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Articolo metodologico

Perfusione chirurgica e isolamento del pancreas suino per l'isolamento delle isole

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DOI:

10.3791/66350

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7 giugno 2024

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1Department of Surgery, Section of Vascular Surgery, Washington University School of Medicine, 2CardioVascular Research Innovation in Surgery and Engineering Center, Washington University School of Medicine, 3Department of Medicine, Division of Nephrology, Washington University School of Medicine, 4Department of Medicine, Division of Endocrinology, Washington University School of Medicine, 5Department of Surgery, Section of Transplant Surgery, Washington University School of Medicine, 6Division of Molecular Cell Biology, Washington University School of Medicine, 7Department of Biomedical Engineering, Washington University McKelvey School of Engineering

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo fornisce una guida passo passo per l'approvvigionamento di un pancreas suino per l'isolamento e la purificazione delle isole.

Abstract

Il trapianto di isole pancreatiche è un trattamento emergente per il diabete di tipo I; Tuttavia, è limitato dalla corrispondenza e dalla disponibilità dei donatori. Lo xenotrapianto di isole suine offre un'alternativa promettente all'allotrapianto, con il potenziale per la produzione su larga scala di isole funzionali su richiesta. La resa e la vitalità delle isole isolate è altamente suscettibile alla qualità del pancreas donatore e al metodo di approvvigionamento, in particolare alla durata del tempo di ischemia calda. Per migliorare la conservazione degli organi e la successiva resa e vitalità delle isole matrici, abbiamo sviluppato un protocollo per la perfusione chirurgica e la resezione del pancreas suino. Questo protocollo impiega l'incannulamento aortico infrarenale diretto e la perfusione d'organo per ridurre al minimo il tempo di ischemia calda e semplificare la procedura per gli operatori che non dispongono di una vasta esperienza chirurgica. La successiva perfusione arteriosa del pancreas attraverso l'aorta elimina il sangue stagnante dalla microvascolarizzazione, riducendo così la trombosi e il danno ossidativo al tessuto. Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per la perfusione chirurgica e la resezione del pancreas suino, seguita dall'isolamento e dalla purificazione delle isole suine.

Introduzione

Il diabete di tipo 1 è causato dalla distruzione autoimmune delle cellule beta pancreatiche1. Di conseguenza, i pazienti sono dipendenti dall'insulina esogena, esponendoli a fluttuazioni glicemiche ad alto rischio con episodi di iper- e ipoglicemia2. L'allotrapianto di isole è una potenziale cura per il diabete di tipo I; Tuttavia, la limitata disponibilità di donatori di organi pancreatici rimane un ostacolo importante all'adozione diffusa della procedura 2,3. Lo xenotrapianto di isole da donatori suini è un'alternativa promettente in quanto questi animali sono prontamente disponibili. L'ottimizzazione e il ridimensionamento dell'isolamento delle isole pancreatiche suine saranno fondamentali per il progresso dello xenotrapianto di isole matrici.

Sebbene diverse tecniche di approvvigionamento del pancreas suino siano state precedentemente pubblicate, molte di queste procedure descrivono la pancreatectomia dopo induzione di morte cardiaca o dissanguamento 4,5,6,7,8,9,10. Uno dei principali svantaggi di queste tecniche è il tempo ischemico caldo variabile (WIT) che si verifica tra il momento della morte cardiaca e l'inizio dell'infusione intraarteriosa e/o intraduttale di soluzione di conservazione. Anche 10 minuti di WIT avranno un impatto negativo sulla resa e sulla vitalità dell'isola5. Per ridurre al minimo il WIT è necessaria una rapida perfusione del pancreas con una soluzione di conservazione. Durante l'approvvigionamento degli organi addominali, l'incannulamento aortico seguito da perfusione intracorporea con la soluzione dell'Università del Wisconsin (UW) è fondamentale per rimuovere il sangue, prevenire la trombosi intravascolare, proteggere dal danno ischemico e ridurre al minimo il danno cellulare11,12.

