Articolo metodologico

L'istituzione di difetti compositi di sutura calvariare-osso nei ratti: un modello standardizzato per l'indagine sulla terapia rigenerativa della sutura

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DOI:

10.3791/66417

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10 maggio 2024

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1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

In questo articolo

Sommario

Descriviamo le procedure chirurgiche dettagliate dei difetti compositi della sutura calvaria-osso nei ratti, insieme alle indagini sulle prognosi a breve e lungo termine del modello. Il nostro obiettivo è quello di costruire un modello standardizzato per lo sviluppo di terapie rigenerative di sutura.

Abstract

I difetti calvari su larga scala spesso coincidono con l'interruzione della sutura cranica, portando a menomazioni nel ripristino del difetto calvario e nello sviluppo del cranio (quest'ultimo si verifica nel cranio in via di sviluppo). Tuttavia, la mancanza di un modello standardizzato ostacola i progressi nello studio delle terapie rigenerative di sutura e pone sfide per la conduzione di analisi comparative tra studi distinti. Per risolvere questo problema, l'attuale protocollo descrive il processo di modellazione dettagliata dei difetti compositi della sutura calvariale-osso nei ratti.

Il modello è stato generato praticando fori rettangolari a tutto spessore che misurano 4,5 mm × 2 mm attraverso le suture coronali. I ratti sono stati soppressi e i campioni di cranio sono stati raccolti dopo l'intervento al giorno 0, alla settimana 2, alla settimana 6 e alla settimana 12. I risultati della μCT dei campioni raccolti immediatamente dopo l'intervento chirurgico hanno confermato il successo dell'instaurazione del difetto composito sutura-osso, che comporta la rimozione della sutura coronale e dei tessuti ossei adiacenti.

I dati della 6ae 12a settimana postoperatoria hanno dimostrato una naturale tendenza alla guarigione del difetto a chiudersi. La colorazione istologica ha ulteriormente convalidato questa tendenza mostrando un aumento delle fibre mineralizzate e nuovo osso al centro del difetto. Questi risultati indicano una fusione progressiva della sutura nel tempo a seguito di difetti calvariali, sottolineando l'importanza degli interventi terapeutici per la rigenerazione della sutura. Prevediamo che questo protocollo faciliterà lo sviluppo di terapie rigenerative di sutura, offrendo nuove intuizioni sul ripristino funzionale dei difetti calvari e riducendo gli esiti avversi associati alla perdita di sutura.

Introduzione

Le suture craniche sono connessioni fibrose dense tra le ossa craniche, che agiscono come articolazioni per facilitare il leggero movimento del cranio e forniscono un cuscino protettivo per il cervello sotto pressione1. Negli ultimi anni, l'aumento della ricerca ha evidenziato il ruolo fondamentale delle suture craniche nello sviluppo del cranio, nell'omeostasi craniofacciale e nel potenziale osteo-riparativo intrinseco 2,3,4,5,6,7,8. Durante i periodi di crescita e sviluppo, le suture craniche fungono da principali centri di crescita nel cranio4. La formazione di nuovo osso si verifica sui fronti osteogenici su entrambi i lati delle suture, mentre le cellule all'interno delle suture mantengono uno stato mesenchimale indifferenziato, garantendo un'espansione equilibrata del cranio insieme alla crescita del cervello1. La perdita di suture craniche in questo momento si traduce in una discrepanza tra la crescita del cranio e del cervello, portando a gravi problemi come lesioni cerebrali, idrocefalo, aumento della pressione intracranica e disfunzione cognitiva 3,9.

Inoltre, le suture craniche svolgono un ruolo cruciale nel determinare la prognosi dei difetti calvariari 5,7,10. Il potenziale rigenerativo su tutta la superficie calvariale è distribuito in modo non uniforme, con suture craniche che mostrano capacità notevolmente superiori rispetto alle regioni non di sutura10,11. Uno studio indica che la velocità di guarigione del difetto calvariale è inversamente correlata alla distanza tra la sutura cranica e il sito della lesione10. In particolare, la rimozione delle suture coronali e sagittali porta alla mancata guarigione dei difetti ossei parietali7, sottolineando la necessità della rigenerazione della sutura nei difetti calvariali. Tuttavia, l'attenzione degli studi attuali è prevalentemente sul ripristino della struttura ossea cranica trascurando la rigenerazione del mesenchima di sutura.

