Articolo metodologico

Colorazione rossa di Picrosirius per la valutazione istopatologica semiquantitativa della deposizione di collagene in modelli murini di rigetto cronico dell'allotrapianto polmonare

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DOI:

10.3791/66395

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21 marzo 2025

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1Department of Thoracic Surgery, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Plastic and Hand Surgery, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Department of Thoracic Surgery, Kyoto University Hospital, 4Department of Otolaryngology, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La colorazione con rosso Picrosirius è un metodo semiquantitativo per valutare oggettivamente la deposizione di collagene nel rimodellamento fibrotico polmonare murino in modo spazialmente risolto. Oltre a valutare la deposizione totale di collagene, la colorazione con Picrosirius Red consente di differenziare fibre di collagene di diversi spessori.

Abstract

La fibrosi è il segno fisiopatologico del rigetto cronico dopo il trapianto di polmone e il principale ostacolo alla sopravvivenza a lungo termine del ricevente. Sono disponibili diversi modelli di trapianto di polmone murino per lo studio del rigetto cronico. Tuttavia, mostrano risultati eterogenei per quanto riguarda le alterazioni fibrotiche dell'innesto e l'estensione istologica della fibrosi è per lo più riportata qualitativamente. Pertanto, un approccio spazialmente risolto che consenta l'analisi statistica può aiutare a valutare la fibrosi in questi modelli. Questo studio presenta la colorazione con Picrosirius Red per una valutazione semiquantitativa dell'organizzazione del collagene negli allotrapianti polmonari murini e la confronta con l'ematossilina e l'eosina standard, il tricromico di Masson e le colorazioni di Herovici. La colorazione è stata eseguita su sezioni di due diversi modelli di trapianto murino basati su discrepanze del complesso di istocompatibilità minore e maggiore (MHC). Il metodo è stato stabilito per l'analisi semiquantitativa dell'organizzazione del collagene in intere sezioni polmonari. Pertanto, può servire come strumento per modelli sperimentali murini di malattie polmonari fibrotiche.

Introduzione

Il trapianto di polmone è l'opzione terapeutica definitiva per i pazienti affetti da malattia polmonare allo stadio terminale. Tuttavia, la sopravvivenza a lungo termine è ostacolata dal rigetto cronico, che colpisce il 50% dei riceventi entro i primicinque anni postoperatori. Il rimodellamento fibrotico delle piccole vie aeree e del parenchima polmonare è il segno istologico alla base della progressiva perdita della funzione polmonare nel rigetto cronico dell'allotrapianto polmonare2. Sperimentalmente, il rigetto cronico dell'allotrapianto polmonare può essere modellato con il trapianto di polmone ortotopico murino tra ceppi di topo MHC-mismatched. Sono state proposte diverse combinazioni di ceppi per ottenere il fenotipo del rigetto cronico3. Tra questi, viene spesso utilizzata la combinazione di trapianto del donatore minore MHC non corrispondente C57BL/10 e del ricevente C57BL/64. In alternativa, i polmoni del donatore BALB/c possono essere trapiantati a riceventi C57BL/6 che ricevono un trattamento immunosoppressivo quotidiano5. Questi modelli determinano gradi istologicamente diversi di alterazioni fibrotiche6. Questi cambiamenti sono spesso riportati qualitativamente utilizzando l'ematossilina e l'eosina standard e la colorazione tricromica di Masson.

La colorazione istologica standard con ematossilina ed eosina consente una panoramica del campione in quanto colora i nuclei in blu, mentre il citoplasma e le fibre di collagene appaiono rosse. Con la colorazione Trichrome di Masson, i nuclei sono colorati di nero, le fibre di collagene sono colorate di verde o blu e lo sfondo, compreso il citoplasma, la fibrina e i muscoli, è rosso. Poiché la macchia Trichrome di Masson può portare a valori sottostimati, l'uso della macchia Picrosirius Red è considerato benefico7. Il rosso Picrosirius è un colorante anionico lineare che si associa a lunghe fibre di collagene cationico e fornisce una colorazione rossa ricca di contrasto. Inoltre, la colorazione con rosso Picrosirius migliora la naturale birifrangenza delle fibre di collagene sotto la luce polarizzata incrociata8. In questo modo, è possibile valutare lo spessore e l'impacchettamento delle fibre di collagene. Utilizzando un filtro polarizzatore, lo sfondo diventa scuro e diventa possibile distinguere lo spessore del collagene depositato. Mentre le spesse fibre di collagene appaiono rosse, le sottili fibre di collagene emergono verdi sotto polarizzazione. In letteratura è frequentemente descritta un'associazione diretta tra birifrangenza e sottotipo di collagene, con la birifrangenza rossa assegnata al collagene I e la birifrangenza verde al collagene III9.