Studi precedenti hanno dimostrato che durante l'approvvigionamento del pancreas suino, il lavaggio a bassa pressione del tronco celiaco e dell'arteria mesenterica superiore con la soluzione UW migliora la resa e la purezza delle isole4. Tuttavia, i metodi precedentemente pubblicati per l'approvvigionamento del pancreas suino includono l'incannulamento aortico aperto, che può essere tecnicamente impegnativo, in particolare per i suini più piccoli 13,14,15. In questo manoscritto, presentiamo un protocollo dettagliato e passo dopo passo con ausili visivi di accompagnamento per la perfusione chirurgica e l'approvvigionamento del pancreas suino, seguito dall'isolamento e dalla purificazione delle isole suine. Questa nuova tecnica di incannulamento aortico durante l'isolamento pancreatico è stata sviluppata specificamente per ridurre al minimo il WIT e consentire l'approvvigionamento pancreatico in un campo incruento come mezzo per massimizzare la resa e la vitalità dell'isolamento delle isole.

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Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Divisione di Medicina Comparata della Washington University School of Medicine. I suini adulti dello Yorkshire di peso compreso tra 35 e 35 kg sono ideali per questa procedura; Tuttavia, il protocollo può essere adattato per suini di diverse dimensioni a seconda del contesto sperimentale. L'intera procedura deve essere eseguita in modo sterile in una sala operatoria.

1. Preparazione preoperatoria e anestesia

  1. Sedare il maiale con un cocktail di 4 mg/kg di tiletamina e zolazepam, 20 mg/kg di ketamina e 2 mg/kg di xilazina iniettati per via intramuscolare.
  2. Stabilire l'accesso venoso periferico attraverso la vena auricolare.
  3. Indurre l'anestesia generale con isoflurano inalato all'1%-3% in ossigeno al 100% e intubare endotrachealmente il maiale.
    NOTA: Si può preferire l'uso del propofol o di qualsiasi altro agente di induzione per via endovenosa rispetto all'inalante per l'induzione per una procedura di induzione e intubazione più fluida. I segni vitali, la CO2 di fine espirazione, la saturazione di ossigeno e la forma d'onda cardiaca vengono continuamente monitorati per valutare e mantenere la profondità dell'anestesia. Il piano chirurgico addominale viene confermato mediante ecografia al letto del paziente.
  4. Radere e preparare il maiale con clorexidina gluconato dalla tacca sternale all'inguine bilaterale.
  5. Tendere il campo operatorio con una visione chiara di tutto l'addome (Figura 1A).

2. Impostazione operativa ed esposizione del retroperitoneo

  1. Eseguire un'incisione laparotomica sulla linea mediana (Figura 1B).
    1. Utilizzare un bisturi a 10 lame e l'elettrocauterizzazione per eseguire una laparotomia sulla linea mediana dal processo xifoideo al pube. Fare attenzione a curvare l'incisione attorno all'apertura urogenitale addominale inferiore.
  2. Eseguire una rotazione viscerale destra.
    1. Esternalizzare il colon destro e l'intestino tenue, avvolgendoli in un asciugamano sterile.
    2. Ritrarre delicatamente il colon e l'intestino a sinistra per esporre il retroperitoneo destro evitando la torsione intestinale o la malrotazione.
  3. Svuotare la vescica (opzionale).
    1. Se la vescica è piena e l'esposizione è impattante, afferrare la vescica tra due pinze DeBakey e utilizzare un bisturi a 11 lame per incidere la parete ventrale della vescica.
    2. Posizionare una punta di aspirazione Yankauer nella vescica per drenare l'urina e decomprimere la vescica.
  4. Impostare un set di divaricatori addominali per facilitare l'esposizione ottimale del retroperitoneo destro (Figura 1C).