Per quanto riguarda i progressi nella rigenerazione della sutura, sono stati osservati risultati promettenti con il trapianto di lembi ossei contenenti sutura, cellule staminali mesenchimali (MSC) e biomateriali artificiali. Quando i lembi ossei con suture sono stati trapiantati in difetti calvariali, si sono integrati e guariti con successo, a differenza di quelli senza suture che mostravano non unione e incapacità di formare periostio, dura madre o osteociti5. Allo stesso modo, l'impianto di MSC derivate dal midollo osseo in difetti compositi di sutura sagittale e ossea ha facilitato la formazione di lacune simili a suture12. Da notare, uno studio recente ha evidenziato la realizzazione della rigenerazione della sutura con le MSC Gli1+, che consentono il controllo della pressione intracranica, la correzione delle deformità del cranio e una migliore funzione neurocognitiva13. Con lo sviluppo della medicina rigenerativa e dell'ingegneria biomedica, i ricercatori si concentrano sempre più sui biomateriali di ingegneria tissutale grazie alle loro caratteristiche adattabili e personalizzabili14. In particolare, le membrane in politetrafluoroetilene si sono dimostrate efficaci nella ricostruzione simultanea dell'osso cranico e del mesenchima di sutura15,16.

Tuttavia, la ricerca craniofacciale manca di modelli consolidati per esplorare le terapie rigenerative mesenchimali di sutura, a differenza dei modelli relativamente maturi nella riparazione di altri tessuti come ossa, pelle, cartilagine e muscoli17. L'assenza di un modello standardizzato limita lo studio delle terapie rigenerative di sutura e rende difficile l'esecuzione di analisi comparative tra diversi studi. Pertanto, il nostro studio ha stabilito un difetto pratico e riproducibile del composito sutura calvario-osso di ratto. Attraverso questa metodica, miriamo a sviluppare interventi clinici appropriati per la ricostruzione della sutura cranica, offrendo nuove prospettive sulla riparazione funzionale dei difetti calvari e diminuendo gli esiti sfavorevoli derivanti dalla perdita di sutura.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali in questo studio sono state esaminate e approvate dal Comitato etico della West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2021-597). Un totale di 12 (3 ratti in ciascuno dei quattro punti temporali) ratti Sprague-Dawley (SD) (maschi, 300 g, 8 settimane) sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione prechirurgica

  1. Articoli chirurgici
    1. Preparare gli strumenti chirurgici mostrati nella Figura 1A, tra cui una pinza curva, un bisturi sterile monouso, un elevatore periostale, un ago per l'irrigazione, batuffoli di cotone, un manipolo a bassa velocità, un motore chirurgico, frese rotonde dentali a bassa velocità (Figura 1B, rispettivamente 1,2 mm e 0,8 mm di diametro), un portaago, suture monofilamento 3-0 e una forbice diritta.
  2. Sterilizzazione e disinfezione
    1. Sterilizzare preventivamente gli strumenti mediante sterilizzazione a vapore (125-135 °C, 20-25 min).
    2. Usa l'etanolo per sterilizzare apparecchiature mediche sensibili al calore, come i rasoi elettrici.
    3. Utilizzare tessuti non tessuti medicali sterili per coprire la piattaforma operativa e disinfettare l'ambiente circostante con etanolo al 75%.
  3. Anestesia
    1. Preparare gli animali per l'intervento chirurgico con un periodo di acclimatazione di 1 settimana.
    2. Iniettare nei ratti per via intraperitoneale xilazina (10 mg/kg) e ketamina (100 mg/kg) 20 minuti prima dell'intervento chirurgico per l'anestesia o utilizzare qualsiasi protocollo anestetico adatto per ottenere l'anestesia generale.
      NOTA: Il cocktail anestetico ketamina-xilazina somministrato per via intraperitoneale nei ratti ha tipicamente effetto entro 10-15 minuti, raggiungendo il picco di anestesia circa 35-40 minuti dopo l'iniezione. Per prevenire l'ipotermia durante l'anestesia, è meglio posizionare i ratti su un termoforo.
    3. Somministrare un'iniezione sottocutanea preoperatoria di carprofene a 5 mg/kg per fornire analgesia.
    4. Usa il "metodo del pizzicamento delle dita" per determinare se i ratti sono coscienti e reattivi.

