Modello murino modificato di lesione cerebrale traumatica lieve ripetitiva che incorpora finestra cranica assottigliata e percussione fluida

Sommario

Questo protocollo presenta un modello murino modificato di lesione cerebrale traumatica lieve ripetitiva (rmTBI) indotta tramite un metodo di lesione cranica chiusa (CHI). L'approccio presenta una finestra cranica assottigliata e una percussione fluida per ridurre l'infiammazione comunemente causata dall'esposizione alle meningi, insieme a una migliore riproducibilità e accuratezza nella modellazione dell'rmTBI nei roditori.

Abstract

La lesione cerebrale traumatica lieve è un disturbo neurologico clinicamente molto eterogeneo. Modelli animali di lesione cerebrale traumatica (TBI) altamente riproducibili con patologie ben definite sono urgentemente necessari per studiare i meccanismi della neuropatologia dopo trauma cranico lieve e testare le terapie. Replicare tutte le sequele del trauma cranico nei modelli animali si è rivelata una sfida. Pertanto, la disponibilità di più modelli animali di trauma cranico è necessaria per tenere conto dei diversi aspetti e gravità osservati nei pazienti con trauma cranico. CHI è uno dei metodi più comuni per fabbricare modelli di roditori di rmTBI. Tuttavia, questo metodo è suscettibile a molti fattori, tra cui il metodo di impatto utilizzato, lo spessore e la forma dell'osso del cranio, l'apnea animale e il tipo di supporto per la testa e l'immobilizzazione utilizzati. Lo scopo di questo protocollo è dimostrare una combinazione dei metodi FPI (Fluid Covered Window) e Fluid Percussion Injury (FPI) per produrre un modello murino preciso di rmTBI associato a CHI. L'obiettivo principale di questo protocollo è ridurre al minimo i fattori che potrebbero influire sull'accuratezza e sulla coerenza della modellazione CHI e FPI, tra cui lo spessore, la forma e il supporto della testa dell'osso del cranio. Utilizzando un metodo della finestra cranica assottigliata, la potenziale infiammazione dovuta alla craniotomia e all'FPI è ridotta al minimo, ottenendo un modello murino migliorato che replica le caratteristiche cliniche osservate nei pazienti con trauma cranico lieve. I risultati dell'analisi comportamentale e istologica utilizzando la colorazione con ematossilina ed eosina (HE) suggeriscono che l'rmTBI può portare a una lesione cumulativa che produce cambiamenti sia nel comportamento che nella morfologia grossolana del cervello. Nel complesso, l'rmTBI modificato associato a CHI rappresenta uno strumento utile per i ricercatori per esplorare i meccanismi sottostanti che contribuiscono ai cambiamenti fisiopatologici focali e diffusi nell'rmTBI.

Introduzione

Il trauma cranico lieve, tra cui commozione cerebrale e sub-commozione cerebrale, rappresenta la maggior parte di tutti i casi di trauma cranico (>80% di tutti i trauma cranico)¹. Il trauma cranico lieve deriva comunemente da cadute, incidenti stradali, atti di violenza, sport di contatto (ad es. calcio, boxe, hockey) e combattimenti militari ^2,3. Un trauma cranico lieve può portare a eventi neurobiologici che influenzano le funzioni neurocomportamentali per tutta la vita del paziente e aumentano il rischio di malattie neurodegenerative ^4,5,6. I modelli animali forniscono un mezzo efficiente e controllato per studiare il trauma cranico lieve, con la speranza di migliorare ulteriormente la diagnosi e il trattamento del trauma cranico lieve. Sono stati sviluppati vari modelli per il trauma cranico lieve, come l'impatto corticale controllato (CCI), la caduta di peso (WD), la lesione da percussione del fluido (FPI) e i modelli blast-TBI ^7,8. Nessun singolo modello sperimentale può imitare l'intera complessità della patologia indotta da TBI ^9,10. L'eterogeneità di questi modelli è vantaggiosa per affrontare le diverse caratteristiche associate ai pazienti con trauma cranico lieve e studiare i corrispondenti meccanismi cellulari e molecolari. Tuttavia, ogni modello animale di trauma cranico ha i suoi limiti³, limitando le nostre attuali conoscenze riguardo al trauma cranico lieve animale e alla loro rilevanza clinica.

I modelli WD e CCI sono utilizzati per replicare condizioni cliniche come la perdita di tessuto cerebrale, l'ematoma subdurale acuto, la lesione assonale, la commozione cerebrale, la disfunzione della barriera emato-encefalica e persino il coma dopo TBI ^3,11,12. Il modello WD prevede l'induzione di danni cerebrali colpendo la dura madre o il cranio con pesi che cadono liberamente. L'impatto di un oggetto ponderato su un cranio intatto può replicare lesioni miste focali/diffuse; Tuttavia, questo metodo è associato a scarsa precisione e ripetibilità del sito della lesione, lesioni da rimbalzo e un tasso di mortalità più elevato a causa di fratture del cranio ^3,11,12. Il modello CCI prevede l'applicazione di metallo azionato ad aria per colpire direttamente la dura madre esposta. Rispetto al modello WD, il modello CCI è più accurato e riproducibile, ma non produce lesioni diffuse a causa del piccolo diametro della punta d'impatto¹¹. Durante la modellazione FPI, il tessuto cerebrale viene brevemente spostato e deformato dalla percussione. L'FPI può indurre lesioni miste focali/diffuse e replicare l'emorragia intracranica, il gonfiore cerebrale e il danno progressivo della materia grigia dopo trauma cranico. Tuttavia, l'FPI ha un alto tasso di mortalità a causa del danno del tronco encefalico e dell'apnea prolungata ^3,12. La craniotomia coinvolta nei modelli convenzionali di WD, CCI e FPI può portare a contusione corticale, lesioni emorragiche, danni alla barriera emato-encefalica, infiltrazione di cellule immunitarie, attivazione delle cellule gliali, tempo di modellazione prolungato e possibili esiti fatali ^3,12.

