Analisi delle infezioni delle cellule epiteliali con Shigella

Sommario

Il presente protocollo descrive saggi di infezione per interrogare l'aderenza, l'invasione e la replicazione intracellulare di Shigella utilizzando linee cellulari epiteliali in vitro .

Abstract

Il patogeno batterico enterico adattato all'uomo Shigella causa milioni di infezioni ogni anno, crea effetti di crescita a lungo termine tra i pazienti pediatrici ed è una delle principali cause di decessi per diarrea in tutto il mondo. L'infezione induce diarrea acquosa o sanguinolenta a causa dell'agente patogeno che transita nel tratto gastrointestinale e infetta le cellule epiteliali che rivestono il colon. Con l'aumento sbalorditivo della resistenza agli antibiotici e l'attuale mancanza di vaccini approvati, i protocolli di ricerca standardizzati sono fondamentali per studiare questo formidabile agente patogeno. In questo articolo, vengono presentate metodologie per esaminare la patogenesi molecolare della Shigella utilizzando analisi in vitro dell'aderenza batterica, dell'invasione e della replicazione intracellulare nelle cellule epiteliali del colon. Prima delle analisi dell'infezione, il fenotipo di virulenza delle colonie di Shigella è stato verificato mediante l'assorbimento del colorante rosso Congo su piastre di agar. Durante la coltura batterica possono essere presi in considerazione anche terreni di laboratorio integrati per simulare le condizioni in vivo . Le cellule batteriche vengono quindi utilizzate in un protocollo standardizzato per infettare le cellule epiteliali del colon nelle piastre di coltura tissutale a una molteplicità stabilita di infezione con adattamenti per analizzare ogni fase dell'infezione. Per i saggi di aderenza, le cellule di Shigella vengono incubate con livelli di terreno ridotti per promuovere il contatto batterico con le cellule epiteliali. Sia per i saggi di invasione che per quelli di replicazione intracellulare, la gentamicina viene applicata per vari intervalli di tempo per eliminare i batteri extracellulari e consentire la valutazione dell'invasione e/o la quantificazione dei tassi di replicazione intracellulare. Tutti i protocolli di infezione enumerano i batteri aderenti, invasi e/o intracellulari diluendo in serie i lisati di cellule epiteliali infette e placcando le unità formanti colonie batteriche rispetto ai titoli infettivi sulle piastre di agar rosso del Congo. Insieme, questi protocolli consentono una caratterizzazione e un confronto indipendenti per ogni fase dell'infezione da Shigella delle cellule epiteliali per studiare con successo questo patogeno.

Introduzione

Le malattie diarroiche causate da patogeni batterici enterici rappresentano un onere significativo per la salute globale. Nel 2016, le malattie diarroiche sono state responsabili di 1,3 milioni di decessi in tutto il mondo e sono state la quarta causa di morte nei bambini di età inferiore ai cinque anni^(1,2). Il patogeno batterico enterico Gram-negativo Shigella è l'agente eziologico della shigellosi, una delle principali cause di decessi per diarrea in tutto il mondo³. La shigellosi causa ogni anno una significativa morbilità e mortalità nei bambini dei paesi a basso e medio reddito ^4,5, mentre le infezioni nei paesi ad alto reddito sono collegate a focolai di asili nido, di origine alimentare e idrica ^6,7,8,9. Lo sviluppo inefficace di vaccini¹⁰ e l'aumento dei tassi di resistenza antimicrobica (AMR)^11,12 hanno complicato la gestione delle epidemie di Shigella su larga scala. I recenti dati dei Centers for Disease Control and Prevention mostrano che quasi il 46% delle infezioni da Shigella negli Stati Uniti ha mostrato resistenza ai farmaci nel 2020^13,14, mentre l'Organizzazione Mondiale della Sanità ha dichiarato la Shigella come patogeno prioritario della resistenza antimicrobica per la quale sono urgentemente necessarie nuove terapie¹⁵.

Le infezioni da Shigella si trasmettono facilmente per via oro-fecale dopo l'ingestione di cibo o acqua contaminati o attraverso il contatto umano diretto. La Shigella si è evoluta per essere un agente patogeno efficiente e adattato all'uomo, con una dose infettiva di 10-100 batteri sufficiente a causare la malattia¹⁶. Durante il transito dell'intestino tenue, la Shigella è esposta a segnali ambientali, come la temperatura elevata e la bile¹⁷. Il rilevamento di questi segnali induce cambiamenti trascrizionali per esprimere fattori di virulenza che aumentano la capacità dei batteri di infettare il colon umano 17,18,19. La Shigella non invade l'epitelio del colon dalla superficie apicale, ma piuttosto transita attraverso lo strato epiteliale dopo l'assorbimento in cellule microfold specializzate presentanti l'antigene (cellule M) all'interno dell'epitelio associato al follicolo 20,21,22. Dopo la transcitosi, le cellule Shigella vengono fagocitate dai macrofagi residenti. La Shigella sfugge rapidamente al fagosoma e innesca la morte delle cellule macrofagiche, con conseguente rilascio di citochine pro-infiammatorie ^5,23,24. La Shigella invade quindi le cellule epiteliali del colon dal lato basolaterale, lisa il vacuolo macropinocitico e stabilisce una nicchia replicativa nel citoplasma ^5,25. Le citochine pro-infiammatorie, in particolare l'interleuchina-8 (IL-8), reclutano leucociti neutrofili polimorfonucleati (PMN) nel sito di infezione, che indebolisce le giunzioni strette epiteliali e consente l'infiltrazione batterica del rivestimento epiteliale per esacerbare l'infezione basolaterale⁵. I PMN distruggono il rivestimento epiteliale infetto per contenere l'infezione, che si traduce nei sintomi caratteristici della dissenteria bacillare (sanguinolenta)⁵. Sebbene i meccanismi di invasione e replicazione intracellulare siano stati accuratamente caratterizzati, una nuova ricerca sta dimostrando nuovi importanti concetti nell'infezione da Shigella, tra cui la regolazione della virulenza durante il transito gastrointestinale (GI)¹⁷, l'aderenza¹⁹, il miglioramento dell'accesso basolaterale attraverso la permeabilità della barriera²⁶ e il trasporto asintomatico nei bambini malnutriti²⁷.

La capacità di Shigella spp. di causare malattie diarroiche è limitata agli esseri umani e ai primati non umani (NHP)²⁸. Sono stati sviluppati modelli di infezione intestinale della Shigella per il pesce zebra²⁹, i topi³⁰, i porcellini d'India³¹, i conigli 21,32,33 e i maiali^34,35. Tuttavia, nessuno di questi sistemi modello è in grado di replicare accuratamente le caratteristiche della malattia osservate durante l'infezione umana³⁶. Sebbene siano stati stabiliti modelli NHP di shigellosi per studiare la patogenesi della Shigella, questi sistemi modello sono costosi da implementare e richiedono dosi infettive artificialmente elevate, fino a nove ordini di grandezza superiori alla dose infettiva degli esseri umani 37,38,39,40,41,42. Pertanto, il notevole adattamento della Shigella per l'infezione di ospiti umani richiede l'uso di colture cellulari di derivazione umana per ricreare modelli fisiologicamente rilevanti per un'accurata interrogazione della patogenesi della Shigella.

Qui, vengono descritte procedure dettagliate per misurare i tassi di aderenza, invasione e replicazione di Shigella all'interno delle cellule epiteliali del colon HT-29. Utilizzando questi protocolli standardizzati, i meccanismi molecolari con cui i geni di virulenza batterica e i segnali ambientali influenzano ogni fase dell'infezione da Shigella possono essere interrogati per comprendere meglio la relazione dinamica di interazione ospite-patogeno.

Protocollo

1. Preparazione di reagenti e materiali

NOTA: Tutti i volumi sono coerenti con un test che utilizza due piastre a 6 pozzetti.

