Viene descritto un nuovo metodo di iniezione intraperitoneale (IP) nel pesce zebra adulto. Quando si maneggiano composti tossici come la doxorubicina, questa procedura è più efficace dei due metodi IP precedentemente riportati. La tecnica è progettata per essere facilmente adottata da ricercatori con esperienza limitata nel modello del pesce zebra.
Articolo metodologico
Una tecnica di iniezione intraperitoneale nel pesce zebra adulto che riduce al minimo i danni al corpo e la mortalità associata
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il pesce zebra adulto (Danio rerio), che è geneticamente accessibile, viene impiegato come prezioso modello di vertebrato per studiare disturbi umani come la cardiomiopatia. L'iniezione intraperitoneale (IP) è un metodo importante che fornisce composti all'organismo per testare gli effetti terapeutici o generare modelli di malattia come la cardiomiopatia indotta da doxorubicina (DIC). Attualmente, esistono due metodi di iniezione IP. Entrambi i metodi hanno limitazioni quando si maneggiano composti tossici come la doxorubicina, che provocano effetti collaterali che si manifestano come gravi danni alla forma del corpo e morte dei pesci. Sebbene queste carenze possano essere superate con un'ampia formazione degli investigatori, è auspicabile un nuovo metodo di iniezione IP che abbia effetti collaterali minimi. In questo caso, viene riportato un metodo di iniezione IP unico in grado di gestire composti tossici. Una funzione cardiaca costantemente ridotta può risultare senza incorrere in una morte significativa dei pesci. La tecnica può essere facilmente padroneggiata dai ricercatori che hanno un'esperienza minima con il pesce zebra adulto.
Introduzione
Il pesce zebra (Danio rerio) ha guadagnato attenzione come modello sperimentale per lo studio delle malattie umane perché questo animale comprende un'elevata omologia genica e di organi con l'uomo, fecondazione esterna, facilità di manipolazione genetica e trasparenza del corpo nella prima maturità, che facilita una miriade di applicazioni di imaging1. A differenza del semplice processo di somministrazione di farmaci direttamente in acqua per embrioni e larve di pesce zebra, la somministrazione di farmaci a pesci zebra adulti presenta un'impresa più complessa e impegnativa2.
Nei pesci adulti, i composti possono essere somministrati attraverso tecniche di somministrazione passiva di farmaci, come la somministrazione diretta in acqua, o attraverso metodi di somministrazione orale di farmaci come il gavaging2. Altri approcci includono il rivestimento del mangime per pesci con i composti e la successiva alimentazione del pesce3 e la somministrazione diretta di farmaci insolubili in acqua a una concentrazione predeterminata, comprese le iniezioni retro-orbitali o intraperitoneali 4,5. La somministrazione intraperitoneale è preferita per gli studi in vivo di modelli di malattia grazie ai suoi distinti vantaggi farmacocinetici6. Questo metodo fornisce un'elevata concentrazione di farmaco e un'emivita prolungata all'interno della cavità peritoneale, offrendo un percorso efficace per la somministrazione del farmaco 7,8. L'approccio è comunemente utilizzato in contesti di ricerca per garantire un assorbimento e una distribuzione ottimali dei farmaci 9. Mentre i metodi basati sull'iniezione si dimostrano efficaci per la somministrazione singola, le iniezioni prolungate e ripetute spesso portano a danni al corpo e infezioni croniche2.
Attualmente, ci sono due metodi di iniezione IP nello zerbafish adulto 4,10. Tuttavia, entrambi i metodi hanno dei limiti nella somministrazione di composti tossici come la doxorubicina, che portano a gravi danni alla forma del corpo e alla mortalità dei pesci. Gli effetti collaterali possono complicare notevolmente l'interpretazione dei dati. Sebbene queste sfide possano essere affrontate con una formazione approfondita10, c'è una chiara necessità di un nuovo metodo di iniezione IP che riduca al minimo gli effetti collaterali.
In questo caso, il nostro obiettivo è quello di sviluppare un nuovo metodo di iniezione IP ottimizzato per l'efficace somministrazione di doxorubicina in zebrafish adulto, facilitando la generazione di modelli affidabili di cardiomiopatia indotta da doxorubicina (DIC) con danni corporei ridotti al minimo e mortalità associata.