Il trauma cranico lieve è caratterizzato da un punteggio GCS (Glasgow coma scale, GCS) compreso tra 13 e 15². Il trauma cranico lieve può essere focale o diffuso ed è associato sia a lesioni acute, come la rottura dell'omeostasi cellulare, l'eccitotossicità, la deplezione di glucosio, la disfunzione mitocondriale, il disturbo del flusso sanguigno e il danno assonale, sia a lesioni subacute, tra cui danno assonale, neuroinfiammazione e gliosi ^2,3. Nonostante i progressi significativi nel delineare l'intricata fisiopatologia del trauma cranico, i meccanismi alla base del trauma cranico/rmTBI lieve rimangono sfuggenti e richiedono ulteriori indagini⁹. Dato che il CHI è il tipo più comune di TBI¹², questo protocollo presenta un nuovo approccio alla creazione di un modello murino di rmTBI controllato in modo più preciso utilizzando un dispositivo FPI modificato per eseguire l'impatto in una finestra cranica assottigliata¹³. Evitando lesioni indotte dalla craniotomia, lo spessore variabile del cranio e le imprecisioni indotte dalla forma e le lesioni da rimbalzo, questo approccio mira a superare i principali svantaggi associati ai modelli WD, CCI e FPI. L'applicazione dell'impatto FPI sulla finestra del cranio assottigliato è utile per valutare il danno ai vasi cerebrali dopo rmTBI e aiuta a ridurre al minimo gli alti tassi di mortalità in alcuni modelli, risultando in una maggiore somiglianza con le caratteristiche cliniche dei pazienti con trauma cranico.

Protocollo

Tutte le procedure coinvolte in questo protocollo sono state eseguite sotto l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (Zhejiang Normal University, Numero di Permesso, dw2019005) e in conformità con l'ARRIVE e la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Le specifiche tecniche sono riportate nella Tabella dei Materiali.

1. Procedura di manipolazione degli animali

1. I topi domestici in un ambiente controllato con una temperatura di 22-24 °C, umidità compresa tra il 40% e il 60%, un ciclo luce/buio di 12 ore e forniscono un accesso ad libitum all'acqua e al cibo standard per topi. Ai fini di questo esperimento, sono stati utilizzati 25 topi maschi ICR (25-30 g, 8 settimane di età).
2. Assegna casualmente i topi nel gruppo di controllo (n=12) o nel gruppo rmTBI (n=13). Per prevenire potenziali aggressioni da parte di topi fittizi nei confronti di quelli sottoposti a rmTBI, separarli in gabbie distinte.
3. Dai ai topi almeno 1 settimana per acclimatarsi all'ambiente della gabbia prima di iniziare l'esperimento. Questo periodo di acclimatazione assicura che i topi acquisiscano familiarità con l'ambiente circostante e minimizzi i potenziali impatti dello stress o dell'ansia sulle risposte fisiologiche o comportamentali durante lo studio.

2. Preparazione del dispositivo TBI

1. Fabbricare il modello rmTBI nei mouse utilizzando un dispositivo FPI modificato (vedi Tabella dei materiali; Figura 1A) ¹³. Prima di utilizzare il dispositivo FPI, ispezionare attentamente tutti i collegamenti per rilevare eventuali segni di perdite o crepe, prestando particolare attenzione alle giunzioni tra il cilindro e il tubo e tra il connettore a tre vie e il tubo. Per determinare con precisione le pressioni di impatto, è stato installato un trasduttore di pressione fino al punto di impatto sul dispositivo di lesione a percussione del fluido¹³.
2. Condurre un'attenta ispezione del dispositivo FPI per assicurarsi che il pistone si muova agevolmente all'interno del cilindro e che gli impatti possano essere condotti in modo efficace (Figura 1B). Verificare che non siano presenti bolle d'aria all'interno del sistema. Se vengono rilevate bolle d'aria, aggiungere con cautela acqua distillata al sistema utilizzando una siringa da 50 ml ed espellere le bolle d'aria spingendo rapidamente lo stelo del cilindro attraverso un connettore a 3 vie vicino e/o attraverso la siringa.
   NOTA: Il sistema FPI è costituito da acqua distillata all'interno del cilindro e dai tubi collegati. È fondamentale calibrare il dispositivo prima dell'uso per garantire l'accuratezza e l'affidabilità dei risultati.

3. Preparazione del cranio assottigliato

NOTA: La chirurgia animale e la preparazione del cranio assottigliato non devono essere eseguite in vista di altri topi. La finestra del cranio assottigliata è utile per valutare il danno ai vasi cerebrali a seguito di una procedura FPI.

