Descriviamo un protocollo per l'estrazione di nuclei di alta qualità da cellule staminali stromali/endoteliali e ematiche derivate da cellule staminali pluripotenti indotte crioconservate per supportare le analisi di sequenziamento di nuova generazione a singolo nucleo. La produzione di nuclei intatti di alta qualità è fondamentale per gli esperimenti multiomici, ma può essere una barriera all'ingresso nel campo per alcuni laboratori.
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Articolo metodologico
Isolamento nucleare da cellule del sangue derivate in vitro crioconservate
In questo articolo
Sommario
Abstract
I modelli basati su cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono piattaforme eccellenti per comprendere lo sviluppo del sangue e le cellule ematiche derivate da iPSC hanno utilità traslazionale come reagenti per test clinici e terapie cellulari trasfusibili. L'avvento e l'espansione dell'analisi multiomica, che include, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo (snRNAseq) e il saggio per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (snATACseq), offrono il potenziale per rivoluzionare la nostra comprensione dello sviluppo cellulare. Ciò include la biologia dello sviluppo utilizzando modelli ematopoietici in vitro . Tuttavia, può essere tecnicamente difficile isolare nuclei intatti da cellule coltivate o primarie. Diversi tipi di cellule spesso richiedono preparazioni nucleari su misura a seconda della rigidità e del contenuto cellulare. Queste difficoltà tecniche possono limitare la qualità dei dati e fungere da barriera per i ricercatori interessati a perseguire studi multiomici. La crioconservazione dei campioni è spesso necessaria a causa delle limitazioni con la raccolta e/o l'elaborazione delle cellule e i campioni congelati possono presentare ulteriori sfide tecniche per l'isolamento nucleare intatto. In questo manoscritto, forniamo un metodo dettagliato per isolare nuclei di alta qualità da cellule derivate da iPSC in diverse fasi dello sviluppo ematopoietico in vitro per l'uso in flussi di lavoro multiomici a nucleo singolo. Abbiamo focalizzato lo sviluppo del metodo sull'isolamento di nuclei da cellule stromali/endoteliali aderenti derivate da iPSC e da cellule progenitrici ematopoietiche non aderenti, in quanto queste rappresentano tipi cellulari molto diversi per quanto riguarda l'identità strutturale e cellulare. Le fasi di risoluzione dei problemi descritte hanno limitato l'aggregazione nucleare e i detriti, consentendo il recupero di nuclei in quantità e qualità sufficienti per le analisi a valle. Metodi simili possono essere adattati per isolare nuclei da altri tipi di cellule crioconservate.
Introduzione
L'emopoiesi è un sistema di sviluppo relativamente ben caratterizzato, ma l'incapacità di ricapitolare la formazione delle cellule del sangue in vitro dimostra una comprensione incompleta dei fattori correlati. I modelli di emopoiesi basati su cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) possono aiutare a chiarire i fattori chiave dello sviluppo e la biologia correlata. Il sistema iPSC offre anche un eccellente modello per studiare le malattie del sangue e le cellule del sangue basate su iPSC sono state sviluppate per produrre reagenti traslazionali e terapeuticamente rilevanti 1,2,3,4. Gli studi su singole cellule sono stati ampiamente utilizzati per studiare la biologia dello sviluppo basata sulle iPSC, compresi i tipi di cellule prodotte durante l'emopoiesi5. Rispetto al sequenziamento dell'RNA di massa, che non può dedurre relazioni tra sottopopolazioni cellulari6, le modalità a singola cellula consentono valutazioni dell'eterogeneità cellulare e possono facilitare l'identificazione e la caratterizzazione dello sviluppo cellulare 6,7.
