Una registrazione simultanea dell'attività autonomica e del comportamento materno dettagliato dei topi madre dalla gravidanza all'allattamento è stata ottenuta utilizzando un sistema di telemetria. Questo metodo aiuta a comprendere le dinamiche delle caratteristiche fisiologiche e comportamentali nelle madri dalla gravidanza allo svezzamento.
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Articolo metodologico
Analisi degli elettrocardiogrammi e del comportamento nei topi dalla gravidanza al periodo di allattamento
In questo articolo
Sommario
Abstract
I cambiamenti nella relazione madre-prole sono presumibilmente accompagnati da cambiamenti dinamici nel sistema nervoso autonomo. Sebbene le misurazioni temporali dell'attività autonomica siano state eseguite in madri e neonati umani, l'analisi dei cambiamenti a lungo termine rimane inesplorata. Le madri di topo possono formare legami sociali con i loro cuccioli e avere un breve periodo di gravidanza e allattamento, il che le rende utili per l'esame dei cambiamenti fisiologici dalla gravidanza all'allevamento dei cuccioli. Pertanto, un sistema di telemetria è stato utilizzato per diverse settimane per misurare i cambiamenti nel sistema nervoso autonomo e il comportamento delle madri topo. I risultati attuali hanno mostrato che un elettrocardiogramma (ECG) può essere registrato in modo stabile indipendentemente dai movimenti delle madri e dal parto. L'analisi ECG ha mostrato che la frequenza cardiaca è diminuita gradualmente dalla gravidanza all'allattamento e l'attività simpatica è aumentata notevolmente man mano che i cuccioli si sviluppavano. Inoltre, la registrazione simultanea del comportamento e dell'ECG nella gabbia domestica ci ha permesso di comprendere le influenze comportamentali sull'ECG, rivelando così le caratteristiche dell'attività nervosa autonomica durante ciascun comportamento. Pertanto, il presente metodo sperimentale aiuta a capire come le caratteristiche fisiologiche delle madri cambiano dalla gravidanza all'allevamento dei cuccioli, supportando il sano sviluppo dei cuccioli.
Introduzione
La relazione madre-prole è unica tra le relazioni stabilite da varie specie animali a causa del suo grande impatto sul futuro della prole1. Negli esseri umani, lo sviluppo e i comportamenti interni/esterni dei bambini sono influenzati dallo stile genitoriale, nonché dall'entità dell'abuso e dell'abbandono 2,3. Allo stesso modo, nei roditori, la qualità del comportamento materno ha un impatto significativo sullo sviluppo e sul comportamento dei cuccioli 4,5,6. Pertanto, il monitoraggio dettagliato e l'esame dei comportamenti di cura delle madri possono fornire informazioni sui meccanismi delle differenze individuali nello sviluppo e nel sostegno sano della loro prole.
Studi comportamentali e fisiologici hanno dimostrato che le madri mammifere subiscono cambiamenti comportamentali e fisiologici dinamici dalla gravidanza all'allattamento. Quando le femmine di mammifero rimangono incinte, la secrezione di estrogeni e altri ormoni influenza il comportamento materno7. Man mano che la prole cresce e la frequenza dell'allattamento diminuisce, la secrezione ormonale cambia dinamicamente verso lo stato pre-gravido, ponendo fine all'espressione del comportamento materno 8,9,10. Questi risultati suggeriscono che l'interazione tra il sistema endocrino, il comportamento materno e lo sviluppo della prole gioca un ruolo importante nei cambiamenti che le madri mammifere sperimentano durante la gravidanza e l'allattamento.