1. Rispettare i requisiti del centro per animali istruendo l'operatore sperimentale a indossare un camice e una maschera sterili durante tutte le procedure di manipolazione degli animali.
2. Igienizzare il banco di lavoro del laboratorio, il dispositivo FPI, il tubo anestetico e il controspazio adiacente prima di iniziare l'esperimento utilizzando uno spray di etanolo al 70%.
3. Pesare i topi in entrambi i gruppi sham e rmTBI prima dell'intervento chirurgico e confrontare i loro pesi con quelli registrati 1 settimana prima dell'esperimento. Escludere dallo studio tutti i topi che mostrano cattive condizioni di salute come pelliccia ruvida, diarrea, perdita di peso o letargia. Inoltre, escludere i topi che pesano meno di 20 g per garantire la loro capacità di tollerare impatti ripetuti. Queste misure sono fondamentali per mantenere il benessere degli animali e garantire risultati sperimentali affidabili.
4. Anestetizzare i topi con isoflurano al 4%-5% (in ossigeno al 100% a una velocità di flusso di 1 L/min) per 3-4 minuti in una camera di induzione. Somministrare un lubrificante oftalmico (vedi Tabella dei materiali) agli occhi dell'animale per mantenere la lubrificazione durante l'intervento chirurgico. Per attenuare il dolore, somministrare buprenorfina per via sottocutanea (0,05 mg/kg) nel punto medio tra le orecchie 20 minuti prima dell'anestesia e successivamente ogni 6 ore per una durata di 24 ore. Inoltre, al termine dell'anestesia, somministrare una singola dose sottocutanea di 5 mg/kg di carprofene a ciascun animale.
5. Disinfettare la testa dopo che il mouse ha perso i riflessi di raddrizzamento e di ritiro del pedale. Taglia il pelo sulla testa del topo usando le forbici chirurgiche e usa un rasoio per rimuovere il pelo rimanente. Disinfettare il cuoio capelluto con tre applicazioni sequenziali di clorexidina al 2%, intervallate da scrub al 75% di etanolo.
6. Posizionare un cuscinetto chirurgico sterile monouso sotto l'animale e l'area circostante per garantire una corretta igiene. Praticare un'incisione di 1,5 cm utilizzando una piccola forbice chirurgica sottile lungo la linea mediana del cuoio capelluto del topo per esporre completamente il sito chirurgico (Figura 2A).
7. Fissare il mouse utilizzando le barre auricolari non terminali in un telaio stereotassico convenzionale (vedere la tabella dei materiali). Regolare la posizione della testa del mouse in un fotogramma stereotassico a un livello piatto o a un angolo leggermente inclinato in base all'area target specifica che verrà indagata. Pulisci il pelo dall'area chirurgica per evitare infiammazioni in seguito.
8. Mantenere la temperatura corporea del mouse a 37 °C utilizzando un termoforo isotermico convenzionale (vedi Tabella dei materiali).
9. Durante il processo di installazione chirurgica e dell'hub d'impatto (Luer Lock femmina), mantenere l'anestesia del topo (senza risposta al pizzicamento della punta o della coda) con un cono nasale che eroga una concentrazione continua di isoflurano del 2%, regolata da un vaporizzatore calibrato.
10. Pulire accuratamente l'area chirurgica intorno alla finestra del cranio assottigliato utilizzando un batuffolo di cotone sterile imbevuto di soluzione salina.
11. Creare una finestra del cranio assottigliata, di circa 2,5 mm di diametro e 20 μm di spessore, nella corteccia motoria frontale destra utilizzando una micropunta da microtrapano a punta piatta (vedi Tabella dei materiali, Figura 2B) e una lama microchirurgica. Localizzare il sito chirurgico a 1,5 mm anteriormente alla bregma e a 1,3-2,0 mm lateralmente alla linea mediana (Figura 2C).
    1. Per evitare che la micro-fresa penetri nel cranio durante la creazione della finestra del cranio assottigliata, inumidire a intermittenza il cranio con soluzione salina mentre si macina con la micro-perforazione.
    2. Confermare lo spessore del cranio sondando delicatamente il cranio assottigliato con la punta appiattita di un ago da siringa sottile e valutandone la morbidezza. Stimare visivamente la chiarezza dei microvasi corticali esposti per determinare lo spessore del cranio.
    3. Per verificare lo spessore del cranio, applicare soluzione fisiologica sterile sull'area assottigliata e ispezionare visivamente utilizzando un microscopio da dissezione convenzionale (vedi Tabella dei materiali). Questa tecnica può aiutare a garantire che il cranio sia stato adeguatamente assottigliato.
       NOTA: Lubrificare l'occhio del topo durante l'intera preparazione del cranio assottigliato e la procedura di modellazione rmTBI per evitare che si secchi. L'assottigliamento del cranio a meno di 15 μm comporta il rischio di un lieve trauma corticale che può provocare una lieve infiammazione corticale¹⁴.
12. Collegare un Luer Lock femmina regolato (diametro interno di 2,2 mm, creato da un mozzo dell'ago 19G, come mostrato nella Figura 2D) al sito del cranio assottigliato. Fissare il Luer Lock con colla e cemento dentale (Figura 2E).
    NOTA: Quando si utilizza la colla per fissare il Luer lock femmina all'area intorno alla finestra del cranio assottigliato, è fondamentale asciugare accuratamente l'area del cranio e impedire all'adesivo di entrare nella finestra stessa. L'adesivo all'interno della finestra può ridurre significativamente la forza d'impatto dell'FPI.

4. Procedura di modellazione rmTBI associata a CHI

1. Introdurre rmTBI utilizzando il metodo della percussione fluida laterale con un dispositivo FPI modificato come descritto in precedenza^13,15.
2. Dopo aver completato le procedure della finestra del cranio assottigliato e dell'hub d'impatto, trasferire il topo dall'apparato stereotassico alla piattaforma dell'impattatore.
3. Dati i potenziali effetti dell'anestesia sul tempo del riflesso di raddrizzamento dell'animale e sulla gravità della lesione dopo la percussione ^9,16, monitorare la profondità dell'anestesia valutando i riflessi palpebrale e di ritiro della zampa (Figura 2F).
4. Collegare il Luer Lock femmina, che è stato incollato sulla finestra del cranio assottigliato, al Luer Lock maschio all'estremità del tubo del dispositivo FPI (Figura 2G).
   NOTA: Nella modellazione rmTBI, l'anestesia indotta da isoflurano nei topi è stata prolungata a causa dell'induzione di apnea e perdita di coscienza per percussione.
5. Introdurre due TBI lievi (intervallo di 48 ore) con il dispositivo modificato. Applicare il primo impatto FPI subito dopo aver completato l'intervento chirurgico della finestra del cranio assottigliato e aver installato il Luer Lock. Somministrare l'impatto FPI solo quando il topo mostra il ritorno di un riflesso di ritiro a un pizzico della zampa in ogni occasione (Figura 2H). L'applicazione di un impatto FPI in topi profondamente anestetizzati può causare apnea prolungata e morte.
   1. Per applicare l'impatto FPI, sollevare il pendolo al grado designato lungo il goniometro sul dispositivo e rilasciare il pendolo utilizzando il controllo software^13,15. L'impatto dovrebbe raggiungere un'intensità di percussione di 2,0 ± 0,1 atm, seguendo i protocolli stabiliti utilizzati negli studi sui roditori 10,17,18. Escludere gli animali da ulteriori test se l'impatto non è stato registrato tra 1,9 e 2,1 atm o se si è verificata una frattura del cranio durante l'FPI.
   2. Per i topi finti, fissarli sull'apparecchio, ma non erogare l'impatto.
6. Dopo l'impatto, staccare immediatamente la connessione Luer Lock e trasferire i mouse su un termoforo isotermico per il recupero. Dopo che il topo ha riacquistato allerta e coscienza, riportalo nella sua gabbia di casa senza rimuovere il Luer lock femmina. Somministrare il secondo impatto FPI, allo stesso modo, 48 ore dopo.
7. Dopo l'rmTBI, rimuovere con cautela il Luer lock femmina e il cemento dentale. Sutura il cuoio capelluto con adesivo per tessuti e utilizzare una pinza piatta per pizzicare il cuoio capelluto per facilitare il processo di adesività (vedi Tabella dei materiali; Figura 2I).
8. Per prevenire l'infiammazione, l'infezione e alleviare il dolore e il disagio post-operatorio, applicare una miscela di eritromicina e unguento di diclofenac sodico in un rapporto 1:1 (vedi Tabella dei materiali) sulla ferita. Trasferisci i topi su un termoforo isotermico per il recupero.
9. Registrare la durata del riflesso raddrizzante, che inizia quando il mouse viene rimosso dall'apparato stereotassico e posizionato lateralmente sulla piattaforma di impattamento per FPI e continua fino a quando il mouse può stare in piedi in modo indipendente.
10. Dopo che il topo ha riacquistato la vigilanza e la coscienza, riportalo nella sua gabbia di casa. I topi sono in genere completamente coscienti e in grado di camminare entro 1,5 ore dopo la lesione.
11. Nei giorni successivi alla modellazione del trauma cranico, osservare i topi per vari segni, tra cui modelli di respirazione, presenza di muco intorno al naso e alla bocca e arrossamento, gonfiore, essudati o riapertura dell'area della ferita. Escludere dallo studio gli animali con uno o più dei sintomi anomali di cui sopra.
    NOTA: La pre-microiniezione di AAV-GCaMP6s consente l'osservazione dell'omeostasi neuronale del Ca2+ sottostante e dell'eccitabilità nella corteccia lesa attraverso la finestra del cranio assottigliata utilizzando la microscopia a scansione laser a due fotoni¹⁵.