La formazione di cellule ematopoietiche da iPSC richiede una differenziazione sequenziale attraverso striature primitive, mesoderma e stati endoteliali per formare cellule endoteliali emogeniche. Le cellule endoteliali emogeniche sono precursori diretti delle cellule staminali ematopoietiche e delle cellule progenitrici8. Questi tipi di cellule hanno proprietà morfologiche e cellulari notevolmente diverse. C'è una comprensione limitata del panorama epigenetico e delle dinamiche di sviluppo dei modelli cellulari ematopoietici derivati in vitro, sebbene questa sia una conoscenza essenziale per sbloccare il pieno potenziale terapeutico del sistema iPSC. In molti casi, solo le modalità di analisi di singole cellule consentono l'identificazione di popolazioni cellulari, attività trascrizionali, paesaggi della cromatina e meccanismi regolatori che governano lo sviluppo tra preparazioni cellulari eterogenee.
Due metodologie, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNAseq) e il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo (snRNAseq), possono rivelare intuizioni trascrizionali a livello di singola cellula9. Uno dei fattori principali che determinano la validità e l'affidabilità dei dati è la necessità senza compromessi di campioni che soddisfino rigorosi criteri di qualità. Questi includono requisiti precisi per la densità cellulare/nucleare, la vitalità ottimale e l'aggregazione minima. La preparazione di singoli nuclei può essere tecnicamente impegnativa. Ci possono essere ulteriori sfide associate all'uso di celle precedentemente crioconservate.
Notiamo quattro importanti potenziali limitazioni agli approcci standard di scRNAseq. In primo luogo, i protocolli standard per la generazione di sospensioni cellulari spesso fanno riferimento a preparati da cellule o tessuti freschi, piuttosto che a quelli recuperati dopo la crioconservazione10. Ciò può ridurre l'utilità di risorse potenzialmente preziose. In secondo luogo, l'efficienza di dissociazione dei diversi tipi di cellule è variabile. Ad esempio, molti tipi di cellule immunitarie subiscono la dissociazione con relativa facilità. Al contrario, le cellule stromali, i fibroblasti e le cellule endoteliali, che sono normalmente incorporate nella matrice extracellulare e nella membrana basale, hanno proprietà cellulari uniche che possono complicare l'isolamento dei nuclei11,12. Queste proprietà possono richiedere protocolli di dissociazione aggressivi, che possono mettere a repentaglio l'integrità strutturale delle popolazioni cellulari più delicate. In terzo luogo, alcune cellule (ad esempio, i megacariociti) possono superare i 100 μm di diametro e porre difficoltà a diverse piattaforme commerciali a singola cellula esistenti13. Inoltre, una manipolazione impropria può portare a danni cellulari e risposte allo stress durante le fasi iniziali dell'isolamento cellulare, che coinvolgono l'idrolisi enzimatica e la dissociazione meccanica, che possono influire sui profili di espressione genica11,14.
Per questi e altri motivi, un approccio a nucleo singolo può essere un'alternativa preferibile ai metodi a singola cellula15. Data la stabilità superiore della membrana nucleare rispetto alla membrana cellulare, l'involucro nucleare può rimanere intatto anche dopo la crioconservazione tissutale16. Ciò può facilitare l'estrazione nucleare e migliorare la diversità dei tipi di campioni adatti alle modalità di sequenziamento di nuova generazione. In secondo luogo, i nuclei mostrano un'elevata resistenza alle perturbazioni meccaniche e tendono a manifestare meno spostamenti trascrizionali durante la dissociazione14. Pertanto, i nuclei possono fornire una maggiore stabilità dell'RNA e profili trascrizionali più riproducibili. Un terzo vantaggio degno di nota dei metodi a singolo nucleo è l'assenza di vincoli di dimensione cellulare e l'applicabilità per cellule più grandi, come i cardiomiociti o i megacariociti12. In quarto luogo, i nuclei fungono da substrati adatti per le analisi multiomiche, che offrono informazioni estese dall'analisi integrata dell'espressione genica, delle regioni della cromatina accessibili e di altri parametri17, consentendo una comprensione più profonda dell'eterogeneità cellulare, dello sviluppo e degli stati funzionali18.