2. Processo chirurgico

  1. Preparazione del sito
    1. Posizionare il ratto in posizione prona con la testa che si estende naturalmente verticalmente, senza richiedere dispositivi speciali o restrizioni per mantenere questa postura (Figura 2A).
    2. Applicare un unguento veterinario, cioè vaselina, sugli occhi del ratto per prevenire la secchezza corneale.
    3. Rimuovere i peli dal cuoio capelluto tra il ponte nasale e l'articolazione del rachide cervicale con un rasoio elettrico (Figura 2B). Disinfettare l'area chirurgica con movimenti circolari irradiandosi dal centro con una soluzione di iodoforo al 2% seguita da etanolo al 75%. Utilizzare un telo chirurgico per coprire il dorso dell'animale e il pelo che circonda l'incisione.
  2. Apertura del sito chirurgico
    1. Partendo dal punto medio dell'osso nasale, praticare un'incisione cutanea longitudinale di 2 cm con un bisturi monouso seguendo la linea mediana del cranio (Figura 2C).
    2. Praticare un'incisione periostale sulla linea mediana che rispecchi il punto iniziale e l'estensione dello strato cutaneo con un bisturi (Figura 2D). Quindi, sollevare delicatamente il periostio su entrambi i lati dell'incisione con un elevatore periostale (Figura 2E1) per esporre le ossa parietali, le ossa frontali e le suture coronali (Figura 2E2).
      NOTA: Quando si incide il periostio, fare attenzione a non danneggiare le suture craniche per evitare un sanguinamento eccessivo durante il taglio. Un'adeguata esposizione della sutura coronale è della massima importanza per le seguenti procedure.
    3. Sciacquare la ferita con soluzione salina e asciugare l'area chirurgica con batuffoli di cotone.
  3. Istituzione del modello di difetto composito sutura-osso
    1. Impostare il motore chirurgico a 35.000 giri/min ruotando la manopola (Figura 1A, freccia gialla), quindi accendere l'interruttore (Figura 1A, freccia bianca).
    2. Partendo da qualsiasi punto della sutura coronale, applicare una forza verticale utilizzando una fresa rotonda di 1,2 mm di diametro fino a quando non si avverte un senso di sfondamento.
      NOTA: Raccomandare il punto medio della sutura coronale (indicato dalle frecce gialle nella Figura 2E2) come punto di partenza per la penetrazione. Durante la molatura, i trapani dentali devono essere mantenuti perpendicolari alla superficie cranica. Prestare attenzione a non continuare a perforare dopo aver penetrato l'intero spessore del cranio per evitare ulteriori danni ai ratti, inclusi danni cerebrali o emorragie cerebrali.
    3. Dal punto di penetrazione, spostare la fresa lateralmente lungo la sutura coronale per creare un solco di posizionamento lungo circa 4 mm (Figura 2F1). Rimuovere il tessuto osseo con la fresa su entrambi i lati della scanalatura di posizionamento per formare inizialmente un difetto rettangolare a tutto spessore (Figura 2F2).
    4. Utilizzare una fresa rotonda di 0,8 mm di diametro per rifinire i dettagli (Figura 2G1), coinvolgendo la rettifica degli angoli retti e la levigatura dei margini dei difetti, ottenendo infine un difetto rettangolare standard di 2 mm di larghezza e 4,5 mm di lunghezza (Figura 2G2).
      NOTA: Per ottenere la rimozione completa della sutura coronale preservando le suture sagittale e frontale in ratti SD da 300 g, la lunghezza massima possibile del difetto è di circa 4,5 mm. Considerando la larghezza della sutura coronale in direzione antero-posteriore (Figura supplementare S1), la larghezza del difetto è stata fissata a 2 mm.
    5. Creare due difetti sulle metà sinistra e destra della sutura coronale per l'autoconfronto.
    6. Mantenere l'irrigazione continua della soluzione salina durante la procedura di perforazione per evitare lesioni termiche al cranio e al cervello. Nel frattempo, usa batuffoli di cotone per asciugare l'area operativa.
  4. Verifica della dimensione del campione
    1. Verificare regolarmente la lunghezza e la larghezza dei difetti utilizzando un calibro a corsoio (Figura 2H1, H2) per garantire la coerenza in tutti i campioni.
  5. Chiusura del sito chirurgico
    1. Chiudere la pelle con suture monofilamento 3-0 (Figura 2I).
  6. Tomografia microcomputerizzata in vivo ( μCT) postoperatoria immediata
    1. Se possibile, eseguire scansioni μCT in vivo su tutti i ratti subito dopo l'intervento chirurgico per confermare il successo della procedura chirurgica e monitorare le tendenze di recupero dei difetti per ciascun individuo.