3. Dissezione retroperitoneale

  1. Iniziare la dissezione retroperitoneale (Figura 2A).
    1. Utilizzando l'elettrocauterizzazione, incidere il peritoneo a destra della linea mediana, dal livello del rene destro alla biforcazione aortica.
    2. Esporre bruscamente l'aorta infrarenale, la vena cava inferiore (IVC) e l'arteria e la vena renale destra
  2. Ottenere il controllo circonferenziale dell'aorta infrarenale distale con un'ampia ansa vasativa.
  3. Contestare l'IVC (Figura 2B).
    1. Ottenere il controllo circonferenziale dell'IVC medio-infrarenale.
    2. Lega l'IVC usando una cravatta di seta 2-0.
  4. Legare i vasi renali (Figura 2C).
    1. Ottenere il controllo circonferenziale delle arterie e delle vene renali destra e sinistra.
    2. Legare queste strutture usando cravatte di seta 2-0.
    3. Se ci sono più arterie renali, allo stesso modo isolare e legare ciascuno di questi vasi.

4. Dissezione intratoracica

  1. Incidere l'emidiaframma destro (Figura 3A).
    1. Ritrarre delicatamente il fegato inferiormente per esporre l'emidiaframma destro. Applicare due morsetti Allis sulla parte membranosa dell'emidiaframma destro e incidere il diaframma tra i due morsetti utilizzando l'elettrocauterizzazione.
    2. Estendere la miotomia del diaframma a circa 7 cm in orizzontale.
  2. Ottenere il controllo circonferenziale dell'IVC intratoracico (Figura 3B).
    1. Posiziona una cravatta di seta 2-0 attorno all'IVC intratoracico. Spezzare le estremità della sutura con un piccolo emostatico senza occludere l'IVC.
  3. Estendere la diaframmatomia all'emidiaframma sinistro (Figura 3C).
    1. Utilizzare due morsetti Allis per ritrarre il bordo della diaframmatomia inferiormente ed estenderlo all'emidiaframma sinistro.
      NOTA: Evitare di entrare nel pericardio durante la diaframmatomia.
  4. Esporre l'aorta toracica discendente nella regione toracica posteromediale sinistra.

5. Incannulamento dell'aorta infrarenale, isolamento viscerale e perfusione

  1. Anticoagulare sistemicamente il maiale.
    1. Somministrare eparina sistemica (100 U/kg) tramite accesso venoso periferico. Attendere 3 minuti prima di procedere con l'incannulamento aortico.
  2. Accedere all'aorta infrarenale utilizzando un ago per micropuntura da 18 G (Figura 4A).
  3. Passare un filo a J attraverso l'ago nell'aorta e rimuovere l'ago sopra il filo.
  4. Posizionare una guaina da 10Fr sul filo nell'aorta e rimuovere il filo (Figura 4B).
  5. Collegare il tubo IV alla guaina da 10Fr e, in modo sterile, infondere la soluzione UW attraverso la guaina. Infondere la soluzione UW a una velocità di 40-60 gocce/min.
    NOTA: Il flusso non inizierà fino a quando l'aorta toracica non sarà bloccata in modo incrociato. Assicurarsi che il tubo endovenoso non sia in tensione per evitare lo spostamento della guaina intraaortica.
  6. Eseguire l'isolamento viscerale e la perfusione in rapida successione.
    1. Bloccare l'aorta infrarenale utilizzando una pinza aortica.
    2. Bloccare l'aorta toracica discendente utilizzando una pinza aortica.
    3. Lega l'IVC intratoracico con il pareggio 2-0 precedentemente posizionato.
    4. Somministrare 100 mg/kg di KCl per l'eutanasia tramite accesso venoso periferico.
      NOTA: La morte cardiaca inizia con la somministrazione di KCl.
    5. Eseguire una venotomia nell'IVC infrarenale, superiore al legame 2-0, e inserire l'aspirazione con punta in piscina attraverso la venotomia (Figura 4C).
    6. Perfondere i visceri con 2-3 L di soluzione fredda di UW.
    7. Procedere con la dissezione per pancreatectomia totale durante la perfusione.
      NOTA: I visceri, e il pancreas in particolare, dovrebbero diventare pallidi quando la soluzione UW viene perfusa nella regione degli organi solidi (Figura 5A).