Profilando le iPSC durante lo sviluppo ematopoietico, gli approcci multiomici possono aiutare a definire i processi di sviluppo in modelli di malattia normali o patologici. Il confronto tra cellule derivate da iPSC e cellule o tessuti primari può anche fornire una valutazione della fedeltà del modello di iPSC alla biologia in vivo , facilitando il miglioramento del modello di iPSC e la scoperta di nuove popolazioni cellulari e fattori che guidano la formazione del sangue.
Sebbene molti gruppi abbiano affrontato con successo l'isolamento nucleare e la conseguente analisi di sequenziamento di nuova generazione, l'isolamento di nuclei di alta qualità rimane un ostacolo per alcuni laboratori interessati a eseguire analisi basate su singoli nuclei. Questo manoscritto descrive in dettaglio un protocollo per isolare nuclei di qualità da cellule derivate da iPSC precedentemente crioconservate. Ci siamo concentrati sulle cellule stromali/endoteliali aderenti e sulle cellule progenitrici ematopoietiche non aderenti, poiché queste rappresentano tipi di cellule molto diversi per quanto riguarda la struttura e il contenuto che richiedono modifiche e risoluzione dei problemi su misura per aumentare il recupero di nuclei di alta qualità suscettibili per il sequenziamento di nuova generazione o altri esperimenti.
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Protocollo
1. Crioconservazione delle cellule
- Congelare >1 x 106 cellule isolate derivate da iPSC per mL in 1 mL di FBS al 90% e DMSO al 10%. Mettere i crioviali in un contenitore di congelamento a -80°C per ridurre la velocità di congelamento e ottimizzare il recupero delle cellule vitali (Tabella dei materiali). Prevedere una notevole perdita cellulare, che può variare in base alle condizioni di coltura e all'identità cellulare.
- Passare da -80 °C allo stoccaggio di azoto liquido entro 24 ore.
2. Scongelamento delle cellule
- Recuperare il crioviale dalla conservazione di azoto liquido e scongelarlo in un bagno d'acqua a 37 °C per 2 minuti. Togliere dal bagnomaria mentre sono ancora visibili piccoli cristalli di ghiaccio.
- Trasferire le cellule dal crioviale in una provetta vuota da 15 mL e aggiungere lentamente 10 mL di terreno preriscaldato (RPMI 1640 + 10% FBS) mescolando accuratamente. Centrifugare a 400 x g per 3 min a 25 °C.
- Aspirare il surnatante e ricostituire in 1 mL di DPBS integrato con FBS al 2% e 1 mM di CaCl2 (Tabella dei materiali). Miscelare accuratamente pipettando 3 volte con una micropipetta da 1000 μl. Trasferire in una provetta a fondo tondo in polistirene da 5 mL.
3. Rimozione delle cellule morte
- Aggiungere 50 μL di cocktail per la rimozione delle cellule morte (Tabella dei materiali) a 1 mL di sospensione cellulare. Aggiungere 50 μl di cocktail di selezione di biotina alla miscela cellulare. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Questi passaggi marcano le cellule morte dell'annessina V+ contenute nella sospensione cellulare con la biotina.
- Vorticare vigorosamente per 30 s, le perle di destrano progettate per l'esaurimento dei tipi di cellule indesiderate etichettate con biotina (Tabella dei materiali). Aggiungere 100 μl di perle di destrano alla sospensione cellulare e mescolare pipettando delicatamente su e giù 2 volte con una micropipetta da 1000 μl (Tabella dei materiali).
- Aggiungere 1,3 mL di DPBS contenente il 2% di FBS e 1 mM di CaCl2 alla sospensione cellulare e mescolare pipettando delicatamente su e giù 2 volte con una micropipetta da 1000 μL. Posizionare la provetta nel magnete (Tabella dei materiali) e incubare a temperatura ambiente per 3 minuti.
- Capovolgere il magnete e la provetta per versare la sospensione di cellule vive arricchita in una nuova provetta conica da 15 mL. Centrifugare a 400 x g per 3 min a 4°C. Rimuovere la maggior parte del surnatante e risospendere in 1 mL di DPBS + 0,04% BSA. Miscelare delicatamente pipettando 3 volte con una micropipetta da 1000 μl.