1. TSB mezzo: Aggiungere 0,5 L di acqua deionizzata (DI) a 15 g di brodo di soia triptico (TSB, vedi tabella dei materiali) e autoclave. Conservare a temperatura ambiente.
2. Terreno di sali biliari (TSB + BS): Per preparare TSB contenente lo 0,4% (p/v) di sali biliari, risospendere 0,06 g di sali biliari (BS, vedere la tabella dei materiali) in 15 mL di TSB sterilizzato in autoclave. Sterilizzare con filtro utilizzando un filtro PES da 0,22 μm.
   NOTA: I sali biliari sono costituiti da una miscela 1:1 di colato di sodio e desossicolato di sodio. Preparare i terreni freschi immediatamente prima dell'uso.
3. DMEM + 10% (v/v) FBS: Aggiungere 5 mL di siero fetale bovino (FBS) a 45 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Conservare a 4 °C.
4. DMEM + gentamicina: a una provetta da 50 mL, aggiungere 50 mL di DMEM e 50 μL di gentamicina da 50 mg/mL (vedere la tabella dei materiali).
   NOTA: Preparare un'aliquota fresca e scaldare a bagnomaria a 37 °C prima di ogni esperimento.
5. PBS + 1% (v/v) Triton X-100: Aggiungere 150 μL di Triton X-100 a 15 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   NOTA: Preparare un'aliquota fresca e scaldare a bagnomaria a 37 °C prima di ogni esperimento.
6. Piastre indicatrici rosse TSB + Congo: Aggiungere 15 g di TSB, 7,5 g di agar selezionato e 0,125 g di colorante rosso Congo (vedi Tabella dei materiali) in un flacone da 1 L. Aggiungere 0,5 L di acqua deionizzata e autoclave. Versare 10-20 ml di terreno in singole piastre di Petri sterili (100 mm x 15 mm) e lasciare solidificare.
   ATTENZIONE: Il rosso Congo è cancerogeno e una tossina riproduttiva. Assicurarsi che la manipolazione del rosso Congo avvenga utilizzando i dispositivi di protezione individuale appropriati. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per ulteriori informazioni.
   NOTA: Circa 20 lastre sono realizzate con supporti rossi Congo da 0,5 L. I piatti possono essere preparati con 2-3 giorni di anticipo e lasciati capovolti a temperatura ambiente fino al momento dell'uso. Per la conservazione a lungo termine, posizionare le piastre invertite in manicotti di plastica a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
7. DMEM + 10% (v/v) FBS e 5% (v/v) dimetilsolfossido (DMSO): aggiungere 42,5 mL di DMEM, 5 mL di FBS e 2,5 mL di DMSO a una provetta da 50 mL. Conservare a 4 °C.

2. Preparazione dei batteri

NOTA: Tutti i protocolli di coltivazione e conservazione della Shigella in laboratorio sono adattati da Payne, S. ^M.43.

ATTENZIONE: Le Shigella spp. sono patogeni del gruppo di rischio 2⁴⁴. Eseguire tutto il lavoro di laboratorio in un ambiente BSL-2, con ulteriori misure di sicurezza adottate per limitare le esposizioni accidentali dovute alla bassa dose infettiva di Shigella spp.

1. Crescita della Shigella da stock congelati
   1. Trasferire una piccola quantità di coltura congelata dal flaconcino criogenico a una piastra di agar rosso TSB + Congo utilizzando un applicatore sterile.
   2. Sterilizzare a fiamma un ciclo di inoculazione e lasciarlo raffreddare. Strisciare l'inoculo avanti e indietro su un quadrante della piastra. Fiammeggiare l'anello, lasciarlo raffreddare, quindi strisciare dal primo quadrante al secondo quadrante della piastra. Ripetere l'operazione per striare l'inoculo nel terzo e quarto quadrante della piastra.
      NOTA: In alternativa, striare l'inoculo utilizzando un applicatore sterile fresco tra ciascun quadrante.
   3. Capovolgere la piastra e incubare a 37 °C per una notte.
      NOTA: L'incubazione a temperature ≥37 °C è necessaria per l'espressione dei fattori di virulenza della Shigella necessari per l'osservazione del fenotipo⁴⁵ del Congo rosso-positivo (CR⁺). Le colonie avirulente avranno un aspetto bianco e non saranno invasive.
   4. Sigillare la piastra con pellicola di paraffina e conservare in frigorifero a 4 °C.
      NOTA: Le colonie batteriche rimarranno vitali sulle piastre di agar per 1-2 settimane.
2. Crescita notturna della Shigella in coltura liquida
   1. Aliquotare 3 mL di terreno TSB in provette sterili da 14 mL.
   2. Prelevare una singola colonia rossa (CR+) ben isolata utilizzando un applicatore sterile e risospendere in terreno liquido.
   3. Incubare le colture per una notte (16-18 h) a 37 °C con agitazione a 250 rotazioni al minuto (rpm).

3. Preparazione di cellule eucariotiche HT-29

NOTA: Tutti i volumi sono coerenti con un test che utilizza due piastre a 6 pozzetti. Le linee cellulari HT-29 sono state acquisite dall'American Type Culture Collection (ATCC). I protocolli di manutenzione HT-29 sono adattati dalle raccomandazioni ATCC⁴⁶. Tutti i fluidi devono essere preriscaldati a bagnomaria a 37 °C prima dell'uso. Tutti i protocolli di manutenzione HT-29 devono essere eseguiti in una cabina di biosicurezza. Astenersi dal produrre bolle durante la miscelazione/lavorazione con le cellule HT-29 nei terreni per evitare cambiamenti drammatici del pH.

1. Scongelamento di cellule HT-29 da brodo congelato
   1. Scongelare il flaconcino di cellule HT-29 a bagnomaria a 37 °C.
      NOTA: Assicurarsi che il tappo rimanga completamente al di sopra dell'acqua per evitare contaminazioni. Lo scongelamento dovrebbe richiedere meno di 2 minuti.
   2. Rimuovere il flaconcino dall'acqua immediatamente dopo che la coltura è stata completamente scongelata e decontaminare con etanolo al 70%. Assicurarsi che tutte le fasi da questo punto vengano eseguite utilizzando tecniche asettiche.
   3. Aggiungere tutto il contenuto del flaconcino a una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 9 mL di DMEM + 10% FBS. Centrifugare a 125 x g per 5 min a temperatura ambiente.
   4. Travasare il surnatante in un contenitore di scarto e risospendere il pellet in 10 mL di DMEM caldo + 10% FBS. Trasferire le cellule risospese in un matraccio per coltura tissutale^{da 75 cm 2} (T75) contenente 10 mL di DMEM caldo + 10% FBS (volume totale di 20 mL).
   5. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂ fino a raggiungere il 90% di confluenza (circa 6-7 giorni).
      NOTA: La confluenza è stimata attraverso l'approssimazione visiva.
2. Semina di cellule HT-29
   1. Preriscaldare 20 mL di PBS e 50 mL di DMEM + 10% FBS a bagnomaria a 37 °C e preriscaldare 3 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% (p/v) a temperatura ambiente.
   2. Una volta che le cellule HT-29 (dal punto 3.1) raggiungono il 90% di confluenza, travasare il terreno di coltura cellulare HT-29 dal matraccio T75 in un contenitore per rifiuti. Versare ~10 ml di PBS caldo nel pallone e agitare delicatamente per lavare. Travasare il PBS in un contenitore per rifiuti. Lavare nuovamente con PBS caldo e decantare.
   3. Aggiungere 2-3 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% (p/v) e agitare delicatamente su tutta la superficie. Incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ per 4 min.
   4. Rimuovere il pallone dall'incubatrice e agitare delicatamente la tripsina-EDTA, assicurandosi visivamente che tutte le cellule si stacchino dalla superficie.
   5. Aggiungere immediatamente 6 mL di DMEM caldo + 10% FBS per disattivare la tripsina. Pipettare su e giù per mescolare accuratamente.
   6. Trasferire tutto il contenuto in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugarla a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   7. Decantare delicatamente il surnatante in un contenitore per rifiuti e risospendere il pellet in 6 mL di DMEM caldo + 10% FBS.
   8. Immediatamente dopo la risospensione, trasferire 10 μL di cellule HT-29 sospese dal centro della coltura a una provetta PCR da 0,2 mL. Aggiungere 10 μL di colorante blu Trypan nella provetta PCR e mescolare.
   9. Aggiungere 10 μL di miscela di cellule HT-29/blu di tripano a un vetrino monouso della camera di conteggio delle cellule Countess (vedere la tabella dei materiali). Enumerare il numero di cellule vive e calcolare la vitalità cellulare.
      NOTA: Quando si documenta il numero di cellule nel campione, leggere il numero sotto il conteggio delle cellule "vive", non il numero totale delle cellule. In alternativa, l'enumerazione delle cellule può essere eseguita manualmente utilizzando un emocitometro.
   10. Le cellule HT-29 in sospensione del seme in un matraccio T75 fresco o in una piastra a 6 pozzetti.
       1. Per il pallone T75:
          1. Pipettare delicatamente per mescolare, quindi trasferire 2,5 x 10⁶ cellule in un matraccio T75 fresco secondo l'equazione seguente:
             