5. Test del labirinto d'acqua di Morris (MWM)

NOTA: Il MWM (vedi Tabella dei materiali) è un metodo ampiamente riconosciuto per valutare l'apprendimento spaziale e i deficit di memoria nei topi dopo trauma cranico.

1. Condurre il test MWM a partire da 7 giorni dopo l'infortunio (DPI). La piscina circolare del MWM aveva un diametro di 120 cm e un'altezza di 50 cm, con la temperatura dell'acqua mantenuta a 25 °C. Separare la piscina circolare in quattro quadranti, con la piattaforma di fuga, una piattaforma rotonda con un diametro di 6 cm e un'altezza di 30 cm, sommersa 1 cm sotto la superficie dell'acqua nel quadrante nord-est.
2. Posiziona una telecamera direttamente sopra la piscina circolare per registrare la traiettoria di movimento dei topi. Contrassegnare i topi con del nastro adesivo nero sulla schiena per facilitare il riconoscimento da parte del software di acquisizione delle immagini e per la registrazione dei dati, tra cui la latenza, la distanza di nuoto e la traiettoria del movimento.
3. Metti i topi nell'acqua, rivolti verso la parete interna di ciascuno dei quattro quadranti, una volta per ogni quadrante. Una volta che i topi hanno trovato la piattaforma, lasciali riposare lì per 10 secondi. Se un topo non riesce a trovare la piattaforma entro 60 s, chiedi all'operatore di guidare il topo verso la piattaforma, lasciarlo riposare sulla piattaforma per 10 s, quindi riportare il topo nella sua gabbia di casa per riposare.
4. Ripetere per ogni mouse la prova di acquisizione 4 volte al giorno. Dopo le prove di acquisizione, su 12 DPI, condurre un esperimento di sonda spaziale di 60 s e registrare il numero di volte in cui i topi hanno attraversato l'area della piattaforma originale e la durata della permanenza del topo nel quadrante in cui si trovava la piattaforma.
5. Dopo ogni prova, asciugare rapidamente i topi con un asciugamano o posizionarli sotto una lampada riscaldante per mantenere la temperatura corporea e prevenire l'ipotermia durante la prova di acquisizione di 60 secondi da DPI 7 a DPI 11.
6. Dopo il completamento delle procedure sperimentali sopra descritte, anestetizzare i topi con pentobarbital (45 mg/kg, i.p.) a 13 DPI. Soluzione salina isotonica perfusa per via transcardiaca, seguita da perfusione con paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (pH 7,2). Recuperare il cervello per la colorazione HE convenzionale per valutare le alterazioni della morfologia corticale e ippocampale. Una descrizione dettagliata del protocollo di colorazione HE può essere trovata nelle pubblicazioni precedenti^13,15.
7. Dopo che tutti gli esperimenti sono stati completati, sopprimere il topo mediante iniezione di pentobarbital per sovradosaggio (≥100 mg/kg, i.p.) se non sono necessari campioni di topo. Prima di raccogliere i tessuti o smaltire la carcassa, monitorare il topo fino a quando non c'è battito cardiaco per almeno 60 s.

Risultati

Il protocollo descritto in questo studio delinea un metodo per indurre rmTBI attraverso una finestra cranica assottigliata, che offre una soluzione alla lesione cerebrale causata dalla preparazione della craniotomia durante la modellazione convenzionale del trauma cranico a percussione. Utilizzando questa procedura di percussione fluida modificata con il dispositivo modificato, sono state ottenute una maggiore precisione e riproducibilità dell'impatto FPI¹³. L'impattatore modificato ha la versatilità di essere utilizzato sia per la modellazione CHI che FPI, con o senza craniotomia cranica. Inoltre, la gravità della lesione viene modulata regolando i parametri della lesione, come l'angolo di caduta del pendolo d'impatto, o aggiungendo ulteriori cuscinetti in schiuma di etilene-vinil acetato a celle chiuse di varia durezza alla piastra terminale dell'asta del pistone.

Il modello rmTBI modificato offre vantaggi significativi, come la produzione di patologia focale e diffusa senza esporre il durale corticale, che riduce al minimo l'infiammazione dovuta all'esposizione meningea e/o all'FPI diretto sul parenchima. Inoltre, questo modello riduce le variazioni nello spessore e nella forma delle ossa del cranio per produrre esiti affidabili delle lesioni. Pertanto, il modello rmTBI modificato è efficace e affidabile nella simulazione di deficit neuropatologici e comportamentali correlati a sintomi post-commozione cerebrale (PCS) clinicamente rilevanti in diversi gradi di lesione. In particolare, questo modello è utile per studiare i meccanismi patologici del trauma cranico che si basano sull'accuratezza e la riproducibilità dei modelli di trauma cranico animale, in particolare per studiare i meccanismi correlati al trauma cranico lieve.