4. Isolamento dei nuclei
- Centrifugare la sospensione di cellule vive a 460 x g per 5 minuti a 4 °C e quindi aspirare il surnatante, garantendo l'assenza di interruzioni del pellet cellulare.
- Aggiungere 100 μl di tampone di lisi 0,5x appena preparato e raffreddato su ghiaccio (Tabella 1) e mescolare delicatamente pipettando 10x con una micropipetta da 100 μl. Incubare 3 minuti con ghiaccio.
- Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio refrigerato (Tabella 2) alla provetta senza mescolare. Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 °C.
5. Lavaggio e valutazione dei nuclei
- Aspirare il surnatante e aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio refrigerato per sciogliere il pellet intatto rimanente senza mescolare. Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 °C. Rimuovere tutto il surnatante senza interrompere il pellet dei nuclei.
- Risospendere in 120 μl di tampone nuclei diluiti raffreddato (Tabella 3). Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro cellulare da 40 μm (Tabella dei materiali).
- Colorare con blu di tripano allo 0,4% e valutare visivamente la qualità dei nuclei isolati al microscopio 10x (Tabella dei materiali).
6. Elaborazione di nuclei isolati
- Mantieni i nuclei sul ghiaccio. Procedere immediatamente a un'ulteriore elaborazione, poiché nel tempo può verificarsi aggregazione nucleare e richiedere ulteriori fasi di filtrazione.
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Risultati
Abbiamo impiegato il suddetto protocollo per estrarre nuclei da cellule stromali/endoteliali aderenti derivate da iPSC crioconservate e da cellule progenitrici ematopoietiche non aderenti (galleggianti). Una rappresentazione schematica dettagliata della procedura di isolamento nucleare si trova nella Figura 1.
Per l'esame morfologico, i nuclei isolati sono stati colorati con blu di tripano e visualizzati al microscopio. L'esame morfologico nucleare è fondamentale ...
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Discussione
Passaggi critici all'interno del protocollo
L'isolamento di nuclei di alta qualità è essenziale per l'implementazione di successo delle attuali modalità di sequenziamento di nuova generazione basate su un singolo nucleo, che sono in rapida evoluzione. Riconoscendo le barriere esistenti per i laboratori interessati a questi approcci, in particolare per i campioni crioconservati, la nostra intenzione era quella di creare una tecnica di isolamento nucleare su misura per le cellule precedentemente congela...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Jason Hatakeyama (10x Genomics) e Diana Slater (Children's Hospital of Philadelphia Center for Applied Genomics) per indicazioni e suggerimenti. Questo studio è stato supportato dal National Institutes of Health (HL156052 a CST).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti per colture cellulari dimetilsolfossido > | |||
| (DMSO) | di Sigma | ||
| Dulbco (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| Siero fetale bovino (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| staminali pluripotenti > | |||
| indotte | forti N/A | N/A | Le iPSC utilizzate in questo studio sono state ottenute attraverso i reagenti CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility |
| Cell Staining | |||
| Soluzione di blu di tripano | Corning | 25900CI | |
| forte>Reagenti per la rimozione delle cellule morte | |||
| Cloruro di calcio (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| EasySep Kit per la rimozione delle cellule morte (annessina V) | StemCell Technologies | 17899 | Questo kit è progettato per l'esaurimento dei tipi di cellule indesiderate marcate con biotina. Il kit include il cocktail per la rimozione delle cellule morte (annessina V), il cocktail per la selezione della biotina e le perle di destrano. Questo kit prende di mira la fosfatidilserina sul foglietto esterno della membrana cellulare delle cellule apoptotiche utilizzando l'annessina V. Le cellule indesiderate vengono marcate con annessina V, anticorpi biotinilati e particelle magnetiche e separate senza colonne utilizzando un magnete EasySep. Le celle desiderate vengono semplicemente versate in una nuova provetta. |