          2. Aggiungere terreno caldo DMEM + 10% FBS a un volume finale di 20 mL (concentrazione finale di 1,25 x 10⁵ cellule/mL).
          3. Disperdere le cellule in modo uniforme sul pallone dondolando delicatamente avanti e indietro.
          4. Incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ fino a quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza.
             NOTA: Per una crescita ottimale, sostituire il terreno DMEM + 10% FBS nel pallone T75 ogni ~3 giorni. Travasare il terreno in un contenitore per rifiuti e aggiungere 10 ml di PBS caldo nel pallone. Agitare delicatamente il PBS e travasarlo nel contenitore dei rifiuti. Quindi aggiungere 20 mL di DMEM fresco e caldo + 10% FBS nel matraccio e rimettere nell'incubatore a 37 °C, 5% CO₂ .
       2. Per piastra a 6 pozzetti:
          1. Pipettare delicatamente per mescolare, quindi trasferire 5,85 x 10⁶ cellule in una nuova provetta conica da 50 mL secondo l'equazione seguente:
             
          2. Aggiungere terreno DMEM caldo + 10% FBS a un volume finale di 26 mL (concentrazione finale di 2,25 x 10⁵ cellule/mL).
          3. Pipettare delicatamente per mescolare, quindi erogare 2 mL (4,5 x 10⁵ cellule) in singoli pozzetti di piastre a 6 pozzetti.
          4. Disperdere le cellule in modo uniforme attraverso il pozzetto oscillando delicatamente su/giù e sinistra/destra 2-3 volte.
          5. Incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ fino a quando le cellule raggiungono l'80%-95% di confluenza (circa 3-4 giorni).
             NOTA: per i saggi di invasione e replicazione intracellulare si raccomanda una confluenza dell'85%, mentre per i saggi di aderenza si raccomanda una confluenza del 90%-95%. Le cellule dovrebbero raggiungere ~85% di confluenza dopo 48 ore di incubazione con una concentrazione finale di circa 1 x 10⁶ cellule/pozzetto. Possono essere necessari aggiustamenti del numero di cellule seminate e della durata dell'incubazione.
3. Preparazione di brodi HT-29 congelati
   1. Aliquotare 1 mL di DMEM + 10% FBS + 5% di terreno DMSO in singole fiale criogeniche.
   2. Aggiungere 1 x 10⁶ cellule HT-29 del passaggio 3.2.7 a ciascun flaconcino. Calcola il volume delle celle secondo la formula seguente:
      
   3. Conservare le celle HT-29 a lungo termine a temperature inferiori a -130 °C in un congelatore a vapori di azoto liquido.

4. Saggio di aderenza

NOTA: Tutti i volumi sono coerenti con un test che utilizza due piastre a 6 pozzetti.

1. Sottocoltura durante la notte delle colture Shigella tramite diluizione 1:50 in terreni freschi.
   1. Vortex, quindi aggiungere 100 μL di ciascuna coltura notturna a 5 mL di TSB fresco o TSB + BS in una provetta di coltura di dimensioni adeguate.
      NOTA: Limitare il volume di coltura al <20% del volume del pallone di coltura o della provetta per garantire una corretta aerazione.
   2. Incubare a 37 °C con agitazione a 250 giri/min fino a quando le cellule raggiungono una densità ottica (OD₆₀₀) di 0,7 (fase intermedia della crescita della Shigella ); circa 2-2,5 h.
      NOTA: Durante la sottocoltura, somministrare 50 mL di DMEM e un volume sufficiente di PBS per tutte le fasi di lavaggio e porre a bagnomaria a 37 °C. Lasciare che i supporti raggiungano i 37 °C prima dell'uso.
2. Trasferire 2 x 10⁸ unità formanti colonie (CFU) Shigella sottocoltivata in singole provette per microcentrifuga da 2 mL.
   NOTA: 2 x 10⁸ CFU corrispondono a circa 1 mL di cellule batteriche ad un OD₆₀₀ di 0,7. Utilizzare le letture OD₆₀₀ per approssimare CFU/mL in base alla calibrazione di ogni singolo spettrofotometro.
3. Lavare ogni campione di Shigella 2 volte con PBS.
   1. Celle a pellet per centrifugazione a 17.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante, quindi aggiungere 1 mL di PBS caldo e risospendere bene il pellet, pipettando delicatamente il campione su e giù fino a quando la miscela non è completamente omogenea (8-10x).
   2. Ripetere il passaggio 4.3.1 1 volta in più.
   3. Celle di pellet mediante centrifugazione a 17.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente, aspirare il surnatante e risospendere i pellet in 2 mL di DMEM caldo.
      NOTA: La concentrazione finale di batteri risospesi sarà di 1 x 10⁸ CFU/mL.
4. Vortex, quindi aggiungere 1 mL (1 x 10⁸ CFU) di Shigella risospesa a ciascun pozzetto dei monostrati epiteliali del colon HT-29 preparati in piastre a 6 pozzetti (dal passaggio 3.2.10.2).
   NOTA: Le infezioni vengono normalmente eseguite con una molteplicità di infezioni (MOI; rapporto tra cellule batteriche ed epiteliali) di 100. Per testare diversi MOI, diluire la Shigella risospesa in DMEM caldo alla concentrazione desiderata, quindi aggiungere 1 mL di batteri diluiti ai monostrati HT-29. Ad esempio, per testare un MOI di 10, diluire i batteri 1:10 aggiungendo 150 μL di 1 x 10⁸ CFU/mL di batteri a 1,35 mL di DMEM caldo, quindi applicare 1 mL (1 x 10⁷ CFU) alle cellule HT-29.
5. Incubare le piastre a 6 pozzetti a 37 °C con il 5% di CO₂ per 3 ore.
6. Durante l'incubazione, determinare il titolo dell'infezione batterica.
   1. Preparare diluizioni seriali 10 volte di cellule Shigella risospese (dal punto 4.3.3) in PBS.
   2. Fissare 100 μL delle diluizioni 1 x ^10-5 e 1 x ^10-6 su piastre rosse TSB + Congo e incubare per una notte a 37 °C.
      NOTA: La placcatura di 100 μL dalle diluizioni 1 x ^10-5 e 1 x ^10-6 corrisponde a un fattore di diluizione finale rispettivamente di 1 x ^10-6 e 1 x ^10-7.
7. Dopo l'incubazione, lavare i monostrati 4-5 volte con PBS.
   1. Aspirare il terreno da ciascun pozzetto.
      NOTA: Quando si aspirano i fluidi da piastre a 6 pozzetti, guidare la punta dell'aspiratore lungo il lato inferiore dei pozzetti, cercando di evitare il contatto con le celle HT-29.
   2. Aggiungere 1 ml di PBS caldo in ogni pozzetto e lavare delicatamente.
      NOTA: Per lavare delicatamente i monostrati a 6 pozzetti con PBS, spostare la piastra su e giù e da un lato all'altro sul piano di lavoro. Il lavaggio delle piastre con un movimento circolare e/o la rimozione della piastra dalla superficie del piano di lavoro può causare la rimozione meccanica delle cellule dalla plastica.
   3. Ripetere i passaggi 4.7.1 e 4.7.2 altre 4 volte.
8. Rimuovere il PBS mediante aspirazione e lisare le cellule HT-29 aggiungendo 1 mL di PBS + 1% di Triton X-100 a ciascun pozzetto.
9. Incubare le piastre a 6 pozzetti a 37 °C per 5 min.
10. Utilizzare un raschietto per cellule o una punta di pipetta piegata per raschiare le cellule lisate dal fondo del pozzetto e trasferire l'intero 1 mL in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,7 mL.
11. Determinare il numero di batteri associati alle cellule.
    1. Vorticare ogni tubo (dal punto 4.10) per almeno 30 secondi per spostare ulteriormente la Shigella dalle cellule eucariotiche lisate.
    2. Preparare diluizioni seriali di 10 volte di lisati in PBS.
    3. Piastre da 100 μL delle diluizioni 1 x ^10-2, 1 x ^10-3 e 1 x ^10-4 su piastre rosse TSB + Congo e incubare per una notte a 37 °C.
       NOTA: La placcatura di 100 μL dalle diluizioni 1 x ^10-2, 1 x ^10-3 e 1 x ^10-4 corrisponde a un fattore di diluizione finale rispettivamente di 1 x ^10-3, 1 x ^10-4 e 1 x ^10-5.