I cambiamenti comportamentali e fisiologici nelle madri mammifere dalla gravidanza all'allattamento sono strettamente correlati non solo al sistema endocrino ma anche al sistema nervoso autonomo11,12. Studi sull'uomo suggeriscono che il contatto madre-bambino induce cambiamenti nel sistema nervoso autonomo sia delle madri che dei neonati13. Diversi studi hanno misurato l'elettrocardiogramma (ECG) e la variabilità della frequenza cardiaca nelle madri umane e nei neonati, dimostrando che ogni comportamento altera la frequenza cardiaca e l'intervallo RR degli altri 14,15,16. Tuttavia, non è chiaro come i tre fattori - sistema nervoso autonomo, comportamento materno e sviluppo della prole - interagiscano tra loro dalla gravidanza all'allattamento. Inoltre, è difficile monitorare queste interazioni nell'uomo per un lungo periodo di tempo perché il periodo di lattazione umana è di circa due anni.
I roditori sono spesso usati al posto degli esseri umani in tali studi. Il sistema nervoso autonomo dei roditori è stato misurato in anestesia o quando isolato dai cuccioli per evitare registrazioni instabili e danni al dispositivo di misurazione; quindi, la misurazione è temporale in situazioni comportamentali limitate 17,18,19. È essenziale osservare il sistema nervoso autonomo in un ambiente in cui i roditori possono muoversi liberamente e comunicare con gli altri perché le interazioni madre-cucciolo possono alterare il comportamento e la fisiologia delle madri 8,9,10,15.
Questo metodo sperimentale è stato sviluppato per consentire la libera circolazione della madre. In questo metodo, un telemetro ECG è stato collegato per via sottocutanea a una madre incinta per evitare danni al dispositivo e consentire una registrazione ECG stabile a lungo termine dalla gravidanza all'allattamento. Le madri di topo possono mostrare comportamenti generali (auto-toelettatura, assunzione di cibo, ecc.) e il solito comportamento materno nella loro gabbia domestica; quindi, ogni comportamento e ogni ECG possono essere osservati e confrontati facilmente nello stesso topo. Un registratore su disco ha registrato il comportamento del mouse per 24 ore per un periodo di quattro settimane. Questo protocollo sperimentale ci ha permesso di monitorare i cambiamenti dinamici nell'attività autonomica e nel comportamento dalla gravidanza al periodo materno.
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Protocollo
Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico dell'Università di Azabu (#210319-30). Per il presente studio sono stati utilizzati topi C57B/6J al giorno gestazionale (GD) 14 di peso superiore a 22 g. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). I reagenti e le attrezzature necessarie per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Preparazione sperimentale
- Accendi il pannello riscaldante e coprilo con un foglio di alluminio. Pulire tutte le superfici con etanolo al 70%.
- Tutti gli strumenti chirurgici (forbici, pinze, pinzette sottili e pinzette) sono stati sterilizzati in autoclave in anticipo.
- Preparare le suture sterili alla lunghezza desiderata e tenerle pronte.
- Coprire le maschere per anestesia con maschere di gomma per garantire la sterilità e il comfort del paziente.
- Ispezionare il telemetro del biopotenziale del topo (Figura 1A) per eventuali anomalie o danni utilizzando le applicazioni tBase e LabChart (il software di analisi dei dati fisiologici) installate su un computer in grado di registrare.
2. Impianto del telemetro
- Metti il topo in una scatola per anestesia di induzione con isoflurano al 4%.
- Dopo aver raggiunto il piano chirurgico dell'anestesia, posizionare il mouse in posizione prona sul riscaldatore del pannello. Posizionare la maschera per anestesia sul topo, mantenendo un livello di isoflurano dell'1%-2,0% e un flusso di ossigeno a 0,5-2 L/min.
NOTA: In questo protocollo non sono stati utilizzati analgesici, tenendo in considerazione i loro effetti sul feto e le osservazioni comportamentali. - Utilizzare un tagliacapelli per rimuovere il pelo tra le orecchie e disinfettare la pelle tre volte con disinfettanti a base di iodio alternati e alcol al 70%.
- Per confermare il piano chirurgico dell'anestesia, pizzicare le dita delle zampe posteriori del topo con una pinzetta. Praticare un'incisione (2-3 cm) nella pelle tra le orecchie usando le forbici. Inserire una pinza nell'incisione per separare la pelle e i muscoli intorno al collo e il lato ventrale, creando spazio sul lato ventrale specifico per il posizionamento della telemetria.