Questo protocollo descrive l'uso della colorazione Picrosirius Red per valutare la fibrosi negli allotrapianti polmonari murini. Oltre alla colorazione istologica convenzionale, consente una valutazione semiquantitativa del cambiamento fibrotico in modelli murini di rigetto cronico, fornisce un mezzo di distinzione tra fibre di collagene spesse e sottili in una sola colorazione, è efficiente in termini di costi ed è facile da eseguire. Questo metodo può essere applicato anche ad altri modelli sperimentali murini caratterizzati da rimodellamento fibrotico del parenchima polmonare.

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Protocollo

Tutti i protocolli per gli animali sono conformi ai principi etici delle 3R per la ricerca umana sugli animali e sono stati approvati dal comitato etico veterinario locale (Veterinäramt Kanton Zürich, Svizzera, studio numero 45/2014). Allo stesso modo, i lettori devono ottenere l'autorizzazione dalle istituzioni competenti prima di eseguire qualsiasi procedura sugli animali da laboratorio.

1. Acquisizione del campione

  1. Condurre esperimenti sugli animali in base alle esigenze individuali e alla rispettiva approvazione etica. Un singolo microchirurgo esegue tutti gli interventi chirurgici senza ulteriori tempi di ischemia prolungati.
    NOTA: Per una riproduzione dei nostri risultati rappresentativi, procurarsi topi maschi adulti C57BL/6J, C57BL/10J e BALB/c specifici privi di agenti patogeni del peso di 27-30 g dai Charles River Laboratories. Per gli isotrapianti, utilizzare animali C57BL/6J sia come donatori che come riceventi. Nel modello minore non corrispondente, trapiantare i polmoni del donatore C57BL/10J a riceventi C57BL/6J. Nel modello principale non corrispondente, trapiantare i polmoni del donatore BALB/c a riceventi di C57BL/6J e iniettare dopo l'intervento ciclosporina (10 mg/kg/die) e metilprednisolone (1,6 mg/kg/die) per via sottocutaneaal giorno 5. Utilizzare una soluzione salina per la perfusione e recuperare i polmoni dopo 8 settimane (56 giorni).
  2. Per l'eutanasia, intubare l'animale con un catetere da 20 G e ventilarlo con O2 integrato con isoflurano al 2%-3%. Confermare una profondità sufficiente dell'anestesia in base all'assenza di una risposta a un pizzico della zampa.
  3. Eseguire una laparosternotomia mediana incidendo la parete addominale con le forbici chirurgiche e tagliando la lunghezza dello sterno per esporre il cuore. Identificare la vena cava inferiore e l'appendice atriale sinistra in base alla loro posizione anatomica.
  4. In rapida successione, tagliare la vena cava inferiore e l'appendice atriale sinistra con forbici chirurgiche e perfondere l'animale con 3-5 ml di NaCl allo 0,9% attraverso la radice dell'arteria polmonare con una siringa per rimuovere tutto il sangue dalla circolazione polmonare.
    NOTA: L'eutanasia deve essere eseguita secondo la rispettiva approvazione etica. Altri metodi possono essere applicati allo stesso modo. Si raccomanda di rimuovere completamente il sangue dalla circolazione polmonare, cosa che può essere eseguita anche per perfusione dopo l'arresto circolatorio.
  5. Rimuovere i polmoni perfusi usando le forbici.
  6. Per la conservazione, incubare i campioni in formalina al 4%. Iniettare la soluzione di formalina direttamente nel bronco e nel sistema vascolare polmonare. Immergere i campioni in formalina e lasciarli incubare per almeno 6 ore.
    NOTA: Per il gonfiaggio del polmone con formalina, è necessario applicare una procedura standardizzata per ottenere risultati comparabili. Esempi di protocolli per tali procedure sono pubblicati altrove10,11.
  7. Trimmare l'organo in base alle esigenze sperimentali. Tagliare trasversalmente i polmoni a metà per catturare tutte le parti dell'albero bronchiale in una sezione.
  8. Trasferire i campioni a un processatore automatico di tessuti per la disidratazione nella sequenza alcolica, la chiarificazione in xilolo e rivestimento di paraffina come segue: 70% etanolo, 70% etanolo, 80% etanolo, 96% etanolo, 100% etanolo (1 ora ciascuno), 100% etanolo, 100% etanolo, xilolo (2 ore ciascuno), xilolo (1 ora) e paraffina 3 volte per 2 ore.
  9. Fondere la paraffina e incorporare i campioni con l'orientamento corretto nelle cassette di inclusione in poliossimetile. Fare attenzione a incorporare i campioni con la superficie tagliata rivolta verso il basso. Utilizzare un microtomo rotante per tagliare sezioni da 5 μm consecutivamente. Lasciare asciugare i vetrini per 24 ore a 37 °C prima di procedere con la lavorazione.