5. Saggio di invasione

NOTA: Tutti i volumi sono coerenti con un test che utilizza due piastre a 6 pozzetti.

1. Sottocoltura durante la notte delle colture Shigella tramite diluizione 1:50 in terreni freschi.
   1. Vortex, quindi aggiungere 100 μL di ciascuna coltura notturna a 5 mL di TSB fresco o TSB + BS in una provetta di coltura di dimensioni adeguate.
      NOTA: Limitare il volume di coltura al <20% del volume del pallone di coltura o della provetta per garantire una corretta aerazione.
   2. Incubare a 37 °C agitando a 250 rpm fino a quando le cellule raggiungono un OD₆₀₀ di 0,7 (fase intermedia della crescita della Shigella ); circa 2-2,5 h.
      NOTA: Durante la sottocoltura, aliquotare 50 mL di DMEM + 50 mg/mL di gentamicina e un volume sufficiente di PBS per tutte le fasi di lavaggio e porre a bagnomaria a 37 °C. Lasciare che i supporti raggiungano i 37 °C prima dell'uso.
2. Trasferire 2 x 10 Shigella sottocoltivata da⁸ CFU in provette individuali da microcentrifuga da 2 mL.
   NOTA: 2 x 10⁸ CFU corrispondono a circa 1 mL di cellule batteriche ad un OD₆₀₀ di 0,7. Utilizzare le letture OD₆₀₀ per approssimare CFU/mL in base alla calibrazione di ogni singolo spettrofotometro.
3. Lavare i campioni di Shigella 1 volta con PBS.
   1. Celle a pellet per centrifugazione a 17.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante, quindi aggiungere 1 mL di PBS caldo e risospendere bene il pellet, pipettando delicatamente il campione su e giù fino a quando la miscela non è completamente omogenea (8-10x).
   2. Ripetere il passaggio 5.3.1. 1x tempo supplementare.
   3. Celle di pellet mediante centrifugazione a 17.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente, aspirare il surnatante e risospendere i pellet in 2 mL di DMEM caldo.
      NOTA: La concentrazione finale di batteri risospesi sarà di 1 x 10⁸ CFU/mL.
4. Vortex, quindi aggiungere 1 mL (1 x 10⁸ CFU) di Shigella risospesa più 1 mL di DMEM a ciascun pozzetto dei monostrati epiteliali del colon HT-29 preparati in piastre a 6 pozzetti (dal passaggio 3.2.10.2).
   NOTA: Le infezioni vengono normalmente eseguite con una molteplicità di infezioni (MOI; rapporto tra cellule batteriche ed epiteliali) di 100. Per testare diversi MOI, diluire la Shigella in sospensione in DMEM alla concentrazione desiderata, quindi aggiungere 1 mL di batteri diluiti ai monostrati HT-29. Ad esempio, per testare un MOI di 10, diluire i batteri 1:10 aggiungendo 150 μL di 1 x 10⁸ CFU/mL di batteri a 1,35 mL di DMEM, quindi aggiungere 1 mL (1 x 10⁷ CFU) alle cellule HT-29.
5. Per favorire il contatto batterico con le cellule HT-29, centrifugare le piastre a 6 pozzetti a 2.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente o 37 °C se è possibile regolare l'impostazione della temperatura.
   NOTA: La centrifugazione favorisce il contatto batterico con le cellule HT-29, che bypassa la necessità di fattori di aderenza e consente ai batteri di invadere rapidamente le cellule.
6. Incubare piastre a 6 pozzetti a 37 °C con il 5% di CO₂ per 45 min.
7. Durante l'incubazione, determinare il titolo dell'infezione batterica.
   1. Preparare diluizioni seriali di 10 volte di cellule Shigella risospese (dal punto 5.3.3) in PBS.
   2. Fissare 100 μL delle diluizioni 1 x ^10-5 e 1 x ^10-6 su piastre rosse TSB + Congo e incubare per una notte a 37 °C.
      NOTA: La placcatura di 100 μL dalle diluizioni 1 x ^10-5 e 1 x ^10-6 corrisponde a un fattore di diluizione finale rispettivamente di 1 x ^10-6 e 1 x ^10-7.
8. Lavare accuratamente le cellule HT-29 infette 3 volte con 1 ml di PBS.
   1. Aspirare il terreno da ciascun pozzetto.
      NOTA: Quando si aspirano i fluidi da piastre a 6 pozzetti, guidare la punta dell'aspiratore lungo il lato inferiore dei pozzetti, cercando di evitare il contatto con le celle HT-29.
   2. Aggiungere 1 ml di PBS caldo in ogni pozzetto e lavare delicatamente.
      NOTA: Per lavare delicatamente i monostrati a 6 pozzetti con PBS, spostare la piastra su e giù e da un lato all'altro sul piano di lavoro. Il lavaggio delle piastre con un movimento circolare e/o la rimozione della piastra dalla superficie del piano di lavoro può causare la rimozione meccanica delle cellule dalla plastica.
   3. Ripetere i passaggi 5.8.1 e 5.8.2 altre 2 volte.
9. Rimuovere il PBS mediante aspirazione, quindi aggiungere 2 mL di DMEM caldo integrato con 50 μg/mL di gentamicina in ciascun pozzetto e incubare per 30 minuti a 37 °C con il 5% di CO₂ .
10. Lavare accuratamente le cellule HT-29 infette 3 volte con 1 ml di PBS.
    1. Ripetere il passaggio di lavaggio 5.8.
11. Rimuovere il PBS mediante aspirazione, quindi aggiungere 2 mL di DMEM caldo integrato con 50 μg/mL di gentamicina in ciascun pozzetto e incubare per 60 minuti a 37 °C con il 5% di CO₂ .
12. Lavare accuratamente le cellule HT-29 infette 3 volte con 1 ml di PBS.
    1. Ripetere il passaggio di lavaggio 5.8.
13. Rimuovere il PBS mediante aspirazione e lisare le cellule HT-29 aggiungendo 1 mL di PBS + 1% di Triton X-100 a ciascun pozzetto.
14. Incubare le piastre a 6 pozzetti a 37 °C per 5 min.
15. Utilizzare un raschietto per cellule o una punta di pipetta piegata per raschiare le cellule lisate dal fondo del pozzetto e trasferire l'intero 1 mL in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,7 mL.
16. Determinare il numero di batteri intracellulari.
    1. Vorticare ogni tubo (dal punto 5.15) per almeno 30 s per spostare ulteriormente la Shigella dalle cellule eucariotiche lisate.
    2. Preparare diluizioni seriali di 10 volte di lisati in PBS.
    3. Piastre da 100 μL delle diluizioni 1 x ^10-2 e 1 x ^10-3 su piastre rosse TSB + Congo e incubare per una notte a 37 °C.
       NOTA: La placcatura di 100 μL dalle diluizioni 1 x ^10-2 e 1 x ^10-3 corrisponde a un fattore di diluizione finale rispettivamente di 1 x ^10-3 e 1 x ^10-4.