- Inserire il telemetro attraverso l'incisione tra le orecchie e posizionarlo nello spazio laterale ventrale.
- Usa una pinza per arrotolare e raggruppare gli elettrocateteri positivo e negativo. Posizionare i cavi nello spazio del collo (Figura 1B).
- Sutru l'incisione utilizzando un ago da 13 mm e una sutura da 20 cm, facendo attenzione a non danneggiare gli elettrocateteri.
- Metti il topo in posizione supina e strappa il pelo attorno alla clavicola con un tagliacapelli. Disinfettare la pelle tre volte con disinfettanti alternati a base di iodio e alcol al 70%.
- Fai un piccolo taglio intorno alla pelle della clavicola con le forbici e separa i muscoli dalla pelle del collo. Estrarre gli elettrocateteri positivo e negativo dalla parte posteriore del collo usando una pinza.
- Usa una pinza per separare le ghiandole salivari ed esporre l'aspetto "a forma di V" del muscolo sternocleidomastoideo (SCM), che origina dalla clavicola e viaggia obliquamente su ciascun lato del collo (Figura 1C, D).
- Regolare la lunghezza dell'elettrocatetere negativo per raggiungere l'SCM vicino alla clavicola. Rimuovere con cautela il tubo di derivazione dal cavo negativo, assicurandosi che l'elettrodo in acciaio inossidabile a spirale all'interno sia allungato con una pinzetta fine.
- Passare l'ago da cucitura (7 mm) con una sutura di 10 cm attraverso la curva a forma di V dell'SCM per creare un anello. Far passare l'elettrodo in acciaio inossidabile dal cavo negativo attraverso questo anello e posizionarlo sotto l'SCM vicino alla clavicola.
- Legare leggermente l'anello per evitare di danneggiare l'SCM e ripetere tre volte per fissare l'elettrodo in acciaio inossidabile. Fissare ulteriormente l'elettrocatetere negativo posizionando la seconda sutura sul lato cranico dell'SCM e legandola attorno al tubo dell'elettrocatetere negativo (Figura 1E).
- Eseguire il sezionamento attorno al processo xifoideo e separare accuratamente la pelle dal muscolo, dal processo xifoideo alla clavicola.
- Estendi l'elettrocatetere positivo per raggiungere il processo xifoideo. Analogamente al cavo negativo, rimuovere il tubo di derivazione dal cavo positivo, assicurandosi che l'elettrodo in acciaio inossidabile a spirale all'interno sia allungato utilizzando una pinzetta fine.
- Utilizzare un ago da 18 G per creare un tunnel sotto il muscolo attorno al processo xifoideo, quindi posizionare l'elettrodo di acciaio inossidabile in un ago e farlo passare attraverso il muscolo attorno al processo xifoideo.
- Dopo aver rimosso l'ago, suturare leggermente l'elettrodo a spirale in acciaio inossidabile al muscolo attorno al processo xifoideo utilizzando un ago da cucitura (7 mm) con una sutura di 10 cm (Figura 1D). Per fissare ulteriormente l'elettrocatetere positivo, posizionare la seconda sutura sul lato cranico del processo xifoideo e legarla attorno al tubo dell'elettrocatetere positivo.
- Chiudere tutte le incisioni utilizzando un ago da cucitura (13 mm) con una lunghezza di sutura di 20 cm (Figura 1E, F).
- Dopo l'impianto, posizionare il mouse in una gabbia pulita e posizionare la gabbia sulla tBase, che funge da ricevitore per la telemetria del mouse (Figura 1G). Accendere il computer registrabile e utilizzare l'applicazione software di analisi dei dati installata per raccogliere i dati ECG. Verificare che i dati dell'ECG mostrino forme d'onda normali (Figura 2A, B).