6. Pancreatectomia totale

  1. Liberare l'intestino tenue dalla retrazione poiché la soluzione UW è perfusionale.
  2. Iniziare la dissezione dei lobi duodenali, connettivi e splenici del pancreas durante la perfusione viscerale. Ritrarre lo stomaco superiormente per esporre il pancreas. Con una combinazione di dissezione smussata ed elettrocauterizzazione, sezionare il pancreas dai suoi attacchi omentali.
    NOTA: Il corpo del pancreas avvolge efficacemente la vena porta. Fare attenzione ad evitare che la vena porta corra posteriormente al lobo duodenale e poi anteriormente al ponte e ai lobi di collegamento.
  3. Isolare il dotto pancreatico (Figura 5B). Individua il dotto pancreatico dove entra nel duodeno. Legare il condotto usando due fascette di seta 3-0 e sezionare il condotto tra le fascette.
  4. Pancreatectomia completa (Figura 5C).
    1. Sezionare il resto del lobo duodenale dall'ansa C del duodeno fino a quando non è liberamente mobile.
    2. Separare il pancreas dai suoi attacchi rimanenti. Legare e dividere con cura i piccoli vasi dall'arteria mesenterica superiore al pancreas.
    3. Separare il pancreas dalla vena porta. Sezionare il corpo del pancreas e il lobo di collegamento dalla vena porta. Legare tutti i rami venosi dalla vena porta al pancreas, compresa la vena splenica.
      1. Sezionare il ponte del pancreas tra il lobo di collegamento e il lobo splenico per consentire la libera mobilizzazione dalla vena porta.
        NOTA: Fare attenzione a non interrompere il lobo duodenale pancreatico dal lobo splenico.
  5. Immergere l'intero pancreas in una soluzione fredda sterile di UW, ponendo immediatamente il contenitore sul ghiaccio. Trasportare il pancreas in una cappa sterile per l'isolamento delle isole. Procedere con l'isolamento delle isole pancreatiche (Figura 6).

7. Incannulamento del dotto pancreatico

  1. Posizionare il pancreas su una vaschetta sterile con ghiaccio all'interno della cappa di biosicurezza.
  2. Sezionare il tessuto fibroso in eccesso e il sangue lontano dal pancreas.
  3. Se necessario, tagliare il condotto trasversalmente per visualizzare meglio il lume. Individuare e far avanzare la cannula nel dotto con un catetere di dimensioni adeguate (16 G).
  4. Fissare il catetere in posizione con una fascetta di seta 2.0 ma evitare di occludere il lume.
  5. Preparare tre soluzioni di decontaminazione e immergere il pancreas cannulato in ciascuna soluzione di decontaminazione per 60 s.

8. Perfusione e distensione del pancreas

  1. Preparare la soluzione enzimatica per la digestione (Figura 6).
    1. Miscelare 100 mg di soluzioni di collagenasi 1 e 2 disponibili in commercio (vedere la Tabella dei materiali per ulteriori dettagli) con la quantità desiderata di 1x HBSS e 10.000 U di soluzione di eparina. Se il tessuto pancreatico isolato è compreso tra 100 g e 200 g, miscelare l'enzima con 200 mL totali di 1x HBSS e soluzione di eparina.
  2. Infondere nel pancreas la soluzione enzimatica.
    1. Con una forza moderata controllata, infondere la soluzione enzimatica in boli da 60 mL nel dotto pancreatico. Continuare questo processo fino a quando l'intera soluzione enzimatica non viene infusa nel pancreas.
      NOTA: Un'infusione efficace dovrebbe causare la distensione del tessuto pancreatico.
    2. Se una soluzione enzimatica fuoriesce dal tessuto pancreatico nel vassoio sterile, reiniettare la soluzione rimanente nel pancreas al punto 8.3 o posizionarla nella camera Ricordi al punto 9.2.
  3. Iniettare direttamente la soluzione enzimatica rimanente in tutti i segmenti di parenchima pancreatico mal distesi utilizzando un ago da 22 G.