6. Saggio di replicazione intracellulare

NOTA: Tutti i volumi sono coerenti con un test che utilizza due piastre a 6 pozzetti.

1. Sottocoltura durante la notte delle colture Shigella tramite diluizione 1:50 in terreni freschi.
   1. Vortex, quindi aggiungere 100 μL di ciascuna coltura notturna a 5 mL di TSB fresco o TSB + BS in una provetta di coltura di dimensioni adeguate.
      NOTA: Limitare il volume di coltura al <20% del volume del pallone di coltura o della provetta per garantire una corretta aerazione.
   2. Incubare a 37 °C agitando a 250 rpm fino a quando le cellule raggiungono un OD₆₀₀ di 0,7 (fase intermedia della crescita della Shigella ); circa 2-2,5 h.
      NOTA: Durante la sottocoltura, aliquotare 50 mL di DMEM + 50 mg/mL di gentamicina e un volume sufficiente di PBS per tutte le fasi di lavaggio e porre a bagnomaria a 37 °C. Lasciare che i supporti raggiungano i 37 °C prima dell'uso.
2. Trasferire 2 x 10 Shigella sottocoltivata da⁸ CFU in provette individuali da microcentrifuga da 2 mL.
   NOTA: 2 x 10⁸ CFU corrispondono a circa 1 mL di cellule batteriche ad un OD₆₀₀ di 0,7. Utilizzare le letture OD₆₀₀ per approssimare CFU/mL in base alla calibrazione di ogni singolo spettrofotometro.
3. Lavare i campioni di Shigella 1 volta con PBS.
   1. Celle a pellet per centrifugazione a 17.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante, quindi aggiungere 1 mL di PBS caldo e risospendere bene il pellet, pipettando delicatamente il campione su e giù fino a quando la miscela non è completamente omogenea (8-10x).
   2. Ripetere il passaggio 6.3.1. 1x tempo supplementare.
   3. Celle di pellet mediante centrifugazione a 17.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente, aspirare il surnatante e risospendere i pellet in 2 mL di DMEM caldo.
      NOTA: La concentrazione finale di batteri risospesi sarà di 1 x 10⁸ CFU/mL.
4. Vortex, quindi aggiungere 1 mL (1 x 10⁸ CFU) di Shigella risospesa più 1 mL di DMEM a ciascun pozzetto di monostrati epiteliali del colon HT-29 preparati in piastre a 6 pozzetti (dal passaggio 3.2.10.2).
   NOTA: Le infezioni vengono normalmente eseguite con una molteplicità di infezioni (MOI; rapporto tra cellule batteriche ed epiteliali) di 100. Per testare diversi MOI, diluire la Shigella in sospensione in DMEM alla concentrazione desiderata, quindi aggiungere 1 mL di batteri diluiti ai monostrati HT-29. Ad esempio, per testare un MOI di 10, diluire i batteri 1:10 aggiungendo 150 μL di 1 x 10 batteri^{da 8} CFU/mL a 1,35 mL di DMEM, quindi applicare 1 mL (1 x 10⁷ CFU) alle cellule HT-29.
5. Per favorire il contatto batterico con le cellule HT-29, centrifugare le piastre a 6 pozzetti a 2.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente o 37 °C se è possibile regolare l'impostazione della temperatura.
   NOTA: La centrifugazione favorisce il contatto batterico con le cellule HT-29, che bypassa la necessità di fattori di aderenza e consente ai batteri di invadere rapidamente le cellule.
6. Incubare piastre a 6 pozzetti a 37 °C con il 5% di CO₂ per 45 min.
7. Durante l'incubazione, determinare il titolo dell'infezione batterica.
   1. Preparare diluizioni seriali di 10 volte di cellule Shigella risospese (dal passaggio 6.3.3) in PBS.
   2. Fissare 100 μL delle diluizioni 1 x ^10-5 e 1 x ^10-6 su piastre rosse TSB + Congo e incubare per una notte a 37 °C.
      NOTA: La placcatura di 100 μL dalle diluizioni 1 x ^10-5 e 1 x ^10-6 corrisponde a un fattore di diluizione finale rispettivamente di 1 x ^10-6 e 1 x ^10-7.
8. Lavare accuratamente le cellule HT-29 infette 3 volte con 1 ml di PBS.
   1. Aspirare il terreno da ciascun pozzetto.
      NOTA: Quando si aspirano i fluidi da piastre a 6 pozzetti, guidare la punta dell'aspiratore lungo il lato inferiore dei pozzetti, cercando di evitare il contatto con le celle HT-29.
   2. Aggiungere 1 ml di PBS caldo in ogni pozzetto e lavare delicatamente.
      NOTA: Per lavare delicatamente i monostrati a 6 pozzetti con PBS, spostare la piastra su e giù e da un lato all'altro sul piano di lavoro. Il lavaggio delle piastre con un movimento circolare e/o la rimozione della piastra dalla superficie del piano di lavoro può causare la rimozione meccanica delle cellule dalla plastica.
   3. Ripetere i passaggi 6.8.1 e 6.8.2 altre 2 volte.
9. Rimuovere il PBS mediante aspirazione, quindi aggiungere 2 mL di DMEM caldo integrato con 50 μg/mL di gentamicina in ciascun pozzetto e incubare per 30 minuti a 37 °C con il 5% di CO₂ .
10. Lavare accuratamente le cellule HT-29 infette 3 volte con 1 ml di PBS.
    1. Ripetere il passaggio di lavaggio 6.8.
11. Rimuovere il PBS mediante aspirazione, quindi aggiungere 2 mL di DMEM caldo con 50 μg/mL di gentamicina a ciascun pozzetto delle piastre a 6 pozzetti e incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ per il periodo di tempo desiderato per consentire la replicazione intracellulare (fino a 24 ore).
12. Lavare accuratamente le cellule 2 volte con 1 mL di PBS.
    1. Ripetere il passaggio di lavaggio 6.8.
13. Rimuovere il PBS mediante aspirazione e lisare le cellule HT-29 aggiungendo 1 mL di PBS + 1% di Triton X-100 a ciascun pozzetto.
14. Incubare le piastre a 6 pozzetti a 37 °C per 5 min.
15. Utilizzare un raschietto per cellule o un puntale per pipetta piegato per raschiare le cellule lisate dal fondo del pozzetto e trasferire l'intero 1 mL in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,7 mL.
16. Determinare il numero di batteri intracellulari.
    1. Vorticare ogni tubo (dal punto 6.15) per almeno 30 secondi per spostare ulteriormente la Shigella dalle cellule eucariotiche lisate.
    2. Preparare diluizioni seriali di 10 volte di lisati in PBS.
    3. Piastre da 100 μL di 1 x ^10-2, 1 x ^10-3 e 1 x ^10-4 diluizioni su piastre TSB + Congo Red e incubare per una notte a 37 °C.
       NOTA: La placcatura di 100 μL dalle diluizioni 1 x ^10-2, 1 x ^10-3 e 1 x ^10-4 corrisponde a un fattore di diluizione finale rispettivamente di 1 x ^10-3, 1 x ^10-4 e 1 x ^10-5.

Risultati

Sono stati eseguiti saggi di aderenza, invasione e replicazione intracellulare confrontando S. flexneri 2457T wild type (WT) con S. flexneri ΔVF (ΔVF), un mutante che si ipotizza regoli negativamente la virulenza della Shigella. Poiché la Shigella utilizza i sali biliari come segnale per regolare la virulenza 17,18,47, sono stati eseguiti esperimenti dopo la subcoltura batterica in terreni TSB e TSB integrato con lo 0,4% (p/v) di sali biliari¹⁸. L'esposizione ai sali biliari durante la fase di sottocoltura funge da pre-trattamento per replicare il transito dell'intestino tenue prima dell'infezione del colon 17,18,47. La Figura 1 analizza l'effetto della mutazione ΔVF sulla capacità di S. flexneri di aderire alle cellule epiteliali del colon HT-29. L'aderenza percentuale è tracciata sull'asse y e rappresenta il rapporto tra i batteri recuperati dopo la lisi HT-29 standardizzati e il numero di batteri in ingresso. Come previsto, entrambi i ceppi di S. flexneri WT e ΔVF hanno avuto un aumento significativo dell'aderenza quando sono stati sottoposti a subcoltura con integrazione di sali biliari rispetto a TSB senza integrazione di sali biliari¹⁸. Tuttavia, non c'era alcuna differenza nell'aderenza alle cellule HT-29 tra i ceppi mutanti WT e ΔVF all'interno di ciascuna condizione di sottocoltura. Questi dati indicano che la mutazione ΔVF non ha alcun effetto sulla capacità di S. flexneri di aderire alle cellule epiteliali HT-29 con o senza il pretrattamento dei sali biliari.