| Materiali | |||
| 10 µ l Micropipette | Reparti di scienze | 470231606 | |
| 100 µ l Micropipette | Reparti di scienze | 470231598 | |
| 1000 µ l Punta universale estesa | Oxford Lab Products | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 &; l Micropipette | Wards science | 470231602 | |
| 2,0 ml Fiale criogeniche | Corning | 431386 | |
| 20 &; l Micropipette | Wards scienze | 470231608 | |
| 200 µ l Micropipette | Wards science | 470231600 | |
| 5ml Polistirene Tubo a Fondo Tondo | Falcon | 352063 | |
| Corning DeckWork 0.1-10 &; l Stazione di punta per pipette | Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 µ l Stazione di punta per pipette | Corning | 4144 | |
| Camera di conteggio | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 &; micro; m | Bel-Art | H136800040 | |
| Magnete | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1° C Contenitore di congelamento | Nalgene | 51000001 | |
| Nuclei Reagenti di isolamento | I reagenti di isolamento dei nuclei includono Lysis Buffer, Tampone di lavaggio e tampone nuclei diluiti e tampone di diluizione della lisi. La costituzione di questi buffer è riportata nelle Tabelle 1, 2 e 3. Il nostro metodo di isolamento dei nuclei ha migliorato l'isolamento rispetto ai protocolli del kit standard (ad esempio, 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). Questo protocollo può essere utilizzato con diversi kit commerciali, tra cui il Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283). | ||
| Kit per la rimozione delle cellule morte | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| Soluzione DL-Ditiotreitolo (DTT) | Sigma | 646563 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 &; m | Bel-Art | H136800040 | |
| Soluzione madre di albumina sierica bovina (BSA) | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| Cloruro di magnesio (MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| Soluzione di cloruro di magnesio, 1 M Sigma | M1028 | ||
| Nonidet P40 Sostituto | Sigma | 74385 | |
| Senza nucleasi Acqua | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| Nuclei Buffer (20X) | 10X Genomics | 2000153 | |
| Protector Inibitore della RNasi | Sigma | 3335399001 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| Soluzione di cloruro di sodio, 5 M | Sigma | 59222C | |
| Trizma cloridrato Soultion, pH 7.4 | Sigma | T2194 | |
| Trizma cloridrato (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Altre apparecchiature | |||
| Contatore cellulare automatizzato | CytoSMART | 699910591 | |
| Microscopio | Zeiss | Primostar 3 |
Riferimenti
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- An, H. H., et al. The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine. Blood. 140 (15), 1723-1734 (2022).
- Zeng, J., Tang, S. Y., Toh, L. L., Wang, S. Generation of "Off-the-Shelf" Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rep. 9 (6), 1796-1812 (2017).
- Pavani, G., et al. Modeling primitive and definitive erythropoiesis with induced pluripotent stem cells. Blood Adv. , (2024).
- Chen, X., et al. Integrative epigenomic and transcriptomic analysis reveals the requirement of JUNB for hematopoietic fate induction. Nat Comm. 13 (1), 3131(2022).
- Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat med. 26 (5), 792-802 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
- Nadelmann, E. R., et al. Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling. Curr Protoc. 1 (5), e132(2021).
- Del-Aguila, J. L., et al. A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain. Alzheimer's Res Ther. 11 (1), 71(2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS one. 13 (12), e0209648(2018).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).
- Maciejowski, J., Hatch, E. M. Nuclear membrane rupture and its consequences. Ann Rev Cell Dev Biol. 36, 85-114 (2020).
- Fang, R., et al. Comprehensive analysis of single cell ATAC-seq data with SnapATAC. Nat Comm. 12 (1), 1337(2021).
- Baysoy, A., Bai, Z., Satija, R., Fan, R. The technological landscape and applications of single-cell multi-omics. Nat Rev. Mol Cell Biol. 24 (10), 695-713 (2023).
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Ristampe e permessi