Protocollo
Tutte le procedure condotte sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Mayo Clinic, aderendo agli standard delineati nella "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" (National Academies Press, 2011). Tutti i pesci zebra nello studio appartengono al ceppo Wild Indian Karyotype (WIK). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Preparazione e conservazione della soluzione madre di doxorubicina
- Ottenere il brodo di doxorubicina da una fonte commerciale.
NOTA: La doxorubicina è sensibile alla luce, quindi acquistala in polvere e conservala in contenitori opachi per proteggerla dall'esposizione alla luce. Eseguire tutti i passaggi per la preparazione della polvere Dox all'interno di una cappa chimica. - Sciogliere completamente la polvere di Dox in acqua distillata e preparare una soluzione madre con una concentrazione finale di 5 mg/mL.
- Aliquotare il brodo dividendolo in provette da 1,5 mL.
- Avvolgere i tubi in un foglio di alluminio per proteggerli dall'esposizione alla luce.
- Conservare la soluzione aliquot Dox a 4 °C per la conservazione a breve termine (<1 mese) o a -20 °C per la conservazione a lungo termine10.
2. Raggruppare i pesci in base al loro peso corporeo
- Raggruppare i pesci con una differenza di peso corporeo inferiore al 10% per la successiva iniezione.
NOTA: Per risparmiare fatica in questa fase, i pesci con una varianza del peso corporeo inferiore al 10% sono classificati come della stessa taglia. - Lasciare digiunare il pesce per 24 ore prima dell'iniezione.
- Anestetizzare il pesce utilizzando acqua embrionale contenente 0,16 mg/mL di tricaina per 1 minuto.
- Togli il pesce dall'acqua con la tricaina e tampona entrambi i lati del corpo del pesce con carta da filtro pulita per rimuovere l'acqua in eccesso.
- Misurare e registrare il peso corporeo di ogni pesce, quindi rimettere prontamente il pesce in una vasca di recupero riempita con acqua dolce del sistema.
NOTA: L'iniezione di Dox è stata eseguita sui pesci dopo aver raggiunto i 3 mesi di età. In questo studio, i ricercatori hanno utilizzato pesci di età compresa tra 3 e 10 mesi. I BW del pesce zebra maturo del ceppo WIK possono variare da 0,2 g a 0,5 g. L'anestesia prolungata per più di 5 minuti, seguita da un'iniezione di Dox, ha portato a un'elevata mortalità dei pesci.
3. Preparazione dell'ago e della stazione per l'iniezione
- Determinare il volume di iniezione della soluzione madre Dox (ad es. 5 mg/mL) necessario per ciascun pesce in base al peso corporeo medio per raggiungere la dose target di 20 μg/g.
- Utilizzare la seguente formula per calcolare il volume di iniezione:
- Aggiungere 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) per diluire la soluzione Dox calcolata nella fase 1 per l'iniezione, raggiungendo un volume totale di 5 μl.
NOTA: Utilizzare una soluzione sfusa per ogni gruppo di pesci in base al loro peso corporeo e includere altri 3 pesci in ciascun gruppo per garantire che non vi sia carenza di soluzione iniettabile durante il corso dell'esperimento. - Picchiettare delicatamente la provetta e quindi microcentrifugare brevemente alla massima velocità per raccogliere la soluzione a temperatura ambiente per 10 s.
- Mettere la soluzione preparata sul ghiaccio e proteggerla dall'esposizione alla luce.
- Posizionare una capsula di Petri da 100 mm pulita con una spugna sotto un microscopio da dissezione, quindi regolare la messa a fuoco.
NOTA: La spugna contiene una scanalatura lunga 4 cm. La retrazione elastica della spugna fornirà al pesce supporto e manterrà il corpo del pesce in posizione. La spugna può essere riutilizzata. - Dotare una microsiringa da 10 μl di un ago smussato da 34 g.
- Sciacquare l'ago con 1x tampone HBSS per eliminare eventuali bolle e rimuovere potenziali ostruzioni dalla siringa.