Nella Figura 2 è stato analizzato l'effetto della mutazione ΔVF sulla capacità di S. flexneri di invadere (Figura 2A) e replicarsi (Figura 2B) all'interno delle cellule epiteliali del colon HT-29 con o senza pre-trattamento con sali biliari. La percentuale di recupero è tracciata sull'asse y e rappresenta il rapporto tra le cellule batteriche recuperate dopo la lisi cellulare HT-29 standardizzata e il numero di batteri in ingresso. Nella Figura 2A, ci si aspettava un aumento significativo della capacità di WT S. flexneri 2457T di invadere le cellule HT-29 dopo la pre-esposizione ai sali biliari⁴⁸, mentre il mutante ΔVF di S. flexneri ha mostrato un aumento minore dell'invasione dopo la pre-esposizione ai sali biliari rispetto al ceppo WT. Il mutante ΔVF aveva un aumento dei tassi di invasione delle cellule HT-29 rispetto al WT sottocoltivato in TSB, ma aveva tassi di invasione simili a quelli del WT quando sottocoltivato in TSB integrato con sali biliari (Figura 2A). Questi risultati suggeriscono che la mutazione ΔVF aumenta la capacità di S. flexneri di invadere le cellule HT-29, il che riduce l'effetto dei sali biliari prima dell'esposizione, anche se la capacità di invasione del mutante ΔVF è aumentata ulteriormente dopo la sottocoltura dei sali biliari.

Nel complesso, sono stati recuperati 10 volte più batteri dopo l'incubazione notturna (Figura 2B) rispetto all'incubazione di 90 minuti (Figura 2A), il che dimostra le differenze nel monitoraggio della crescita intracellulare rispetto all'invasione, rispettivamente. Quando le cellule HT-29 infette sono state incubate per 18 ore per consentire la replicazione intracellulare dei batteri (Figura 2B), l'impatto del pre-trattamento con sali biliari è diminuito sia per i ceppi WT che ΔVF . Tuttavia, l'effetto ridotto dei sali biliari prima del trattamento durante la replicazione intracellulare è stato più drammatico per il mutante ΔVF . Poiché l'aumento della replicazione intracellulare di entrambi i ceppi quando pre-esposti ai sali biliari era inferiore all'aumento dei tassi di invasione nelle stesse condizioni, ipotizziamo che i sali biliari abbiano un impatto maggiore sulle prime fasi della patogenesi di S. flexneri . Il mutante ΔVF ha mostrato un aumento della percentuale di recupero dalla replicazione notturna all'interno delle cellule HT-29 rispetto a WT (Figura 2B) dopo entrambe le condizioni di sottocoltura. Tuttavia, le percentuali di recupero del mutante ΔVF erano simili indipendentemente dai sali biliari prima dell'esposizione. Queste tendenze dei dati suggeriscono che il mutante ΔVF si replica in modo più efficiente all'interno delle cellule HT-29 rispetto a WT e che la pre-esposizione ai sali biliari non influisce sulla capacità del mutante ΔVF di replicarsi intracellulare, come osservato per WT (Figura 2B). Poiché la differenza tra i ceppi mutanti e WT nella condizione di pre-esposizione ai sali biliari non è stata osservata durante il test di invasione di 90 minuti, ipotizziamo che il prodotto codificato dal gene VF cancellato possa anche regolare la replicazione di S. flexneri all'interno delle cellule HT-29. Combinate, entrambe le analisi dimostrano che il mutante ΔVF è più virulento rispetto a WT, il che suggerisce che il prodotto del gene VF è un regolatore negativo della virulenza di S. flexneri .

Figura 1: L'adesione indotta dai sali biliari di S. flexneri alle cellule HT-29 prima dell'esposizione. Le cellule mutanti di S. flexneri 2457T WT e ΔVF sono state sottocoltivate in TSB o TSB integrate con terreni allo 0,4% (p/v) di sali biliari (TSB+BS). I batteri sono stati quindi applicati alle cellule HT-29 a una molteplicità di infezione (MOI) di 100 e incubati per 3 ore per esaminare l'aderenza. Dopo l'incubazione, le cellule HT-29 infette sono state lavate e lisate e sono state piastrate diluizioni seriali dei batteri recuperati per enumerare le unità formanti colonie per mL (CFU/ML). Il numero di batteri aderenti viene tracciato in relazione ai titoli dei batteri in ingresso per stabilire la percentuale di aderenza. I dati sono rappresentativi di una replica biologica con tre repliche tecniche (singoli punti). Le barre di errore indicano l'errore standard della media (SEM). La significatività statistica è stata determinata da un test t di Student (*p < 0,05; ***p < 0,001). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: La pre-esposizione dei sali biliari ha aumentato l'invasione di WT S. flexneri e la replicazione intracellulare. Le cellule mutanti di S. flexneri 2457T WT e ΔVF sono state sottocoltivate in TSB o TSB integrate con terreni di sali biliari (TSB+BS). I batteri sono stati quindi applicati alle cellule HT-29 a un MOI di 100, centrifugati sulle cellule e incubati a 37 °C con il 5% di CO₂ per 45 minuti. Le cellule sono state lavate con PBS e i batteri extracellulari sono stati lisati mediante l'aggiunta di gentamicina al DMEM per recuperare esclusivamente i batteri intracellulari. Dopo 90 minuti (A, invasione batterica) o 18 ore (B, replicazione intracellulare) di incubazione, le cellule HT-29 infette sono state lavate e lisate e sono state piastrate diluizioni seriali dei batteri recuperati per enumerare le unità formanti colonie per mL (CFU/ML). Il numero di batteri intracellulari viene tracciato in relazione ai titoli batterici in ingresso per stabilire la percentuale di recupero. I dati sono rappresentativi di una replica biologica, ciascuna con tre repliche tecniche (singoli punti). Le barre di errore indicano il SEM. La significatività statistica è stata determinata da un test t di Student (*p < 0,05). Si prega di notare le differenze nelle scale dell'asse y tra i pannelli (A) e (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo protocollo descrive una serie di tre saggi standardizzati per studiare l'aderenza, l'invasione e la replicazione intracellulare delle cellule epiteliali intestinali della Shigella. Sebbene questi metodi siano semplicemente versioni modificate dei classici saggi di gentamicina utilizzati per studiare l'invasione e la replicazione intracellulare di vari patogeni batterici all'interno delle cellule ospiti 49,50,51, è necessario applicare considerazioni speciali quando si studia Shigella.