NOTA: In caso di forme d'onda o rumore anomali (come mostrato nella Figura 2C), ricollegare gli elettrocateteri negativo e positivo in anestesia. - Durante il periodo di recupero di due giorni, assicurati che il topo sia trattato in modo appropriato posizionando acqua, gel e cibo sul fondo della gabbia. Registrare solo il comportamento della gabbia domestica con un registratore di unità durante questo periodo di recupero.
3. Registrazione degli ECG e del comportamento in gabbia domestica dalla gravidanza allo svezzamento
- Accendere le luci rosse durante la fase di buio perché il registratore di unità non può funzionare senza luce. Posizionare il registratore dell'unità vicino alla gabbia domestica per registrare il comportamento. Registra l'ECG utilizzando l'applicazione LabChart sul PC registrabile. Prima di raccogliere i dati ECG, verificare la frequenza di campionamento dell'ECG in LabChart.
NOTA: In questo protocollo, il registratore di unità è stato scelto perché può essere posizionato ovunque. Inoltre, rispetto a una videocamera, i registratori su unità possono registrare con un grandangolo e utilizzare meno capacità di archiviazione dei dati (ad esempio, la registrazione 24 ore su 24 con un registratore su unità utilizza circa 70 GB). In questa dimostrazione, la frequenza di campionamento dell'ECG nel software di analisi dei dati è impostata a 1 k/s. - Dopo aver acceso il registratore dell'unità, avviare LabChart sul computer per registrare il comportamento e l'ECG.
NOTA: In questa dimostrazione, è stata utilizzata una macro per registrare continuamente l'ECG e salvare automaticamente i file ogni 2 ore. Questo processo ripetitivo è stato eseguito durante l'esperimento. Inoltre, è stata selezionata una scheda SD da 256 GB per la registrazione, che consente circa 24 ore di raccolta dati al giorno. - Controllare il mouse per verificare la presenza di anomalie del parto e campionare i dati dal registratore di unità e dal computer registrabile. Il giorno in cui il topo ha dato alla luce i suoi cuccioli è considerato il giorno postnatale (PD) 0. Misura il peso dei cuccioli ogni giorno dopo la nascita.
NOTA: In questo studio, il video di registrazione dal registratore dell'unità e il file di dati ECG dal PC registrabile sono stati raccolti ogni mattina dalle 7:30 alle 8:30. Inoltre, per evitare il rumore dell'ECG dovuto alle vibrazioni causate da più cuccioli che toccano la madre, la cucciolata è stata ridotta a quattro cuccioli (metà di loro erano maschi e l'altra metà erano femmine). - Dopo aver controllato il mouse e raccolto i dati, riporta tutto nella sua posizione originale. Accendere il registratore dell'unità e il computer registrabile. Avviare l'applicazione LabChart.
NOTA: Se si utilizza una macro per registrare l'ECG, fare clic sul pulsante della macro e inizializzare la macro selezionando il pulsante Esegui dall'opzione di gestione . - Una volta alla settimana, sostituisci la gabbia con una nuova. Durante questo processo, includi la lettiera, metà della quale è stata utilizzata in precedenza e l'altra metà è nuova.
NOTA: Questo processo, compreso il campionamento dei dati e i controlli sui topi, è stato ripetuto dal GD 17 al giorno postnatale (PD) 21.
4. Analisi degli ECG
- Per analizzare i dati dell'ECG, utilizzare il software di analisi dei dati. Avvia LabChart e apri il file di dati per il periodo di registrazione. Per analizzare la variabilità della frequenza cardiaca (HRV), fare clic sul pulsante HRV e regolare le impostazioni di rilevamento del battito.
NOTA: In questa dimostrazione, selezionare l'impostazione personalizzata e modificare l'altezza minima del picco su 1,2 per la regolazione del rilevamento. - Dopo aver regolato le impostazioni, rivedere tutti i battiti ed eliminare tutti i dati sul rumore (come mostrato nella Figura 2C).