- Misurare 5 μl della soluzione preparata al punto 4 per l'iniezione.
4. Procedura di iniezione IP Dox
- Mettere il pesce adulto in acqua con 0,16 mg/mL di tricaina per 1 minuto per indurre uno stato di incoscienza.
- Posizionare il pesce nella scanalatura della spugna incorporata con l'addome rivolto verso l'alto (Figura 1A).
- Inserire l'ago con un angolo vicino a 0°, partendo dal punto medio della pinna pettorale verso il lato posteriore della cavità cardiaca (Figura 1B).
NOTA: Evitare qualsiasi contatto con il cuore durante la procedura. - Dirigi l'ago verso la coda e vai sotto la pelle argentata.
NOTA: Posizionare l'ago in prossimità della pelle argentata, facendo attenzione a evitare graffi o forature. - Monitorare la punta dell'ago all'interno della cavità addominale durante l'intera operazione (Figura 1C).
NOTA: Evitare di danneggiare il fegato, l'intestino, la vescica natatoria e altri organi. Assicurarsi che l'ago raggiunga la fine dell'intestino, vicino al forame cloacale. - Erogare gradualmente e uniformemente la soluzione di Dox da 5 μl, quindi ritirare lentamente l'ago lungo il percorso originale per evitare perdite (Figura 1D).
- Monitorare la cavità addominale per la presenza di Dox osservando una colorazione rossa della soluzione di Dox (Figura 1E).
- Sposta rapidamente il pesce iniettato in una vasca di attraversamento pulita riempita con acqua fresca del sistema per aiutare il pesce a riprendersi.
NOTA: Tra un'iniezione e l'altra, sciacquare l'ago una volta con 1x tampone HBSS.
5. Gestione del pesce post-iniezione
- Reinserire il pesce nel sistema con la circolazione dopo l'iniezione.
- Digiunare tutti i pesci iniettati per altre 24 ore per facilitarne il recupero.
- Durante la prima settimana, tenete d'occhio i pesci. Rimuovere il pesce deceduto il prima possibile per evitare di infettare gli altri pesci.
NOTA: I decessi di pesci nelle prime 24 ore sono probabilmente dovuti a lesioni fisiche dovute all'iniezione o all'anestesia prolungata. Registra il numero di pesci per generare una curva di sopravvivenza. - Eseguire l'ecocardiografia per fenotipizzare il pesce iniettato con Dox a 56 giorni dopo l'iniezione11.
NOTA: Garantire l'uniformità delle condizioni e delle procedure per il corrispondente gruppo di controllo iniettato con la soluzione HBSS.
Risultati
In precedenza, sono state impiegate due metodiche intraperitoneali (IP) per la somministrazione di doxorubicina in zebrafish adulti 4,10. Nel metodo I, noto anche come metodo di iniezione IP classico come descritto da Kinkel et al.4, l'ago è stato inserito con un angolo di 45° rispetto alla linea mediana tra le pinne pelviche con l'addome rivolto verso l'alto. Nel metodo II, o metodo di iniezione IP alternativo come descritto da Ma et al.10, l'ago è stato inserito attraverso il lato dorsale del pesce (Figura 2A(i,ii)). Al contrario, il nostro metodo III presenta due grandi cambiamenti. In primo luogo, la posizione dell'iniezione viene modificata, con l'addome rivolto verso l'alto e l'ago diretto dal punto medio della pinna pettorale verso l'addome. Il sito di penetrazione è guidato da un foro naturale in quest'area. In secondo luogo, l'angolo dell'ago viene ridotto, che dovrebbe essere vicino a 0° (Figura 2A(iii), Figura 1).