Il ramo laterale frontale dell'arteria cerebrale media del topo e la vena renale caudale¹⁹, situata sotto il cranio assottigliato, hanno permesso una chiara visualizzazione sotto la telecamera. Dopo due percussioni rmTBI, ciascuna a una pressione di circa 2,0 atm, tutti i topi hanno mostrato ematomi subdurali a 0 DPI. Sebbene l'integrità del cranio assottigliato non sembrasse essere compromessa; tuttavia, è stata osservata una riduzione del numero di microvasi insieme a cambiamenti nella morfologia della microvascolarizzazione (Figura 2H), come precedentemente riportato¹⁵. Entro 2 DPI, gli ematomi si sono in gran parte risolti. La mortalità deriva principalmente dall'impatto mentre il topo è in anestesia profonda, che può prolungare significativamente l'apnea. Valutare regolarmente la profondità dell'anestesia prima dell'impatto attraverso i riflessi di ritiro palpebrale e della zampa può ridurre sostanzialmente la mortalità. Ulteriori fattori che possono influire sui tassi di mortalità dopo la percussione di fluidi includono l'affaticamento del topo, la durezza del cranio, il sesso e l'età. In uno studio precedente che utilizzava lo stesso protocollo rmTBI, un topo C57BL/6J era morto¹⁵ volte. In questo protocollo, sono stati utilizzati solo topi ICR maschi per introdurre tutte le procedure.

Sia gli studi sull'uomo che quelli sugli animali hanno dimostrato che anche impatti ripetitivi della testa subconcussivi possono causare diffuse lesioni microstrutturali della sostanza bianca 20,21,22, che sono associate a prestazioni cognitive peggiori ^21,22. A 7-12 DPI, rmTBI può produrre disturbi nell'apprendimento spaziale e nella memoria, che sono stati esaminati utilizzando il paradigma MWM. La Figura 4 illustra i risultati ottenuti da questa valutazione.

L'analisi dell'ultimo studio di acquisizione nel MWM ha dimostrato un aumento significativo (p< 0,05) della latenza da parte dei topi rmTBI per raggiungere la piattaforma sommersa, rispetto al gruppo di controllo. Nella prova della sonda, l'analisi della percentuale di tempo trascorso nel quadrante originale della piattaforma ha dimostrato una riduzione significativa (p<0,01) nel gruppo rmTBI rispetto al gruppo di controllo, indicando un declino delle capacità di apprendimento e memoria di riferimento spaziale nei topi con rmTBI.

Il metodo qui descritto è stato utilizzato in una precedente pubblicazione¹⁵ utilizzando i topi C57BL/6J. Oltre al MWM, sono state condotte tre analisi aggiuntive, come descritto di seguito.

L'OFT è stato utilizzato per valutare le capacità di locomozione ed esplorazione misurando la velocità media di viaggio, la distanza totale percorsa e la percentuale di distanza percorsa nelle zone centrali. Condurre un test in campo aperto (OFT) a 6 DPI per valutare la locomozione, l'esplorazione e l'ansia nei topi. Il dispositivo di prova misurava 40 x 40 x 40 cm, che era diviso in 16 zone (ciascuna misurava 18 x 18 cm). Il mouse è stato posizionato al centro del dispositivo e gli è stato permesso di esplorare liberamente per 5 minuti. È stata effettuata la registrazione della distanza percorsa nelle 4 zone centrali, della distanza totale percorsa, della velocità media di spostamento e del tempo trascorso nelle zone di confine. I livelli di ansia sono stati valutati in base alla percentuale di distanza percorsa nelle zone centrali e al tempo trascorso dai roditori nelle zone limitrofe durante un periodo di osservazione di 5 minuti. A 6 DPI, l'rmTBI potrebbe non avere un impatto significativo sulle capacità locomotive generali dei topi, può indurre ansia significativa e alterare il comportamento esplorativo, come mostrato nella Figura 4¹⁵. Inoltre, il modello rmTBI modificato induce lesioni assonali diffuse, che possono essere valutate attraverso ulteriori test comportamentali, come il test di capacità cognitiva descritto in questo protocollo.

È stato dimostrato che l'RmTBI compromette il funzionamento spaziale e la memoria di riferimento nei topi, come illustrato nella Figura 5¹⁵. Queste funzioni cognitive sono state valutate utilizzando il test del labirinto a Y. Il test è stato eseguito a 8 DPI per misurare i deficit di memoria di lavoro a breve termine nei topi. Per il comportamento di alternanza spontanea: è stato utilizzato un dispositivo acrilico a labirinto a Y (20 cm di altezza, 50 cm di lunghezza e 10 cm di larghezza nella parte inferiore). Dopo aver posizionato il mouse al centro del dispositivo e averlo lasciato esplorare per 8 minuti, sono state registrate le voci del braccio. Il comportamento di alternanza spontanea è definito come l'ingresso successivo del topo nei tre bracci su insiemi di triplette. Calcolare il tasso di alternanza spontanea (%) come (serie di triplette successive / numero totale di ingressi nel braccio meno 2) x 100. Per la memoria di riferimento spaziale, durante gli 8 minuti di allenamento, chiudere in modo casuale un braccio del dispositivo Y-maze. Dopo 1 ora dall'esposizione iniziale, il topo viene reintrodotto nel labirinto con tutte e tre le braccia aperte e lasciarlo esplorare liberamente per 3 minuti. Viene registrato il tempo trascorso ad esplorare il nuovo braccio rispetto agli altri due bracci. Calcola l'indice di preferenza come il tempo trascorso nel nuovo braccio rispetto al tempo trascorso in tutti e tre i bracci.