NOTA: Se un'onda R non viene rilevata, aggiungerla o modificarla utilizzando il pulsante HRV . - Fare clic sul pulsante HRV e selezionare la visualizzazione del classificatore di battiti. Scegliere tutti i battiti nella visualizzazione del classificatore di battiti, quindi selezionare la visualizzazione del rapporto dal pulsante HRV . Copiare i dati dalla visualizzazione del report e incollarli in Excel.
NOTA: I risultati HRV, come mostrato nella Tabella 1, visualizzano sia il dominio del tempo che quello dello spettro attraverso il software di analisi dei dati, consentendo l'osservazione.
5. Categorizzare l'etogramma del comportamento della gabbia domestica
- Esamina tutti i video registrati per verificare la presenza di anomalie, come la luce rossa che non si accende durante la fase di buio e il registratore dell'unità che non funziona.
NOTA: Il video viene registrato allo stesso modo degli ECG, con clip video catturati ogni 2 ore. - Classificare l'etogramma in base a parametri quali la postura della madre durante il comportamento, il tempo trascorso sul comportamento e il luogo in cui si è verificato il comportamento (Tabella 2), quindi osservare il video dal registratore dell'unità.
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Risultati
Dopo aver impiantato il telemetro nella topolina gravida, abbiamo registrato gli ECG dalla gravidanza all'allattamento in una gabbia domestica. La frequenza di campionamento è stata impostata su 1 k/s. Per confrontare l'ECG di ogni stato fisiologico della madre di topo evitando l'influenza del ritmo circadiano, sono stati analizzati i dati di 10 minuti da 23:32 a 23:42 su GD 17, parto, PD 0 e PD 21 dal file di dati di 2 ore (Figura 3, Tabella 1). L'orario dalle 23:32 alle 23...
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Discussione
In questo metodo, in cui il telemetro è stato impiantato in topi gravidi, l'ECG potrebbe essere monitorato continuamente nello stesso topo dalla gravidanza all'allattamento. Il topo mostrava etogrammi che includevano il movimento, indicando la veglia durante tutti i periodi di analisi (23:32-23:42) da GD 17 a PD 21. Inoltre, i risultati attuali hanno mostrato che la frequenza cardiaca è diminuita gradualmente dalla gravidanza all'allattamento. Si ritiene che questa diminuzione sia dovuta...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato da JSPS KAKENHI (Grant Numbers JP 21H04981 e 30974521) e dal Center for Diversity, Equity & Inclusion, Azabu University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Timer di ripetizione 24 ore | Panasonic | WH3311BP | |
| 5-0 Sutura in nylon | Natsume Seisakusho | Co-23s-N2 | |
| Scatola per anestesia | Natsume Seisakusho Co | KN-1010 | W110&volte; D110&volte; Maschera per anestesia H110mm |
| Natsume Seisakusho Co | KN-1019-1 | ||
| Macchina per anestesia | Natsume Seisakusho Co | KN-1071-E | |
| C57BL6 / J topi | Clea Japan, Inc | Topo gravidanza a 14 giorni | |
| Clip light | Yazawa corporation | CLX60X02WH | |
| Configurator System | Adinstuments | TR190 | |
| registratore di unità | Transcend | TS-DP250A-32G | |
| Porta alimenti | Clea Japan, Inc | CL-2802 | |
| Isoflurano | FujiFilM | 099-06571 | |
| LabChart Pro V8 | Strumenti | MLU260/8 | |
| LabChart8 | Strumenti | MLS060/8 | |
| Telemetro biopotenziale per topo | Strumenti | MT10B | |
| Ago 18 G 1 1/2 | Terumo | NN-1838R | |
| Pannello riscaldante | SANKO | 4976285145407 | |
| PowerLab 4/26 | Strumenti | PL2604 | |
| Computer registrabile | Mouse mouse mouse | K7-H | |
| lampadina rossa | ELPA | LDG1R-G-GWP254 | |
| Maschera di gomma | Natsume Seisakusho Co | KN-1019-M | |
| Scheda SD (256 GB) | Transcend | TS256GUSD350V | Può registrare circa 24 ore |
| Ago da sutura 13 mm | Natsume Seisakusho Co | C-24-540-NO.0 | |
| Ago da sutura 7 mm | Natsume Seisakusho Co | C-24-540-NO.0000 | |
| tBase | Adinstuments | MT110 |
Riferimenti
- Bowlby, J. Attachment and loss. Vol. 1. 1, Basic Books. New York. (1969).