Confronto tra tre metodi di iniezione intraperitoneale
Per confrontare i tre metodi di iniezione IP, vengono presentati i dati ottenuti dal ricercatore I, che non aveva precedenti esperienze con zebrafish. Quando i metodi I e II sono stati utilizzati per l'iniezione di IP, è stata osservata una significativa mortalità dei pesci nelle prime due settimane successive all'iniezione di IP. Nel metodo I, la morte è stata osservata tre giorni dopo l'iniezione, mentre nel metodo II si è verificata dopo due giorni dopo l'iniezione. Il 70% dei pesci iniettati presentava danni visibili al corpo, specialmente intorno al sito di iniezione, manifestandosi come dimensioni corporee drasticamente ridotte e forma corporea curva uno o due mesi dopo l'iniezione di IP (Figura 2A (iv,v)). Si è ipotizzato che la mortalità e il danno osservato potessero essere attribuiti alla tossicità della doxorubicina12, che potrebbe fuoriuscire dall'estremità di apertura dell'ago per iniezione durante il processo di iniezione, danneggiando l'organo interno lungo il percorso dell'iniezione. Nel metodo I, la punta dell'ago per iniezione potrebbe toccare l'intestino (Figura 2A(i)), mentre nel metodo II, potrebbe toccare la vescica natatoria (Figura 2A(ii)). È stato ipotizzato che si potesse impedire alla punta dell'ago di toccare qualsiasi organo interno utilizzando il metodo III (Figura 2A(iii)). In effetti, è stato notato un tasso di sopravvivenza significativamente migliorato, con l'80% dei pesci che sopravvive a 1 mese dopo l'iniezione (Figura 2B). Ciò significa un notevole miglioramento rispetto ai tassi di sopravvivenza per i metodi I e II, che erano rispettivamente del 53,33% e del 33,33%. È importante sottolineare che l'80% dei pesci sopravvissuti mostrava una forma corporea normale, in contrasto con quelli generati dai metodi I e II (Figura 2A (vi)). Per convalidare il successo della generazione del modello DIC, la funzione cardiaca è stata valutata misurando la percentuale della frazione di eiezione (EF%). Infatti, una riduzione significativa della EF% è stata osservata a 56 giorni dopo l'iniezione nel gruppo con il metodo III (Figura 2C).
Riproducibilità del metodo III da parte di diversi ricercatori
Per dimostrare che il metodo III può essere facilmente padroneggiato da diversi ricercatori, sono stati reclutati 3 ricercatori che non avevano mai lavorato con il pesce zebra prima. Dopo i primi tentativi con il metodo III, tutti i ricercatori sono stati in grado di raggiungere tassi di sopravvivenza dell'85,71%, 95% e 83,33% 56 giorni dopo l'iniezione e una EF marcatamente diminuita (Figura 3A, B). Da notare che tre ricercatori hanno ripetuto il loro esperimento rispettivamente 3 volte, 3 volte e 2 volte e hanno costantemente ottenuto risultati positivi. Questi dati hanno confermato la ripetibilità del metodo III, consentendo ai ricercatori senza precedenti esperienze di lavoro con i pesci di generare modelli DIC affidabili.
In uno dei tentativi iniziali con il metodo III, il ricercatore II ha testato una deviazione del metodo III: invece di 0°, è stato utilizzato un angolo di 45° mentre si penetrava l'ago attraverso la pelle (Figura 2A(iii), freccia tratteggiata). Solo il 15% dei pesci è sopravvissuto due mesi dopo l'iniezione (Figura 3A), con l'80% dei pesci sopravvissuti che mostravano notevoli danni al corpo. I dati hanno indicato che l'angolo di penetrazione è un passaggio critico per il successo del metodo III.
Il metodo III consente la creazione di un modello di CID cronica
È stato ipotizzato che un danno corporeo significativamente ridotto potrebbe consentire iniezioni multiple di IP nello stesso pesce, imitando il modello di CID cronica nei topi13,14. Pertanto, il metodo III è stato utilizzato per eseguire una serie di iniezioni per 4 settimane consecutive, con 5 μg/g Dox a settimana (Figura 4A). In questo esperimento, il 100% dei pesci iniettati è sopravvissuto e l'80% di essi non ha mostrato segni di danni al corpo. È importante sottolineare che è stata osservata una frazione di eiezione significativamente ridotta a 56 dpi, indicando il successo della generazione di un modello di CID cronica nel pesce zebra adulto (Figura 4B).
