per molte ragioni. Ad esempio...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal sostegno finanziario dei fondi per l'avvio della ricerca di dottorato forniti dalla China West Normal University (n. 20E059).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 kb più DNA LadderTiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., LtdMD113-02
2x Universal Green PCR Master MixRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA303-1
AgaroseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.9012-36-6
Microcentrifuga da bancoThermo Fisher Scientific  Co., LtdFRESCO17
Banco pulitoSujing Antai Air Technology  Co., LtdVD-650-U
Attrezzatura per elettroforesi del DNAMannaia Scientific  Co., Ltd170905117
Tampone di caricamento del DNA (6x)Biosharp Biotechnology Co., LtdBL532A
Kit di estrazione del gel E. Z. N. A. OmegaBio-Tek Co., LtdD2500-01
Mini kit di DNA plasmidico E.Z.N.A. IOmega Bio-Tek Co., LtdD6943-01
Coltivatore a temperatura eretta con elettroriscaldamentoShanghai Hengyi Scientific Instrument Co., LtdDHP-9082
Kit di clonazione e assemblaggio senza cuciture ExonArtRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA101-02
ExonScript RT SuperMix con dsDNaseRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)Thermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0303
FastDigest HindIIIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0504
FastDigest NheIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0974
FastDigest NotIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0596
Gel Doc XRBio-Rad Laboratories Co., Ltd721BR07925
Goldview Colorazione in gel per acido nucleicoShanghai Yubo Biotechnology Co., LtdYB10201ES03
Macchina per fabbricare il ghiaccioShanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., LtdFMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA polimerasiThermo Fisher Scientific  Co., Ltd12361010
LB Agar Plate (Kanamicina)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B530113-0010
LB terreno liquido sterile (Kanamicina)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113-0001
MicropipettatoriThermo Fisher Scientific  Co., Ltd—
Forno a microondePanasonic Electric (China) Co., LtdNN-GM333W
Agitatori orbitaliShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LtdZHWY-2102C
PRRSV virusSichuan Agricultural University...
SnapGeneGSL Biotech, LLCv5.1Per progettare primer
T100 PCR Gradient Thermal CyclerBio-Rad Laboratories  Co., LtdT100 Thermal Cycler
TAE bufferSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B040123-0010
Reagente TRIzolThermo Fisher Scientific  Co., Ltd15596026Reagente per estrazione di RNA

Riferimenti

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