2. Deparaffinazione e idratazione dei vetrini di paraffina

  1. Rimuovere la paraffina incubando i campioni 2 volte in xilolo al 100% per 5 minuti ciascuno.
    ATTENZIONE: Xylol è infiammabile e pericoloso per la salute. Utilizzare solo sotto la cappa aspirante.
  2. Idratare i campioni in etanolo al 100%, etanolo al 100%, etanolo al 95%, etanolo al 70% ed etanolo al 50% per 2 minuti ciascuno. Quindi, lavare per 2 minuti in acqua distillata.

3. Colorazione con rosso Picrosirius

  1. La colorazione scivola per 8 minuti nella soluzione di emalum di Meyer. Lavare gli scivoli per 10 minuti sotto l'acqua corrente del rubinetto.
  2. Incubare i vetrini per 1 ora in soluzione di Picrosirius Red. Per la soluzione di rosso Picrosirius, utilizzare una soluzione colorante premiscelata o utilizzare lo 0,1% di rosso diretto 80 o rosso Sirius F 3B (CI 35780) diluito in acido picrico saturo.
    ATTENZIONE: L'acido picrico è infiammabile e altamente esplosivo e deve essere trattato con cura.
    NOTA: Sono disponibili molti fornitori diversi per i kit di colorazione Picrosirius Red, come elencato nella tabella dei materiali. Sii consapevole delle differenze di prezzo e dei metodi di colorazione e rispetta sempre le istruzioni dei fornitori. Si consiglia di utilizzare solo kit di colorazione con l'indice di colore specifico per Sirius Red F 3B (CI 35780).
  3. Immergere i vetrini 5x-10x in una soluzione di acido acetico (0,5%). Agitare delicatamente i vetrini per rimuovere fisicamente la soluzione.
  4. Disidratare i vetrini in etanolo al 95%, etanolo al 100%, etanolo al 100%, xilolo al 100% e xilolo al 100% per 5 minuti ciascuno.
  5. Incorporare aggiungendo una goccia di terreno di montaggio su ciascun campione e coprire con un vetrino coprioggetti. Lasciare asciugare i vetrini sotto una cappa aspirante.

4. Digitalizzazione ed elaborazione delle immagini

  1. Focalizzare i campioni al microscopio ottico con un software di imaging appropriato fino a quando l'immagine diventa chiara e nitida. Aggiungi un filtro polarizzatore e regola il grado di polarizzazione fino a quando lo sfondo non è completamente scuro o nero. Quando lo sfondo è il più scuro possibile, si ottiene la corretta polarizzazione.
    NOTA: È anche possibile visualizzare la colorazione di Picrosirius Red con luce trasmessa convenzionale e senza filtro polarizzatore. A tale scopo, si consiglia di utilizzare Sirius Red con Fast Green, poiché è stato dimostrato che è più sensibile del solo Sirius Red12,13. Tuttavia, la microscopia polarizzante è necessaria per distinguere tra fibre di collagene spesse e sottili.
  2. Scansiona tutti i campioni completamente con un ingrandimento di 20x ed esporta come .tiff. Trasferimento al software Fiji14. Assicurati di pulire correttamente i vetrini in anticipo e di utilizzare impostazioni standardizzate per quanto riguarda il tempo di esposizione e l'intensità della sorgente luminosa.
  3. Circondare manualmente il campione e ritagliarlo nel software utilizzando Modifica > Cancella esterno. Misurare la superficie totale facendo clic su Analizza > Misura.
    NOTA: La selezione dello scomparto da misurare è un passaggio fondamentale per creare risultati affidabili e comparabili. Digitalizzando e selezionando l'intero campione, viene visualizzata una buona sezione trasversale e i tessuti eterogenei vengono considerati nel loro insieme. Tuttavia, è anche possibile limitarsi a zone specifiche all'interno dei campioni, come la pleura o i singoli bronchi. Tieni presente di selezionare sempre gli scomparti da confrontare in modo standardizzato. Nel caso in cui i campioni mostrino una grande variabilità nella ventilazione, è consigliabile escludere l'area dello spazio aereo dal compartimentoanalizzato 15.
  4. Misurare il contenuto totale di collagene per campione utilizzando la soglia del colore facendo clic su Immagine > Regola > soglia colore e regolare le impostazioni facendo clic su Analizza > Analizza particelle. Imposta dimensione = 1 - Infinito, Cancella, Riepiloga. Luminosità = 35 - 255. Tonalità = 2 - 130
    NOTA: Un'impostazione ragionevole delle soglie di colore è fondamentale per ottenere risultati affidabili.
  5. Ripetere per le fibre di collagene spesse e sottili regolando la tonalità come fibre di collagene spesse rosse figure-protocol-1 (tonalità 2-30) e fibre di collagene sottili giallo-verdi figure-protocol-2 (tonalità 31-130). Il risultato sarà l'area dei pixel macchiati.
  6. Configura la macro per l'elaborazione automatizzata facendo clic su Plug-in > Macro > Registra e ripeti con tutti i campioni.
  7. Per ricevere i valori finali standardizzati in base all'area superficiale della sezione trasversale, dividere l'area dei pixel colorati per tutti i parametri per l'area superficiale totale misurata rispettivamente nei passaggi 4.3 e 4.5 per ciascun campione.