Figura 1: Posizione e angolo di inserimento dell'ago per il nuovo metodo di iniezione IP. (A) La posizione dell'inserimento dell'ago. Il pesce è a testa in giù, esponendo il lato addominale. La testa è a destra. Tra le pinne pettorali si trova un foro naturale che facilita la penetrazione della pelle. (B) L'angolo di inserimento dell'ago. È vicino a zero gradi rispetto alla superficie del pesce. (C) La traccia dell'ago sotto la pelle. La punta dell'ago viene continuamente monitorata una volta all'interno della cavità addominale. Il punto di ingresso appare diverso dalla Figura 1A a causa della distorsione della pelle durante il processo di penetrazione. (D) Un pesce dopo che Dox è stato rilasciato. La cavità addominale diventa rossa dopo aver rilasciato il Dox. (E) Un pesce dopo l'iniezione di IP. Non ci sono segni di perdite dopo aver ritirato l'ago. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Confronto di tre metodi di iniezione IP in zebrafish adulto. (A) Schemi di tre metodi di iniezione IP. (i-iii) Vengono mostrati gli schemi dell'iniezione IP classica (metodo I), dell'iniezione IP alternativa (metodo II) e del nuovo metodo (metodo III). Le frecce indicano i siti di penetrazione e l'angolo dell'ago per tre metodi di iniezione. Freccia tratteggiata, un angolo di penetrazione dell'ago non riuscito. Barra della scala: 5 mm. (iv-vi) Dimensioni ridotte e forma curva del corpo nei modelli DIC. Sono mostrati pesci rappresentativi di pesci DIC a 56 dpi. (B) Confronto delle curve di sopravvivenza tra tre metodi di iniezione IP. Il numero di pesci sopravvissuti è stato registrato settimanalmente. (L'esperimento è iniziato con un totale di n = 15). (C) Valutazione della funzione cardiaca dei pesci a 56 dpi in seguito a stress Dox. n = 6 pesci nel gruppo di controllo 1x HBSS, e l'esperimento è iniziato con un totale di n = 15 pesci in ogni 3 lotti iniettati con Dox. I valori vengono visualizzati come media ± errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il Metodo III consente di stabilire il modello DIC del pesce zebra in modo coerente nelle mani di 3 diversi ricercatori. (A) Curve di sopravvivenza dei pesci DIC utilizzando il Metodo III da tre diversi ricercatori. In tutti e tre i ricercatori è stato osservato un alto tasso di sopravvivenza. Il numero di pesci vivi viene registrato settimanalmente. Un basso tasso di sopravvivenza è stato notato per il ricercatore II quando è stato utilizzato un metodo III senza successo (angolo di penetrazione dell'ago di 45°, come mostrato da una freccia tratteggiata nella Figura 2A). (B) Valutazione della funzione cardiaca di pesci DIC utilizzando il Metodo III da tre diversi ricercatori. In totale, il Ricercatore II, per un angolo di penetrazione dell'ago di 45°, ha utilizzato 3 lotti (9, 12, 14) di pesce per iniezione di Dox. Per un angolo di penetrazione dell'ago di 0° n = 6 pesci sono stati impiegati nel 1x HBSS come gruppo di controllo condiviso. L'esperimento è iniziato con un totale di n = 85 pesci con RII (9, 12, 14), RIII (8, 6, 6) e RIV (12, 18) impiegati in ciascuno degli 8 lotti iniettati con Dox da tre ricercatori (II, III, IV), rispettivamente. I valori vengono visualizzati come media ± errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Il Metodo III consente iniezioni multiple di Dox in un pesce zebra adulto, ricapitolando i modelli di CID cronica nei roditori. (A) Schemi del modello di iniezione multipla. 5 μg/g di Dox (5 μL) sono stati iniettati in quattro settimane consecutive. (B) Il modello DIC cronico manifesta una riduzione dell'EF% a 56 dpi. I valori vengono visualizzati come media ± errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussione
A differenza dei due metodi di iniezione IP esistenti 4,10, il nuovo metodo di iniezione IP è caratterizzato dalle seguenti caratteristiche distintive. In primo luogo, viene utilizzato un angolo di penetrazione dell'ago unico (vicino allo zero); in secondo luogo, l'ago penetra nel pesce attraverso una posizione unica, cioè un foro naturale sulla superficie ventrale di un pesce, che faciliterebbe l'iniezione; e infine, il movimento dell'ago è da anteriore a posteriore. Queste regolazioni riducono efficacemente le lesioni d'organo, che derivano dalla perdita ridotta al minimo di Dox durante il processo di penetrazione. Il percorso dell'ago si trova appena sotto la pelle d'argento, che può essere continuamente monitorata dall'investigatore. Di conseguenza, il contatto diretto tra la punta dell'ago e gli organi interni può essere efficacemente evitato. Dopo l'iniezione, tutto il Dox iniettato rimane nella cavità addominale e l'unica uscita (punto di puntura) potrebbe essere chiusa quando il pesce è sveglio e inizia a nuotare in avanti.