- Teicher, M. H., Samson, J. A. Childhood maltreatment and psychopathology: A case for ecophenotypic variants as clinically and neurobiologically distinct subtypes. Am J Psychiatry. 170 (10), 1114-1133 (2013).
- Hoskins, D. H. Consequences of parenting on adolescent outcomes. Societies. 4 (3), 506-531 (2014).
- Caldji, C., et al. Maternal care during infancy regulates the development of neural systems mediating the expression of fearfulness in the rat. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5335-5340 (1998).
- Sakamoto, T., Ishio, Y., Ishida, Y., Mogi, K., Kikusui, T. Low maternal licking/grooming stimulation increases pain sensitivity in male offspring. Exp Anim. 70 (1), 13-21 (2021).
- Champagne, F., Meaney, M. J. Like mother, like daughter: Evidence for non-genomic transmission of parental behavior and stress responsivity. Prog Brain Res. 133, 287-302 (2001).
- Terkel, J., Rosenblatt, J. S. Maternal behavior induced by maternal blood plasma injected into virgin rats. J Comp Physiol Psychol. 65 (3), 479-482 (1968).
- Amenomori, Y., Chen, C. L., Meites, J. Serum prolactin levels in rats during different reproductive states. Endocrinology. 86 (3), 506-510 (1970).
- Yaguchi, K., et al. Dynamic modulation of pulsatile activities of oxytocin neurons in lactating wild-type mice. PloS One. 18 (5), e0285589(2023).
- Kikusui, T., Isaka, Y., Mori, Y. Early weaning deprives mouse pups of maternal care and decreases their maternal behavior in adulthood. Behav Brain Res. 162 (2), 200-206 (2005).
- Kodogo, V., Azibani, F., Sliwa, K. Role of pregnancy hormones and hormonal interaction on the maternal cardiovascular system: a literature review. Clin Res Cardiol. 108 (8), 831-846 (2019).
- Burke, S. D., et al. Circulatory and renal consequences of pregnancy in diabetic NOD mice. Placenta. 32 (12), 949-955 (2011).
- Feldman, R., Magori-Cohen, R., Galili, G., Singer, M., Louzoun, Y. Mother and infant coordinate heart rhythms through episodes of interaction synchrony. Infant Behav Dev. 34 (4), 569-577 (2011).
- Yoshida, S., et al. Infants show physiological responses specific to parental hugs. iScience. 23 (4), 100996(2020).
- Wass, S. V., et al. Parents mimic and influence their infant's autonomic state through dynamic affective state matching. Curr Biol. 29 (14), 2415-2422 (2019).
- Esposito, G., et al. Infant calming responses during maternal carrying in humans and mice. Curr Biol. 23 (9), 739-745 (2013).
- Khandoker, A. H., et al. Investigating the effect of cholinergic and adrenergic blocking agents on maternal-fetal heart rates and their interactions in mice fetuses. Biol Open. 11 (4), (2022).
- Widatalla, N., et al. Correlation between maternal and fetal heart rate increases with fetal mouse age in typical development and is disturbed in autism mouse model treated with valproic acid. Front Psychiatry. 13, 998695(2022).
- Mezzacappa, E. S., Tu, A. Y., Myers, M. M. Lactation and weaning effects on physiological and behavioral responses to stressors. Physiol Behav. 78 (1), 1-9 (2003).
- Slangen, B. F., Out, I. C., Janssen, B. J., Peeters, L. L. Blood pressure and heart rate variability in early pregnancy in rats. Am J Physiol. 273 (4), 1794-1799 (1997).
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Ristampe e permessi