9. Digestione del pancreas

  1. Immergere il serbatoio del circuito contenente 500 ml di 1x HBSS in un bagnomaria impostato a 47 °C per preriscaldare la soluzione del serbatoio.
    NOTA: La soluzione enzimatica funziona in modo ottimale a 36-38 °C e questa temperatura deve essere raggiunta entro 5 minuti dall'avvio della pompa peristaltica. La temperatura del contenuto del Ricordi, compreso il pancreas infuso di enzimi, è inizialmente di 4 °C. Preriscaldando il serbatoio del circuito a 47 °C, il contenuto del serbatoio e della camera Ricordi si mescolerà, portando la temperatura dell'intero circuito fino a 36-38 °C entro 5 minuti dall'avvio della pompa peristaltica.
  2. Rimuovere ed eliminare il catetere dal dotto pancreatico e tagliare il pancreas in pezzi di ~1-3 cm.
  3. Preparare il circuito di digestione. La pompa peristaltica farà circolare la soluzione dal serbatoio del circuito di digestione, attraverso la serpentina di riscaldamento e nella camera Ricordi (Figura 6).
  4. Posizionare i pezzi di pancreas con nove biglie di nitruro di silicio da 1,5 cm all'interno della camera Ricordi e riempire fino al livello del filtro con la soluzione enzimatica rimanente.
  5. Per sigillare la camera Ricordi, posizionare il filtro a rete e la guarnizione in gomma, quindi il coperchio sulla camera Ricordi. Fissare il coperchio della camera Ricordi serrando le viti e assicurarsi che la camera sia ben sigillata prima di procedere.
  6. Mettere la serpentina di riscaldamento in un bagno di acqua calda a 47 °C.
  7. Posizionare le cannule di afflusso e di deflusso nel serbatoio del circuito di digestione contenente 500 mL di 1x HBSS.
  8. Avviare la pompa a una portata di 450 mL/min fino a riempire l'intera camera con la soluzione di digestione. Ridurre la portata a 100 mL/min man mano che il fluido circola all'interno del circuito.
  9. Agitare manualmente la camera di digestione per agitare il tessuto con le biglie di nitruro di silicio.
  10. A partire da 8 minuti di digestione, prelevare un campione da 1 mL dal serbatoio del circuito per la colorazione con ditizone (DTZ) per monitorare l'andamento della digestione.
    1. Per preparare la colorazione DTZ, sciogliere 10 mg di DTZ in 2 mL di dimetilsolfossido (DMSO).
    2. Aggiungere 10 μl del colorante DTZ preparato a 1 ml del campione di digestione. Ispezionare il campione con un ingrandimento 4x. Le isole appariranno dal rosso scuro al nero con colorazione DTZ.
      NOTA: La digestione è completa quando la maggior parte o tutte le isole osservate sono "libere" e intatte, con il tessuto acinarare disperso in gruppi più piccoli.
  11. Quando la digestione è stata giudicata completa, trasferire la bobina nel bagno di ghiaccio, rimuovere la cannula di afflusso dal serbatoio e aumentare la velocità della pompa a 210-250 ml/min. Far defluire il tessuto digerito dalla camera Ricordi nel serbatoio del circuito.
    NOTA: È tipico vedere pochissimo tessuto rimasto nella camera Ricordi dopo la digestione. In genere, rimarrà il <10% del tessuto pancreatico non digerito, anche se questo può variare a causa di fattori specifici del campione.
  12. Pesare il tessuto rimanente per determinare l'efficienza della digestione. Trasferire il tessuto digerito dal serbatoio del circuito in provette coniche da 250 mL che vengono mantenute fresche sul ghiaccio.