Le Shigella sono anaerobi facoltativi, che crescono in modo ottimale a 37 °C in un terreno ricco con aerazione⁴³. Quando si eseguono questi saggi per interrogare gli effetti di diversi segnali ambientali o metaboliti sulle infezioni da Shigella, si raccomanda di far crescere la Shigella in terreni ricchi durante la notte, quindi di sottocolturarli in terreni definiti o integrati fino alla fase intermedia prima dell'infezione. La massima virulenza dell'espressione genica si verifica durante la fase logaritmica della crescita^52,53. Pertanto, la subcoltura notturna delle colture di Shigella e la possibilità di far crescere i batteri in fase esponenziale (OD₆₀₀ ~ 0,7) sono passaggi necessari per valutare correttamente la virulenza della Shigella. Inoltre, l'espressione genica della virulenza è dipendente dalla temperatura. Per garantire la specificità dell'espressione solo durante l'infezione dell'ospite, i geni di virulenza sono indotti a temperature fisiologiche dell'ospite (37 °C) e rigorosamente repressi a temperature più basse (ad esempio, 30 °C)⁵⁴. Per garantire l'espressione dei geni di virulenza, la subcoltura batterica e le infezioni devono essere effettuate a 37 °C, con la dovuta attenzione per garantire che la temperatura non scenda al di sotto dei 37 °C. Un grande plasmide di virulenza di 220 kilobasi, che codifica il macchinario molecolare necessario per l'invasione e l'infezione delle cellule epiteliali, è un determinante di virulenza essenziale per tutta la Shigella spp⁵. Il passaggio ripetuto e la crescita prolungata a 37 °C favoriscono l'instabilità del plasmide di virulenza, con conseguente perdita di plasmidi e rendendo le cellule di Shigella avirulente⁵⁵. Per garantire il mantenimento del plasmide di virulenza e l'espressione di geni di virulenza cruciali, si raccomanda di rifilare i batteri direttamente dalle scorte di congelamento ogni due settimane su piastre indicatrici rosse TSB + Congo fresche. L'agar rosso del Congo può essere utilizzato per differenziare tra colonie virulente di tipo selvatico (rosso, CR⁺) e colonie avirulente (bianche, CR^-) che hanno perso il plasmide di virulenza⁴⁵. Se si osserva ripetutamente l'instabilità del plasmide di virulenza, le colture notturne di Shigella possono essere incubate a 30 °C per prevenire la perdita di plasmidi di virulenza, seguite da subcoltura a 37 °C per promuovere l'espressione genica di virulenza⁴³. Infine, se vengono eseguite analisi con mutanti e/o ceppi complementari, in cui sono presenti marcatori antibiotici in questi ceppi batterici, si raccomanda di utilizzare l'appropriata selezione antibiotica durante le fasi di notte e subcoltura batterica.

L'uso di monostrati epiteliali HT-29 presenta molti vantaggi per lo studio dei meccanismi molecolari della patogenesi della Shigella in vitro. Poiché la Shigella è un patogeno adattato all'uomo, i modelli animali di piccole dimensioni non riflettono accuratamente la patogenesi caratteristica della shigellosi osservata nell'uomo³⁶. Pertanto, l'uso di protocolli standardizzati per l'infezione di linee cellulari di derivazione umana consente l'interrogazione quantitativa delle singole fasi della patogenesi batterica per caratterizzare l'interazione molecolare tra questo patogeno e il suo ospite nativo. Storicamente, le cellule HeLa sono state utilizzate prevalentemente per studiare le interazioni ospite-patogeno in vitro 25,56,57. Tuttavia, le cellule HeLa sono una linea cellulare immortalizzata di cancro cervicale, che sono cellule ospiti non native per patogeni batterici enterici. Pertanto, gli studi in vitro sulla patogenesi enterica si sono spostati verso l'uso di linee cellulari di adenocarcinoma del colon (ad esempio, HT-29, Caco-2 e T84), che ricapitolano più fedelmente la morfologia epiteliale intestinale e possono essere coltivate su transwell come monostrati epiteliali con superfici apicali e basolaterali differenziate 58,59,60. Sebbene ogni linea cellulare abbia i suoi punti di forza e di debolezza individuali, le cellule HT-29 sono utilizzate nei saggi qui descritti a causa delle somiglianze fenotipiche con gli enterociti intestinali e della robusta espressione dei recettori di superficie cellulare e delle citochine pro-infiammatorie 58,59,61. Tuttavia, ciascuno di questi modelli discussi è costituito da linee cellulari derivate dal cancro con fenotipi metabolici e di crescita aberranti che non rappresentano accuratamente lo stato fisiologico naturale dell'epitelio del colon in vivo⁵⁸. I recenti progressi nelle tecniche di coltura dei tessuti umani hanno permesso la coltivazione di cellule staminali intestinali umane, ottenute da biopsie tissutali, in organoidi o singoli monostrati cellulari bidimensionali che ricapitolano i vari tipi di cellule presenti nel tratto gastrointestinale umano (GI) 62,63,64. Gli organoidi intestinali possono essere differenziati per includere enterociti, cellule caliciformi produttrici di muco, cellule M e altri tipi di cellule tessuto-specifiche. Studi recenti hanno convalidato l'uso di questi modelli organoidi per lo studio di patogeni enterici, tra cui vari pathovar^62,63,64 di Shigella spp., Salmonella enterica ed Escherichia coli. Sebbene gli organoidi siano modelli più accurati dell'epitelio gastrointestinale umano e possano anche essere coltivati in varie condizioni nutrizionali per rappresentare la popolazione globale⁶⁵, la loro relativa complessità richiede una formazione e competenze tecniche significative, con conseguenti costi più elevati e tempi di coltura più lunghi rispetto alle linee cellulari tumorali tradizionali⁵⁸.

Questo protocollo descrive i metodi a medio rendimento, in cui vengono utilizzate due piastre a 6 pozzetti per un totale di 12 monostrati disponibili per il test. Tuttavia, gli esperimenti possono essere facilmente scalati per aumentare il numero di monostrati seminati al fine di ospitare ulteriori repliche tecniche o testare ulteriori mutanti di Shigella e segnali ambientali. Le piastre di coltura tissutale con più pozzetti (ad es. piastre a 12 o 24 pozzetti) possono essere utilizzate anche con le opportune regolazioni per tenere conto dei pozzetti con diametri più piccoli. Nelle condizioni di crescita di HT-29 descritte nella fase 3.2, i titoli di HT-29 sono sufficienti per seminare circa sei piastre da 6 pozzetti dopo la coltivazione da un pallone T75, con un numero sufficiente di cellule rimanenti per mantenere la coltura cellulare di HT-29. Inoltre, la semina dei monostrati HT-29 e la preparazione delle fasi di inoculazione dei batteri sono identiche tra i saggi di aderenza batterica, invasione e replicazione intracellulare. Pertanto, i test che testano gli stessi ceppi di Shigella o le stesse condizioni di subcoltura possono essere facilmente eseguiti in parallelo per esaminare simultaneamente il ruolo di ciascuna condizione sperimentale nelle varie fasi dell'infezione da Shigella .

I titoli di recupero per i batteri aderenti (fase 4), invasi (fase 5) e intracellulari (fase 6) sono determinati mediante diluizioni seriali di cellule HT-29 infette dopo la lisi, che consente una valutazione quantitativa dell'efficienza di ciascuna fase dell'infezione da Shigella. Le fasi di centrifugazione nei saggi di invasione e replicazione intracellulare, basate sui saggi classici 49,50,51, promuovono il contatto batterico con le cellule ospiti per l'invasione immediata e aumentano i tassi di invasione. Pertanto, la centrifugazione "salta" la fase di aderenza, che in seguito si è scoperto essere un aspetto importante dell'infezione da Shigella 17,18,19,66. È essenziale notare che la fase di centrifugazione non può essere eseguita con cellule epiteliali polarizzate seminate su transwell. Per il test di aderenza, tuttavia, l'aderenza non è forzata dalla centrifugazione e non viene aggiunta gentamicina alle cellule HT-29 infette prima della lisi, consentendo così l'enumerazione delle cellule batteriche aderenti. Il volume dei terreni di coltura tissutale è ridotto a 1 mL (rispetto ai 2 mL per i saggi di invasione e replicazione intracellulare) per consentire un contatto più efficiente dei batteri con le cellule HT-29. Inoltre, a seconda del tasso di aderenza, durante le 3 ore di incubazione possono verificarsi alcune invasioni e replicazioni intracellulari, ma la quantità è in genere trascurabile (ad esempio, solo lo 0,05% della popolazione batterica recuperata dopo la lisi delle cellule ospiti). Tuttavia, per tenere correttamente conto dei batteri aderenti rispetto a quelli intracellulari durante le 3 ore di incubazione, si raccomanda di eseguire saggi paralleli, dove, oltre al protocollo indicato, viene incubata una seconda piastra con 50 μg/mL di gentamicina in 2 mL di DMEM per pozzetto per 45 minuti totali (15 minuti di incubazione, lavaggio, DMEM fresco + gentamicina per 30 minuti) per lisare a fondo i batteri extracellulari. A seguito della lisi cellulare HT-29 come indicato nel protocollo, i batteri intracellulari possono essere enumerati come indicato sopra e rappresenteranno il numero di batteri che hanno invaso. Questo valore può quindi essere sottratto dai batteri enumerati dalla piastra senza trattamento con gentamicina per determinare in modo appropriato i batteri aderenti e quelli invasi. Possono anche essere eseguite analisi parallele per fornire maggiori informazioni sulla replicazione intracellulare di Shigella all'interno delle cellule HT-29 dopo l'invasione, ad esempio, utilizzando più punti temporali per eseguire curve di crescita intracellulare. Infine, oltre a enumerare i batteri intracellulari dopo un'incubazione di 18 ore con gentamicina, i surnatanti della coltura possono essere raccolti e analizzati per la secrezione di citochine delle cellule HT-29 infette. Ad esempio, l'IL-8 è una chemochina secreta dalle cellule epiteliali che funziona in gran parte per reclutare PMN nel sito di infezione. La quantità di IL-8 secreta nei terreni di coltura delle cellule HT-29 infette può essere analizzata con un test ELISA^{IL-8 67}.