Inoltre, suggeriamo di valutare le lesioni strutturali macroscopiche nel cervello utilizzando una semplice colorazione HE (Figura 6)¹⁵ dopo aver completato tutti i test comportamentali. Utilizzare la regione corticale sezionata coronalmente da 1 mm anteriormente al sito della lesione fino al margine posteriore della lesione e la regione ippocampale sezionata coronalmente nella tipica zona a forma di mezzaluna (Bregma: da -1,7 a -2,2 mm). Il conteggio dei neuroni in ogni vetrino da sei campi randomizzati utilizzando una griglia oculare (ingrandimento 400x) e la media del numero neuronale hanno fornito la densità numerica per campo visivo (densità numerica). È stato riscontrato che le regioni cerebrali colpite da rmTBI mostrano vari gradi di lesioni neuronali¹⁵. In particolare, la corteccia motoria ha dimostrato un'estensione più potente e varia di tali lesioni rispetto all'ippocampo. La colorazione dell'HE ha mostrato un notevole spostamento verso la morfologia picnotica dei neuroni normali (Figura 6A, B, E, F). Inoltre, è stato osservato che la matrice extracellulare si allenta specificamente nella regione della lesione (Figura 6F). Oltre alle aree allentate dalla matrice osservate, i topi rmTBI hanno anche mostrato un aumento significativo della colorazione ipercromica, vista come un colore rosso più scuro, in un numero significativo di neuroni subgranulari nel giro dentato e in alcuni neuroni corticali e CA1. Curiosamente, questi modelli di colorazione non presentavano alcun segno di restringimento citoplasmatico o nucleo picnotico (Figura 6C, D, G, H, K) ¹⁵. I metodi di colorazione comportamentale (ad eccezione del test WMM) e HE sopra menzionati sono stati dettagliati in una recente pubblicazione, che ha introdotto il modello rmTBI modificato¹⁵.

Figura 1: Il dispositivo FPI modificato e lo screenshot del software. (A) Il dispositivo FPI modificato. (B) Lo screenshot mostra la forma d'onda della pressione FPI e la misurazione e l'esportazione automatiche dei parametri della pressione di impatto in tempo reale come il tempo di salita, il tempo di caduta e la durata della mezza larghezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Il modello murino modificato di rmTBI nei topi ICR. (A) Viene praticata un'incisione sulla linea mediana per esporre l'area chirurgica. (B) Una finestra cranica assottigliata è stata fabbricata sulla corteccia motoria. La chiarezza dei microvasi corticali esposti viene utilizzata per determinare lo spessore del cranio. (C) Lo spessore del cranio può anche essere verificato sondando delicatamente il cranio assottigliato con la punta appiattita di un ago da siringa sottile e valutando la sua morbidezza. (D) La femmina di Luer Lock era incollata alla finestra del cranio assottigliato. (E) Il Luer Lock femmina attaccato è stato fissato applicando il cemento dentale. (F) La profondità dell'anestesia è stata monitorata controllando i riflessi palpebrale e di ritiro della zampa. (G) L'impatto FPI è stato erogato dopo il ritorno di un riflesso di ritiro a un pizzico della zampa. (H) Immagine post-rmTBI della finestra del cranio assottigliato a 0 DPI. (I) Il cuoio capelluto è stato suturato con adesivo tissutale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Gli effetti dell'rmTBI sull'apprendimento di riferimento spaziale e sulla memoria nei topi ICR. (A) La traccia di navigazione per i topi durante l'ultima prova di acquisizione registrata a 11 DPI, (B) il percorso della sonda spaziale nella prova con sonda registrata a 12 DPI e (C) il tempo di fuga impiegato dai topi per localizzare la piattaforma durante l'ultima prova di acquisizione. I risultati hanno rivelato che il gruppo rmTBI ha impiegato molto più tempo per raggiungere la piattaforma nascosta rispetto al gruppo di controllo (p<0,05). (D) La percentuale di tempo che i topi hanno trascorso nel quadrante originale della piattaforma rispetto al tempo totale di navigazione durante la prova della sonda era significativamente inferiore nel gruppo rmTBI rispetto al gruppo di controllo (p<0,01). n=8. *p<0,05, **p<0,01 rispetto al controllo mediante t-test non accoppiato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Gli effetti dell'rmTBI sulla locomozione, l'esplorazione e l'ansia nei topi C57BL/6J. (A) Tracce rappresentative del controllo e del movimento dei topi rmTBI durante 5 minuti di OFT. (B-E) I dati riepilogativi mostrano rispettivamente la distanza percorsa nelle zone centrali, la distanza totale percorsa, la velocità media di viaggio e il tempo trascorso nelle zone periferiche. Controllo, n=13; rmTBI, n =12. p<. 01 vs. controllo mediante test t non accoppiato. Questa cifra è stata modificata da¹⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Gli effetti dell'rmTBI sul lavoro spaziale e sulla memoria di riferimento nei topi C57BL/6J. (A, B) Tracce rappresentative del controllo e del movimento dei topi rmTBI durante il lavoro spaziale e le valutazioni della memoria di riferimento nel labirinto a Y. Il test di alternanza spontanea del labirinto a Y è un metodo comunemente usato per valutare la memoria a breve termine nei modelli di roditori¹⁵. (C) Riepilogo dei tassi di alternanza spontanea dei topi di controllo e rmTBI durante la valutazione del lavoro spaziale. I roditori di solito preferiscono esplorare un nuovo braccio del labirinto piuttosto che rivisitarne uno che hanno già esplorato. Un indice di preferenza viene calcolato in base al tempo che i roditori trascorrono nel nuovo braccio rispetto al tempo trascorso in tutti e tre i bracci, e questo indice viene quindi analizzato. (D) Riepilogo dell'indice di preferenza dei topi di controllo e rmTBI durante la valutazione del lavoro spaziale. Controllo, n=13; rmTBI, n=12. p<. 01 vs. controllo mediante test t non accoppiato. Questa cifra è stata modificata da¹⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Confronto della colorazione HE della corteccia motoria lesionata omolaterale e della sottoregione del giro dentato dell'ippocampo tra controllo e rmTBI nei topi C57BL/6J. (A, B) Corteccia motoria normale; e (C, D) la regione ippocampale dei topi di controllo in diversi ingrandimenti. (E, F) Corteccia motoria danneggiata e regioni ippocampali (G, H) di topi rmTBI. I neuroni ipercromici nella corteccia e nel CA1 possono essere stati leggermente influenzati dalla preparazione dell'intervento chirurgico o dal rmTBI sostenuto; tuttavia, neuroni ipocromici (possibilmente con lesioni intermedie) e picnotici (neuroni apoptotici) sono stati osservati nella corteccia motoria dei topi rmTBI rispetto ai neuroni normali nei topi di controllo. Queste caratteristiche dell'apoptosi neuronale includevano il restringimento del citoplasma neuronale e del nucleo, accompagnato da apparente vacuolizzazione. In particolare, la linea bianca di demarcazione in (E) rappresenta il confine tra la lesione e il tessuto circostante. Inoltre, i neuroni ipercromici nella sottoregione DG (H) si riferivano probabilmente a neuroni granulari immaturi e maturi di nuova generazione. I grafici a barre sottostanti mostrano la distribuzione dei neuroni normali e affetti da rmTBI nelle sottoregioni (I) della corteccia motoria e dell'ippocampo (J) CA1 e (K) DG. Controllo, n=13; rmTBI, n=12, ***p<. 001 vs. controllo mediante test t non accoppiato. Questa cifra è stata modificata da¹⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il trauma cranico si riferisce a due tipi primari, chiusi e penetranti, con quest'ultimo caratterizzato da una rottura del cranio e della dura madre. I dati clinici suggeriscono che i CHI sono più diffusi delle lesioni penetranti ^1,2. Dopo un singolo trauma cranico lieve, la maggior parte dei pazienti manifesta sintomi di PCS che in genere si risolvono in un breve periodo di tempo e c'è controversia riguardo alla percentuale di pazienti il cui PCS si sviluppa in sequele a lungo termine^23,24. Di conseguenza, i ricercatori hanno spostato la loro attenzione su modelli CHI ripetitivi per comprendere meglio gli effetti cumulativi delle commozioni cerebrali multiple²⁵, che si verificano comunemente in cadute, incidenti stradali e sport di contatto. Questi impatti ripetuti possono portare a effetti più gravi e a lungo termine^26,27. Utilizzando modelli CHI ripetitivi, i ricercatori possono esplorare i potenziali effetti additivi o sinergici di commozioni cerebrali multiple e ottenere una migliore comprensione dei meccanismi sottostanti che contribuiscono alla PCS. Tali modelli possono facilitare lo sviluppo di interventi terapeutici mirati per mitigare le conseguenze a lungo termine di impatti ripetuti alla testa.