10. Raccolta di tessuto pancreatico

  1. Centrifugare il tessuto pancreatico digerito in provette coniche da 250 mL a 250 × g per 1 minuto a 4 °C senza interruzione.
  2. Rimuovere le provette dalla centrifuga con cautela e aspirare il surnatante utilizzando una pipetta sierologica evitando la rottura del pellet.
  3. Risospendere delicatamente i pellet in ciascuna provetta conica e combinarli in una provetta conica da 250 mL. Se sono presenti ≤50 mL di tessuto, risospendere il pellet a un volume totale di 100 mL nella soluzione di raccolta delle isole. Se sono presenti >50 ml di tessuto, risospendere il pellet fino a un volume totale di 200 ml nella soluzione per la raccolta delle isole. Nel caso in cui vengano raccolti oltre 100 mL di tessuto, eseguire due cicli di purificazione con Cell Processor.
  4. Risospendere il tessuto in terreno RPMI per ottenere un volume totale di 100 mL (supponendo che siano stati raccolti 50 mL di tessuto) e caricarlo nel Cell Processor.

11. Purificazione delle isole con il metodo del gradiente continuo

  1. Adescare il processore di celle secondo le istruzioni del produttore.
  2. Caricare 125 mL di soluzione a gradiente ad alta densità nel formatore a gradiente continuo, quindi caricare la soluzione a gradiente ad alta densità nel processore di celle utilizzando una pompa impostata a 200 mL/min.
  3. Avviare la funzione centrifuga del processore di celle a 1.000 giri/min.
  4. Rilasciare l'aria dal sistema e riadescare con una soluzione a gradiente ad alta densità.
  5. Aggiungere 125 mL di soluzione a gradiente ad alta densità e 130 mL di soluzione a bassa densità al formatore a gradiente.
  6. Caricare i 100 mL di sospensione tissutale digerita.
  7. Aumentare la velocità del processore della cella a 2.000 giri/min per 3 minuti.
  8. Preparare 16 provette coniche da 50 mL per la raccolta delle frazioni di isole purificate. Aggiungere 25 mL di terreno RPMI a ciascuna provetta e disporre tutte le provette in ordine crescente.
  9. Raccogliere le frazioni di isole purificate nelle provette coniche di raccolta preparate.

12. Valutazione e colorazione delle isole

  1. Raccogliere 100-200 μl di aliquote da ciascuna delle frazioni di isole purificate e posizionarle in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti per la colorazione DTZ per valutare il contenuto delle isole e da ciascuna frazione di purificazione. Ispeziona ogni frazione utilizzando la microscopia ottica con ingrandimento 4x. Le isole appariranno dal rosso scuro al nero con colorazione DTZ.
  2. Una volta identificati gli isolotti, selezionare le frazioni con il più alto contenuto di isolotti. Centrifugare la frazione purificata a 250 × g per 1 min a 4 °C senza interruzione.
  3. Aspirare con cautela il surnatante e risospendere il pellet di isoletta nel terreno di coltura delle isole. Trasferire le isole purificate in 1-4 fiasche di coltura T-125.
  4. Dopo la purificazione, valutare le isole per quantità, vitalità e funzione.
    1. Utilizzare un contatore di cellule insulari per valutare il numero delle isole e la distribuzione delle dimensioni (Figura 7A). Un intero pancreas produrrà in genere 1-2 milioni di isole equivalenti.
    2. Per la colorazione di vitalità, mescolare 2 μL di calceina AM e 2 μL di omodimero di etidio-1 (CaAM/EthD-1) con 1.000 μL di PBS (Figura 7B). Lasciare colorare le isole per 30 minuti, quindi valutarle con un ingrandimento inferiore a 4x o 10x. Le isole vitali si colorano di verde mentre le isole non vitali si colorano di rosso.