3. Cure post-chirurgiche

  1. Secondo i protocolli di cura degli animali, somministrare analgesici consolidati se necessario dopo l'intervento chirurgico, ad esempio il carprofene (5 mg/kg, uso sottocutaneo).
  2. Trasferire i ratti su un termoforo costante (37 °C) per il recupero postoperatorio.
  3. Una volta completamente coscienti, trasferisci i ratti nella loro gabbia contenente lettiera pulita.
    NOTA: Monitorare continuamente i ratti dopo l'intervento chirurgico. Non lasciarli incustoditi fino a quando non riescono a mantenere la decubito sternale. Tenere i ratti operati isolati dagli altri fino a quando non si sono completamente ripresi.
  4. Condurre la gestione dell'analgesia e il monitoraggio postoperatorio per 24 ore, seguiti da valutazioni quotidiane durante la prima settimana dopo l'intervento. Successivamente monitorare i ratti almeno 1-2 volte a settimana.

4. Raccolta dei campioni e analisi dei dati

  1. Preparazione del campione
    1. Raccogli i campioni di cranio al giorno 0 postoperatorio, alla settimana 2, alla settimana 6 e alla settimana 12. Eutanasia dei ratti utilizzando l'inalazione di CO2 .
    2. Fissare i campioni in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 24 ore prima di ulteriori analisi.
  2. Valutazione μCT
    1. Eseguire scansioni μCT su ossa craniche del giorno 0, settimana 6, settimana 12 postoperatoria con i seguenti parametri di scansione: potenziale del tubo a raggi X, 70 kVp; Intensità dei raggi X, 0,2 mA; filtro, AL 0,5 mm; tempo di integrazione, 1 x 300 ms; e dimensione del voxel, 10 μm.
    2. Ottenere immagini di ricostruzione 3D e sezioni trasversali con il software di elaborazione delle immagini (vedi Tabella dei materiali).
    3. Misurare il volume residuo dei difetti ed eseguire analisi statistiche con il software corrispondente (vedere la tabella dei materiali).
  3. Colorazione istologica
    1. Decalcificare le ossa craniche in una soluzione di acido etilendiammina tetraacetico al 12% (p/v) (pH = 7,2) a 4 °C per 6 settimane.
      NOTA: Decalcificare i campioni con cambi di soluzione ogni 3 giorni. Utilizza uno shaker per accelerare il processo. Il completamento è indicato quando un ago da 25 G penetra facilmente nel campione.
    2. Procedere con la disidratazione, l'inclusione in paraffina e la preparazione di sezioni da 6 μm utilizzando i protocolli standard18.
    3. Condurre l'analisi istologica utilizzando ematossilina ed eosina (H&E) e la colorazione tricromica di Masson seguendo il protocollodel kit 18.

Risultati

In questo studio, il difetto composito della sutura calvariale del ratto è stato stabilito praticando un foro rettangolare di 4,5 mm x 2 mm attraverso la sutura coronale. L'illustrazione schematica chirurgica e il diagramma di flusso della ricerca sono illustrati nella Figura 3. L'immagine 3D e la vista in sezione trasversale dei campioni postoperatori 0-day, ovvero i campioni raccolti immediatamente dopo l'intervento chirurgico, hanno confermato la creazione di un difetto calvariale a tutto spessore, che comporta la completa rimozione della sutura coronale e delle strutture ossee adiacenti ad entrambe le estremità (Figura 4A). Le immagini μCT e i corrispondenti risultati dell'analisi statistica a 6 settimane dopo l'intervento hanno rivelato una naturale inclinazione verso la chiusura del difetto accompagnata da noduli calcificati irregolari formati all'interno del difetto (Figura 4). Questa tendenza è diventata più pronunciata 12 settimane dopo l'intervento chirurgico (Figura 4), indicando la potenziale fusione della sutura con il passare del tempo. Ulteriori analisi istologiche sono state condotte utilizzando la colorazione tricromica di H&E e Masson. Due settimane dopo l'intervento, abbiamo osservato una notevole estensione e continuità del periostio e della dura madre, che formavano tessuto fibroso denso e spesso e sigillavano efficacemente l'area difettosa (Figura 5). In particolare, in questo momento precoce, è stata rilevata l'emergere di fibre mineralizzate colorate di blu, la cui presenza ha subito un aumento sostanziale entro 6 settimane dall'intervento chirurgico (Figura 5). Entro le 12 settimane postoperatorie, sono stati osservati grandi pezzi di nuovo osso nel centro del difetto (Figura 5), riconfermando la prognosi avversa della calcificazione stromale e della chiusura della sutura. Gli esiti sfavorevoli di guarigione naturale dei difetti del composito osseo di sutura sottolineano la necessità della rigenerazione della sutura cranica attraverso interventi terapeutici, come l'impianto di biomateriali 13,15,16.