Sebbene alcuni modelli CHI tentino di simulare sia il singolo focale che l'rmTBI incorporando sia le forze lineari che quelle rotazionali, questi modelli possono causare lesioni da rimbalzo e imprecisioni nella gravità della lesione a causa di fattori quali la frattura del cranio, la morfologia e lo spessore del cranio, l'apnea animale estesa¹⁰ e la variabilità dei parametri di input meccanico, in particolare quando è incorporato il movimento rotazionale della testa⁹. I metodi di impatto e caduta del peso controllati da pistoni sono comunemente usati per indurre rmTBI nei modelli animali di CHI²⁵. L'impatto controllato da pistone consente un'impostazione precisa e regolabile dei parametri di impatto attraverso l'uso di dispositivi di impatto elettromagnetici o pneumatici, consentendo così un'elevata riproducibilità dell'impatto. Tuttavia, l'uso dell'impatto controllato da pistone, sia sulla corteccia esposta come nel CCI che sul cranio chiuso, richiede ancora una rigorosa immobilizzazione della testa dell'animale in un telaio stereotassico durante l'impatto. Al contrario, i metodi di caduta del peso richiedono materiali semplici ed economici che siano facili da configurare, ma il compromesso è una variabilità piuttosto elevata nella gravità della lesione²⁵.

Il modello FPI induce tipicamente lesioni focali e diffuse miste, consentendo la fabbricazione di TBI di varia gravità. Nonostante i suoi vantaggi, il modello FPI presenta anche potenziali limitazioni. Come il modello CCI, l'FPI richiede ancora la craniotomia, una procedura chirurgica che può indurre infiammazione nel tessuto cerebrale¹⁷. Inoltre, anche un FPI lieve penetra frequentemente nella dura madre a profondità variabili, il che può introdurre confusione nell'interpretazione dei dati. Pertanto, i modelli CCI e FPI hanno limitazioni nel replicare le caratteristiche cliniche osservate nei pazienti con trauma cranico lieve⁹. Quindi, presentiamo un protocollo che combina la finestra del cranio assottigliato e i metodi FPI, che possono essere utilizzati per produrre un modello murino più preciso di rmTBI associato a CHI. L'obiettivo di questo protocollo è quello di rispecchiare da vicino le caratteristiche cliniche dei pazienti con trauma cranico lieve. Un modello altamente riproducibile sarebbe uno strumento prezioso per studiare i meccanismi alla base della fisiopatologia del trauma cranico lieve e valutare potenziali interventi terapeutici.

I risultati della nostra ricerca sull'rmTBI sono in linea con le precedenti pubblicazioni che utilizzavano finestre craniche assottigliate per indagini sul trauma cranico lieve^28,29. Ad esempio, Ren et al. hanno creato una finestra del cranio assottigliata con uno spessore di circa 30 μm nella corteccia di associazione parietale sinistra, inducendo un trauma cranico lieve premendo delicatamente la finestra utilizzando un'estremità smussata con un diametro di 1 mm da uno strumento stereotassico chirurgico²⁹. Il loro studio ha mostrato una notevole espansione della morte cellulare e dell'espressione delle specie ossidative reattive (ROS) nella corteccia danneggiata²⁹. Per studiare l'rmTBI, Nguyen et al. hanno applicato tre CCI con una punta dell'impattatore modificata (punta rotonda in silicone di 3 mm di diametro di 1,5 mm di spessore) su una finestra cranica assottigliata di topo (20-40 μm di spessore) nella corteccia di associazione parietale²⁸. Per proteggere e mantenere la trasparenza dell'area del cranio assottigliato per l'imaging a lungo termine, hanno coperto la finestra del cranio assottigliato con un sottile strato di colla cianoacrilica. Le tre CCI sono state eseguite una volta alla settimana per 3 settimane, con parametri di impatto di 4 m/s di velocità e 2 mm di profondità. Come risultato delle tre CCI, i topi hanno mostrato un'evidente astrogliosi e attivazione microgliale²⁸. Dato che l'uso della finestra cranica assottigliata come modello per TBI/rmTBI lieve è relativamente recente, sono necessarie ulteriori ricerche per esaminare la relazione tra gravità/progressione della lesione e diverse tecniche di impatto. Ad esempio, in uno studio precedente, siamo stati in grado di osservare evidenti cambiamenti nella morfologia cellulare dopo due FPI che sono stati somministrati con un intervallo di 2 giorni¹⁵. Nel frattempo, in altri studi, una singola leggera compressione della finestra del cranio assottigliato ha indotto un lieve trauma cranico con evidente morte cellulare ed espressione di specie ossidative reattive²⁹, e tre CCI settimanali hanno provocato una robusta astrogliosi e attivazione microgliale²⁸.