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Risultati

Il protocollo sopra descritto consente una valutazione semiquantitativa oggettiva della deposizione di collagene nel tessuto polmonare murino. Il rimodellamento fibrotico è il segno fisiopatologico del rigetto cronico dopo trapianto di polmone. Pertanto, la colorazione Picrosirius Red è stata applicata in modelli di rigetto cronico dell'allotrapianto polmonare utilizzando il trapianto di polmone ortotopico murino sinistro. Il trapianto di polmone maggiore MHC-mismatched da un donatore di BALB/c a un ricevente di C57BL/6 ...

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Discussione

I metodi istologici standard come l'ematossilina e l'eosina e la colorazione tricromica di Masson sono ampiamente utilizzati per rilevare i cambiamenti fibrotici nei polmoni murini in modo spazialmente risolto16,19. Tuttavia, sono spesso necessari metodi aggiuntivi per quantificare questi cambiamenti e valutare la composizione del collagene del tessuto.

La colorazione con il rosso Picrosirius è stata d...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Birte Ohm è supportato dal Berta-Ottenstein-Program for Clinician Scientists, Facoltà di Medicina, Università di Friburgo. Steffen U Eisenhardt è professore presso la Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) e ha sostenuto questo lavoro con sovvenzioni personali. Inoltre, vorremmo ringraziare Sheena Kreuzaler per la sua assistenza tecnica. La Figura 1 è stata creata con l'aiuto di Biorender.com. L'imaging è stato eseguito presso la Lighthouse Core Facility, finanziata in parte dalla Facoltà di Medicina dell'Università di Friburgo (numeri di progetto 2023/A2-Fol; 2021/B3-Fol), dal DKTK e dal DFG (numero di progetto 450392965).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido aceticoHoneywell, Charlotte, USA33209
Axio ObserverZeiss, Oberkochen, Germania4633000956 (numero di serie)
Vetrino coprioggetti 1.5Roth, Karlsruhe, GermaniaKCY5.1
Formaldeide 37%Fisher Scientific, Leicestershire, Regno UnitoF/1501/PB15
Soluzione di emalum di MeyerMerck, Darmstadt, Germania109249
Picrosirius Red SolutionMorphisto, Offenbach am Main, Germania13422alternative utilizzabili: ab150681, abcam, Cambridge, Regno Unito; SRS250 ScyTek Laboratories, Logan City US
Filtro polarizzatoreZeiss, Oberkochen, Germania000000-1121-813
Microtomo rotante, HistoCore AUTOCUTLeica, Wetzlar, Germania149AUTO00C1, 14051956472
ROTI Histokitt mezzo di montaggioRoth, Karlsruhe, Germania6638.1
ROTI Plast ParaffinaRoth, Karlsruhe, Germania6642.5
Cassette per inclusione di rotilabo, POMRoth, Karlsruhe, GermaniaK113.1
Superfrost Plus Adhesion Microscopeepredia, Portsmouth, Regno UnitoJ1800AMNZ
Tissue Processor Leica, Wetzlar, GermaniaTP 1020
Software
Fiji versione software 2.14.0/1.54fSoftware di imaging open source
ZEN 3.4.91Zeiss, Oberkochen, Germania

Riferimenti

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