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Figura 1: Strumenti chirurgici. (A) Gli articoli chirurgici sono stati numerati in ordine di utilizzo, tra cui (1) pinza curva, (2) bisturi sterile monouso, (3) elevatore periostale, (4) ago per irrigazione, (5) batuffoli di cotone, (6) manipolo a bassa velocità, (7) motore chirurgico (la freccia gialla rappresenta la manopola RPM e la freccia bianca rappresenta l'interruttore), (8) frese rotonde dentali a bassa velocità, (9) porta aghi, (10) suture monofilamento 3-0 e (11) forbice diritta. (B) Frese rotonde a bassa velocità di diametro 1,2 mm e 0,8 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Procedura chirurgica. (A) Posizionare il ratto in posizione prona. (B) Radere i capelli dal cuoio capelluto con un rasoio elettrico. (C) Incidere la pelle con un bisturi usa e getta. (D) Incidere il periostio con un bisturi. (E1, E2) Sollevare il periostio per esporre le suture coronali con un elevatore periostale. Le frecce gialle indicano le suture coronali. (F1) Alesare una scanalatura di posizionamento. (F2) Creare preliminarmente un difetto rettangolare con una fresa rotonda da 1,2 mm. (G1, G2) Rifilare il difetto con una fresa rotonda da 0,8 mm per ottenere una forma rettangolare standard di 4,5 x 2 mm. (H1, H2) Calibrare la larghezza e la lunghezza del difetto con un calibro a corsoio. (I) Chiudere la pelle utilizzando suture monofilamento 3-0. Questa rappresentazione utilizza un cadavere, che viene deliberatamente lasciato non drappeggiato per facilitare una migliore visualizzazione anatomica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Illustrazione schematica del difetto composito sutura calvariale-osso e strategia di ricerca di questo studio. Abbreviazioni: H&E = ematossilina ed eosina; μCT = microtomografia computerizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Tendenza alla chiusura del difetto composito sutura calvariale-osso. (A) Immagini μCT rappresentative e viste in sezione trasversale dei difetti compositi sutura-osso al giorno 0 postoperatorio, alla settimana 6 e alla settimana 12. Le sezioni trasversali rappresentano le posizioni indicate dalle linee tratteggiate gialle nelle immagini 3D. Barre della scala = 2 mm. (B) Analisi quantitativa del volume del difetto residuo post-operatorio attraverso valutazioni μCT. n = 6 repliche/gruppo. I dati sono espressi come media ± SD. ANOVA unidirezionale seguita dal test di confronto multiplo di Dunnett. p<0.001. Abbreviazioni: PO = postoperatorio; μCT = microtomografia computerizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Variazioni istologiche nei difetti del composito sutura-osso. (A) H&E e (B) Colorazione tricromica di Masson dei difetti del composito sutura-osso alla settimana 2, alla settimana 6 e alla settimana 12 del PO. I contorni tratteggiati rossi indicano il tessuto fibroso che incapsula l'area del difetto. I pentagrammi neri rappresentano le fibre mineralizzate colorate di blu. I pentagrammi gialli evidenziano il nuovo osso formatosi nel centro del difetto. Barre di scala = 500 μm; 200 μm (inserti). Abbreviazioni: PO = postoperatorio; H&E = ematossilina ed eosina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare S1: Larghezza della sutura coronale in direzione antero-posteriore (immagine calvario del piano sagittale). Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