13. Coltura cellulare di isole pancreatiche

  1. Durante le prime 48 ore, coltivare le isole in terreno di recupero a 37 °C per fornire nutrienti sufficienti (~1.000 isole/mL di terreno di recupero).
  2. Dal giorno 2 al 21, allevare le isole in un terreno di coltura standard a 37 °C.

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Risultati

La configurazione operatoria e la laparotomia della linea mediana sono mostrate nella Figura 1. L'incisione della laparotomia deve essere curva per evitare l'apertura urogenitale (Figura 1B). Quando si installa il divaricatore, fissare il montante per il divaricatore Omni o Bookwalter nell'angolo sinistro inferiore del tavolo. La retrazione ideale comprende due lame divaricatrici per la parete addominale destra, due per la parete addominale sinistra e 1-2 per il...

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Discussione

Lo xenotrapianto di isole pancreatiche con donatori suini è una strategia promettente per il trattamento del diabete di tipo I. L'isolamento delle isole è impegnativo e la vitalità e la resa finale delle isole sono altamente suscettibili all'ipotensione e all'ischemia tissutale riscontrate durante l'approvvigionamento degli organi16,17. Per ottimizzare l'approvvigionamento e la conservazione del pancreas, questo protocollo presen...

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Dichiarazioni

Gli autori non segnalano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo manoscritto è stato supportato da una sovvenzione per l'innovazione clinica della Mid-America Transplant Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 M NaOH, 100 mLMillipore Sigma1310-73-2
10x HBSS, 500 mL (da 15 a 30 ° C)Thermo Fisher14065056
1x D-PBS, 500 mLThermo Fisher14200075
1x HBSS, 1 LThermo Fisher14025076
250 mL Provette conicheMillipore SigmaCLS430236-6EA
Amfotericina B [50 mg]Millipore SigmaPHR1662
Antisettico Povidone Iodio 10%Millipore Sigma25655-41-8
BioRad Gradient FormerBioRad395
Cloruro di calcio diidratoThermo Fisher10035-04-8
COBE Cell ProcessorEbay317690 
Serbatoio del circuito di digestione, flacone Gibco, 1 LThermo Fisher10341001
Dimetilsolfossido (DMSO)Thermo Fisher85190
DitizoneThermo Fisher60-10-6
Kit di connessione per formatore di gradienteBioRad1652008
Eparina [1000 U/mL]Prodotti medici di emergenza0409-2720-01
Tampone HEPES (1 M), 100 ml diThermo Fisher15630080
Albumina sierica umana 25%, 100 ml diCelprogenHSA2001-25-1
IsofluranoCovetrusArticolo#:11695067772
KetaminaPattersonArticolo #:07-894-8462
Liberase (100 mg)Millipore Sigma5401020001
VIVO/MORTO Kit di vitalità/citotossicitàThermo FisherL3224
Lympholyte 1.1 Media 500 mLCedarlane LabsCL5020
Masterflex LS 16 TubingMasterfle96419-16
Masterflex Pompa peristalticaMasterflex07522-30
PenStrep (2 mg/mL)CelprogenPS-30-002
Pulmozyme (1 mg/mL, 2,5 mL/fialaDornaseAlfa8931278
Terreno di recupero, PIM(R)Prodo Laboratories, Inc.PIM-R001GMP
RPMI 1640Millipore SigmaR8758-1L
Terreno di coltura standard, PIM(S)Prodo Laboratories, Inc.PIM-S001GMP
Tzed™ (tiletamina e zolazepam) Iniezione CPattersonArticolo #: 07-894-6240
Università del Wisconsin (UW) Soluzione, 3 LSoluzioni di trapianto globali1000-0046-06
WaterbathSigma AlderichCLS6783-1EA
xilazinaPattersonArticolo #: 07-891-6165

Riferimenti

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  7. Lamb, M., et al. In vitro maturation of viable islets from partially digested young pig pancreas. Cell Transplant. 23 (3), 263-272 (2014).
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