I sali biliari hanno dimostrato di essere un importante segnale di virulenza per la Shigella durante il transito attraverso il sistema gastrointestinale umano e possono essere utilizzati per integrare i mezzi di crescita batterica in questi protocolli per replicare le condizioni tipiche del tratto gastrointestinale. Naturalmente, i sali biliari vengono introdotti nel duodeno o nella parte superiore dell'intestino tenue per favorire la digestione; E nell'ileo terminale o alla fine dell'intestino tenue, il 95% dei sali biliari viene rimosso e riciclato in circolo per il deposito finale nella cistifellea⁶⁸. I sali biliari di solito hanno una concentrazione compresa tra lo 0,2% e il 2,0% (p/v) nell'intestino tenue e sono naturalmente battericidi. Tuttavia, la Shigella, insieme alla maggior parte dei batteri enterici, resiste ai sali biliari e utilizza i segnali per migliorare l'infezione⁴⁷. Diversi studi hanno documentato come l'esposizione ai sali biliari, a volte in combinazione con altri segnali dell'intestino tenue come il glucosio, influenzi la sopravvivenza della Shigella e la regolazione della virulenza prima dell'infezione. È stato dimostrato che la Shigella resiste ai sali biliari, altera l'espressione genica e forma e disperde un biofilm in condizioni che riproducono il transito dell'intestino tenue^17,69. Gli studi hanno dimostrato che questi cambiamenti si traducono in un fenotipo ipervirulento, in cui l'aderenza e l'invasione sono indotte dalla successiva infezione del colon da parte di Shigella 17,18,19,48,66. Pertanto, le condizioni sopra descritte documentano come subcoltivare la Shigella in sali biliari per imitare il transito intestinale tenue prima di eseguire i saggi di aderenza, invasione o replicazione intracellulare. La formulazione TSB specificata contiene glucosio aggiunto rispetto al tipico brodo Luria (LB)¹⁷. Pertanto, se si utilizza LB, è importante integrare anche il terreno con glucosio (0,5%-2,0% [p/v]) per considerare in modo appropriato i segnali glicemici nell'intestino tenue¹⁷. Inoltre, come accennato in precedenza, tutte le sottocolture di Shigella vengono lavate per rimuovere i sali biliari e mimare il passaggio al colon per le analisi delle infezioni.

Tradizionalmente, e come evidenziato nei risultati sopra riportati (Figura 1 e Figura 2), i test di infezione sono utili per determinare il ruolo di un particolare gene nell'infezione da Shigella . Il fenotipo dei vari mutanti, tuttavia, potrebbe non essere veramente apprezzato senza un'adeguata integrazione dei terreni di coltura batterica. Come hanno dimostrato ricerche precedenti, i sali biliari alterano significativamente l'espressione genica di S. flexneri , compresi i geni per il metabolismo centrale, i fattori di trascrizione, i trasportatori di zucchero, la resistenza ai farmaci e i geni di virulenza codificati sul cromosoma o sul plasmide di virulenza¹⁷. Questi geni forniscono informazioni su come Shigella utilizza i sali biliari come segnale per alterare l'espressione genica e prepararsi per un'eventuale infezione del colon, e le successive analisi mutazionali devono quindi essere eseguite nei terreni di crescita batterica integrati appropriati prima di esaminare gli effetti sulla virulenza nei saggi di aderenza, invasione e replicazione intracellulare. Come si vede sopra nella Figura 1 e nella Figura 2, la mutazione ΔVF non ha influenzato l'aderenza, ma ha influenzato l'invasione e la replicazione intracellulare. Poiché la mutazione ha potenziato l'invasione e la replicazione intracellulare, sono attualmente in corso esperimenti per determinare come il prodotto genico regola l'infezione. Le analisi dei mutanti servono come esempio di come possano essere studiate nuove conoscenze sulla patogenesi della Shigella , specialmente in condizioni che replicano meglio il tratto gastrointestinale umano. Adeguate analisi di complementazione sono raccomandate per convalidare i fenotipi di vari mutanti.

In combinazione, queste procedure descrivono esperimenti quantitativi che forniranno importanti informazioni sui meccanismi molecolari dell'aderenza, dell'invasione e della replicazione della Shigella all'interno delle cellule epiteliali del colon HT-29, imitando al meglio l'ambiente naturale del tratto gastrointestinale umano durante l'infezione. Studi futuri possono espandere i mutanti e le condizioni sperimentali per ottenere una migliore comprensione di come Shigella si prepara e infetta efficacemente gli ospiti umani. Nonostante decenni di ricerca, c'è ancora molto da scoprire sull'infezione da Shigella.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,22 μ m Filtro PES	Millipore-Sigma	SCGP00525	Filtro sterile in polietersulfone per la sterilizzazione di terreni fino a 50 mL
Provette per coltura da 14 mL Provette	per coltura Corning	352059	17 mm x 100 mm Provette in polipropilene con tappo
Provette coniche da 50 mL	Corning	430829	Provette da centrifuga a fondo conico in polipropilene trasparente da 50 mL con tappo a tenuta stagna
Piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti	Corning	3516	Le piastre sono trattate per un fissaggio ottimale delle cellule
Sali biliari	Sigma-Aldrich	B8756	Rapporto 1:1 tra colato e desossicolato
Colorante rosso Congo	Sigma-Aldrich	C6277	Un colorante diazo anionico a base di benzidina, purezza >85%
Vetrino della camera di conteggio delle cellule Countess	Invitrogen	C10283	Da utilizzare con il Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Un reagente organico altamente polare
Dulbecco' s Medium Eagle modificato (DMEM)	Gibco	10569-010	DMEM è integrato con glucosio elevato, piruvato di sodio, GlutaMAX e
siero fetale bovino rosso fenolo (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135	Gentamicina sterile inattivata termicamente
	Sigma-Aldrich	G3632	concentrazione stock è di 50 mg/mL
HT-29 linea cellulare	ATCC	HTB-38	Adenocarcinoma; colon-retto in origine
Pellicola di paraffina	Bemis	PM999	Pellicola sigillante da laboratorio
Piastre di Petri	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	100 mm x 15 mm Piastre di Petri per terreni solidi
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific 10010049		concentrazione 1x; pH 7,4
Select agar	Invitrogen	30391023	Una miscela di polisaccaridi estratti dalle pareti cellulari delle alghe rosse per produrre terreni di placcatura batterica
Palloni T75	Corning	430641U	Fiasche per coltura tissutale
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Un tensioattivo ed emulsionante non ionico comune
Colorante blu di tripano	Invitrogen	T10282	Un colorante per rilevare le cellule morte in coltura tissutale; solo le cellule vive possono escludere il colorante
Tripsina-EDTA	Gibco	25200-056	Reagente per la dissociazione cellulare per il mantenimento della linea cellulare e il passaggio
Brodo di soia triptico (TSB)	Sigma-Aldrich	T8907	Terreni di crescita batterica