I modelli convenzionali di difetto calvariano, che coinvolgano o meno suture craniche, si concentrano principalmente sulla riparazione dei tessuti duri, spesso trascurando la rigenerazione vitale del mesenchima di sutura19,20. Nella ricerca sulla rigenerazione della sutura, modelli precedenti, come quelli di Mardas et al.15,16, che utilizzavano una fresa a trefina per creare un difetto circolare di 5 mm attraverso la sutura sagittale dei ratti, hanno portato a una sostanziale perdita di tessuto duro, allontanandosi così dall'obiettivo primario della rigenerazione della sutura. Allo stesso modo, la metodologia di Wilk et al.7, che comprende la rimozione sia delle suture sagittali che quelle coronali destre e la creazione di un difetto osseo critico nell'osso parietale destro, sebbene informativa, ha introdotto complessità e potenziali variabili confondenti dovute alla presenza di più siti di difetto. Al contrario, il nostro protocollo crea difetti rettangolari bilaterali lungo la sutura coronale, puntando a un modello di ricerca più snello e mirato. Le principali suture craniche includono le suture coronali, sagittali, metopiche e lambdoidee21. A differenza delle suture metopiche e sagittali, che sono disposte longitudinalmente sul cranio, le suture coronali e lambdoidi sono situate trasversalmente e possono essere divise in due metà, facilitando la creazione di due difetti con condizioni identiche. A differenza della sutura lambdoidea, il campo chirurgico esposto dall'incisione del cuoio capelluto è più accessibile per una serie di procedure alla sutura coronale. La creazione di difetti sia nella metà sinistra che in quella destra della sutura coronale e l'applicazione di interventi diversi a ciascun sito facilitano un confronto più diretto di terapie distinte attraverso l'autocontrollo. Inoltre, questo approccio consente un confronto tra i lati trattati e non trattati, fornendo informazioni sulle disparità tra il processo di guarigione intervenuto e il processo di guarigione naturale. Pertanto, il nostro studio suggerisce che la creazione di difetti compositi sutura-osso su entrambi i lati delle suture coronali nei ratti è un modello chirurgico adatto per lo studio di terapie rigenerative di sutura.

La selezione delle dimensioni dei difetti è meticolosamente guidata da considerazioni pratiche e anatomiche. Per questo specifico modello animale, la sfida principale consiste nel rimuovere completamente la sutura coronale preservando le suture sagittali e frontali, con una rimozione minima del tessuto osseo. La strategia ottimale, quindi, prevede la creazione di un preciso difetto rettangolare lungo la sutura coronale. Questa decisione strategica è indispensabile, in quanto qualsiasi mesenchima residuo nella sutura coronale o nelle suture adiacenti potrebbe introdurre imprecisioni nella valutazione del vero impatto rigenerativo del trattamento. Di conseguenza, abbiamo stabilito la massima lunghezza del difetto possibile per ratti SD maschi da 300 g a circa 4,5 mm. Inoltre, tenendo conto della larghezza della sutura coronale in direzione antero-posteriore (circa 1,5 mm sul piano sagittale, come mostrato nella Figura supplementare S1), abbiamo impostato la larghezza del difetto a 2 mm per garantire la completa rimozione della sutura dalla superficie cranica alla sua profondità. Vale la pena notare che le dimensioni specifiche del difetto, sia in lunghezza che in larghezza, possono richiedere un aggiustamento in base a fattori quali il tipo e l'età dell'animale, nonché gli obiettivi sperimentali. Un altro studio ha creato un sottile difetto rettangolare lungo la sutura coronale, largo 0,3-0,4 mm, che si adatta alle dimensioni più piccole dei topi13.

In particolare, la difficoltà nel generare questo modello chirurgico risiede nella costruzione di difetti rettangolari standard e uniformi. È imperativo mantenere la coerenza nella forma del difetto per garantire un dosaggio uniforme dei fattori bioattivi tra i campioni, riducendo così al minimo le variazioni sia tra i gruppi che tra i gruppi. A questo proposito, durante il processo di rimozione del complesso sutura-osso, abbiamo inizialmente impiegato una fresa rotonda di 1,2 mm di diametro per localizzare la sutura coronale e per creare un contorno approssimativo del difetto rettangolare a tutto spessore (Figura 1B). Successivamente, siamo passati alla fresa rotonda più piccola (0,8 mm di diametro) per affinare le curve ad angolo retto e levigare i bordi difettosi (Figura 1B). Per garantire la coerenza della lunghezza e della larghezza di ciascun difetto, è stato utilizzato un calibro a corsoio per evitare una rettifica eccessiva o insufficiente durante il processo di foratura. Nonostante questo approccio, la scansione μCT ha rivelato che il difetto rettangolare che abbiamo generato è ancora in qualche modo a forma di arco (Figura 4), suggerendo la necessità di un'ulteriore ottimizzazione del metodo di modellazione per ottenere forme di rettifica precise.