Diversi passaggi devono essere eseguiti con cautela per fabbricare un modello di lesione coerente utilizzando il metodo descritto. Durante l'operazione della finestra del cranio assottigliato, in base a diverse aree target (ad esempio, ci siamo concentrati sulla corteccia motoria), la testa del topo dovrebbe essere fissata in un frame stereotassico a livello orizzontale o con un leggero angolo laterale verso il lato opposto della finestra del cranio assottigliato in questo protocollo. Questo posizionamento specifico può facilitare la creazione della finestra cranica assottigliata nell'area corrispondente alla corteccia motoria. Posizionare con precisione le barre auricolari è uno degli aspetti più impegnativi di questa procedura e può richiedere tempo e pratica per essere padroneggiata. Prima di tentare l'operazione della finestra del cranio assottigliato o di indurre il CHI, è essenziale assicurarsi che il cranio sia a livello. Se il cranio non è posizionato correttamente, la testa deve essere regolata di conseguenza. A causa della forma e dello spessore irregolari dell'osso del cranio, la crescita del cranio è variabile anche all'interno di un osso specifico³⁰, è fondamentale regolare il posizionamento della testa prima di intraprendere la procedura della finestra cranica assottigliata o CHI. In caso contrario, aumenta il rischio di fratture del cranio, che possono influire in modo significativo sulla precisione e l'affidabilità del CHI. Per una guida più completa sulla procedura della finestra del cranio assottigliato, fare riferimento al protocollo delineato da Guang et ^al.14.

La scelta dell'area di modellazione del trauma cranico varia tra i ricercatori in base al loro obiettivo di ricerca. Data la significativa variabilità nella posizione effettiva della lesione nel CHI, nonostante la maggior parte degli studi riporti che il sito di impatto sia situato centralmente tra bregma e lambda, si raccomanda di variare la posizione di impatto in futuri studi sperimentali, come osservato in una revisione dei modelli animali di CHI²⁵. Per convalidare il modello modificato di lesione cranica assottigliata CHI, si consiglia di iniziare con la corteccia motoria, come delineato in questo protocollo. L'rmTBI può causare lesioni alla corteccia motoria focale, che possono essere facilmente valutate utilizzando approcci di valutazione locomotoria come l'OFT in questo protocollo. L'incisione praticata durante questa procedura richiede tempo per guarire e questo può potenzialmente innescare una risposta immunitaria periferica, introducendo infine variabilità nell'esperimento. Per ridurre al minimo il rischio di infiammazione, infezione e dolore e disagio post-chirurgico, si consiglia di applicare sulla ferita un unguento topico contenente una combinazione di eritromicina e diclofenac sodico. Questo approccio ha dimostrato di essere efficace nel ridurre l'infiammazione e il dolore associati alle procedure chirurgiche negli animali.

Il protocollo di percussione fluida a base di cranio assottigliato è un metodo promettente per modellare l'rmTBI nei roditori poiché riduce l'infiammazione comunemente causata dall'esposizione delle meningi all'FPI. Questa tecnica, presente nella finestra del cranio assottigliato, può generare efficacemente PCS clinicamente rilevanti a vari livelli, fornendo una potenziale alternativa per i ricercatori che studiano rmTBI. Inoltre, la finestra del cranio assottigliata facilita l'osservazione dell'omeostasi del Ca²⁺ e dell'ipereccitabilità neuronale nella corteccia in vivo¹⁵. L'uso di questa tecnica può migliorare la nostra comprensione dei meccanismi alla base della progressione del PCS a breve/moderato/lungo termine, migliorando così la capacità di prevedere il suo sviluppo e sviluppare trattamenti terapeutici più efficaci.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
75% di etanolo	Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd.
Buprenorfina cloridrato	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd	H12020272	Soluzione, Analgesico
Carprofene	Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd	53716-49-7	Polvere, Analgesico
Clorexidina digluconato	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.	18472-51-0	Soluzione acquosa al 19% -21%,
kit di cemento dentale antimicrobico e solvente	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	20220405, 3#	Polvere ricostituita in solvente corrispondente
Microscopio da dissezione	Shenzhen RWD Life Science Inc.	77019
Unguento all'eritromicina	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co., Ltd.	220412	Fonte
luce fredda in fibra ottica	Shenzhen RWD Life Science Inc.	F-150C
Punta per microtrapano a punta piatta	Scienze della vita di Shenzhen RWD Inc.	HM31008	2 mm, acciaio
FPI dispositivo software	Jiaxing Bocom Biotech Inc.	Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR topi	Jinhua Laboratory Animal Center	Stock#2023091	25 topi maschi, 25-30g, 8 settimane
di età Isoflurane	Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd.
Termoforo isotermico	Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd.
Luer Loc hup			Realizzato su misura utilizzando un mozzo ad ago 19G
Micro trapano a cranio portatile	Shenzhen RWD Life Science Inc.	78001	Max: 38.000 giri/min
Dispositivo FPI modificato	Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Labirinto d'acqua Morris	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63031	Valutare l'apprendimento spaziale del mouse e le capacità di memoria
Campo aperto	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63008	Valutare la locomozione del topo e l'ansia
Lubrificante oftalmico	Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd.
Unguento al diclofenac di sodio	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co., Ltd.	221207	farmaco antinfiammatorio non steroideo
Sistema di anestesia per piccoli animali-Enhanced	Scienze della vita di Shenzhen RWD Inc.	R530IP
Sistema di video-localizzazione intelligente	Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, USA	V3.0	Tracciamento e analisi degli animali
Telaio stereotassico	Scienze della vita di Shenzhen RWD Inc.	68043
Adesivo tissutale Vetbond	3M, St Paul, MN, USA	202402AX	Sutura la ferita dell'animale
Labirinto a Y	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63005	Valutazione della memoria di lavoro spaziale del mouse