Per valutare la prognosi, le scansioni μCT forniscono i mezzi più diretti, tra cui la valutazione della guarigione del tessuto osseo e lo stato delle suture craniche, indipendentemente dal fatto che siano chiuse o non ostruite. Inoltre, l'indagine a livello istopatologico è essenziale per lo studio della rigenerazione della sutura cranica. La colorazione istopatologica aiuta a differenziare la non chiusura dei difetti dovuti alla formazione di tessuto mesenchimale, all'inibizione del restauro osseo o all'occupazione dello spazio del materiale. È probabile che solo gli approcci che facilitano la rigenerazione del tessuto mesenchimale possiedano il potenziale per la rigenerazione della sutura cranica. Inoltre, nonostante la mancanza di esperimenti rilevanti durante la costruzione del modello, si raccomanda vivamente di rilevare l'espressione a livello proteico dei marcatori MSC di sutura all'interno del tessuto rigenerato dopo interventi terapeutici. Questa analisi, che impiega tecniche come l'immunofluorescenza, l'immunoistochimica o la citometria a flusso, contribuisce a confermare il successo della rigenerazione della sutura. I marcatori MSC specifici per sutura includono Cd51, Cd200, Gli1, Axin2, Prrx1, Ctsk e altri 1,22.

In sintesi, questo studio ha riportato il processo di modellazione dettagliata dei difetti compositi della sutura calvario-osso nei ratti per studiare la prognosi dei difetti calvari a sutura incrociata e sviluppare terapie appropriate per la rigenerazione delle suture craniche. È pertinente notare che il campo della rigenerazione delle suture craniche è effettivamente di nicchia, senza modelli o metodi standard prevalenti in letteratura per la rigenerazione delle suture craniche. Pertanto, riteniamo che il nostro protocollo fornisca una solida base metodologica per lo studio di approcci rigenerativi di sutura e introduca prospettive innovative sul ripristino funzionale dei difetti calvariali, con l'obiettivo finale di migliorare la qualità della vita dei pazienti.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China 82100982 (F.L.), 82101000 (H.W.), 82001019 (B.Y.), Dipartimento di Scienza e Tecnologia della Provincia del Sichuan 2022NSFSC0598 (B.Y.), 2023NSFSC1499 (H.W.) e dal Finanziamento della Ricerca dalla West China School/Hospital of Stomatology Sichuan University (RCDWJS2021-5). La Figura 3 è stata creata con Biorender.com.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4% paraformaldeideBiosharpBL539A
2% soluzione di iodoforoChengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.Nessuno
75% EtanoloChengdu Jinshan Reagente Chimico Co., Ltd.Nessuno
Batuffoli di cotoneHaishi Hainuo Group Co., Ltd.Nessuno
Cotton fiocLakong Medical Devices Co., Nessuno
Pinze curveChengdu Shifeng Co., Ltd.Nessuno
Software Dataviewer e Ctan per la valutazione del volume dei difetti residui BrukerNone
Frese rotonde a bassa velocitàDreybird Medical Equipment Co., Ltd.RA3-012
RA1-008
Bisturi sterile monousoHangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.Nessuno
Siringhe monouso (22 G)Chengdu Shifeng Co., Ltd.SB1-089 (IX)
Rasoio elettricoJASEBM320210
Acido etilendiammina tetraacetico (EDTA)BioFroxx1340GR500
Kit per macchie di ematossilina ed eosinaBiosharpBL700B
Ago per irrigazione (23 G)Sichuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd.Nessuno
Manipolo a bassa velocitàGuangzhou Dental Guard Technology Co., Ltd.Nessuno Masson
' s Kit macchia tricromicaSolarbioG1340
Tessuti non tessuti mediciHenan Yadu Industrial Co., Ltd. Nessuno
Micro-tomografia computerizzata (µ CT) Scanco Medical AG&micro; CT45
Mimics 20.0 per immagini in sezione trasversaleMaterialiseNone
PortaaghiChengdu Shifeng Co., Ltd.Nessuno
Ascensore periostaleChengdu Shifeng Co., Ltd.Nessuna
soluzione salinaSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.Nessuno
Software di visualizzazione medica Scanco per la ricostruzione di immagini 3DScanco Medical AGNessuno
SPSS Statistics 20.0 per analisi statisticheIBMNessuno
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Riferimenti

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