Rispetto ai due metodi di iniezione IP esistenti 4,10, il nuovo metodo di iniezione IP si traduce costantemente in una riduzione al minimo dei danni al corpo e in un aumento dei tassi di sopravvivenza. Questa affermazione è stata ulteriormente sottolineata dalla fattibilità di iniezioni multiple nello stesso pesce per generare un modello DIC cronico di zebrafish. È importante sottolineare che, rispetto ai due precedenti metodi di iniezione IP 4,10, il nuovo metodo può essere rapidamente padroneggiato da ricercatori che non hanno precedenti esperienze nella gestione di pesci zebra adulti. Modelli DIC affidabili sembrano ottenuti con successo al primo o al secondo tentativo nelle mani di almeno 4 diversi ricercatori. Il successo dell'iniezione può essere facilmente concluso entro la prima settimana dopo l'iniezione: il >80%, preferibilmente il 100%, i pesci dovrebbero essere in grado di sopravvivere dopo l'iniezione. Tutti i pesci sopravviveranno fino a 56 dpi, quando la maggior parte dei pesci (>80%) dovrebbe essere esente da evidenti danni al corpo. Questo è un miglioramento significativo, perché un modello DIC affidabile che utilizza i primi due metodi IP può essere stabilizzato solo nelle mani di un ricercatore dopo più di 3 cicli di pratica con almeno 10 pesci in ogni round. Questo processo potrebbe richiedere molto tempo, perché ogni pratica richiedeva circa 2 mesi per concludere il successo della sua iniezione. Ridurre il trauma tissutale non solo migliora il benessere dei pesci, ma riduce anche al minimo i fattori confondenti che potrebbero influenzare i risultati dello studio.
Un passaggio fondamentale per garantire il successo del nuovo metodo è l'angolo di penetrazione. Come mostrato nella Figura 2, quando l'angolo di penetrazione è cambiato da 0° a 45°, è stata notata una significativa moria di pesci, presumibilmente a causa dell'aumento del rischio di contatto tra la punta dell'ago e gli organi interni.
Il limite principale del metodo è che il metodo non può essere utilizzato per somministrare farmaci a pesci di età inferiore ai 3 mesi. A causa delle loro piccole dimensioni corporee, i giovani pesci non possono sopravvivere dopo il danno fisico associato alla penetrazione di un ago. Tuttavia, il metodo può essere utilizzato nei pesci adulti quando il loro peso corporeo è superiore a 0,15 g, compresi quelli di età compresa tra 3 mesi e 4 anni.
Questo nuovo metodo sarebbe ampiamente utilizzato per la somministrazione di farmaci nel pesce zebra adulto, specialmente quando si tratta di composti potenzialmente tossici come Dox15,16. Quando si tratta di composti non tossici, tutti e tre i metodi dovrebbero essere applicabili.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal NIH (HL107304 e HL081753) e dalla Mayo Foundation (Center for Biomedical Discovery and Cardiovascular Research Center) a XX. JL è finanziato dai fondi di ricerca fondamentale per le università centrali della Central South University, n. 56021702. Un ringraziamento speciale a Beninio Gore e Quentin Stevens per aver gestito l'impianto di zebrafish.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10 μ L NanoFil-siringa | World Precision Instruments, Inc | Strumento di iniezione | NANOFIL |
| 34 G ago | World Precision Instruments, Inc | NI34BV-2 | strumento di iniezione |
| 60 mm Piastra di Petri | fisher scientific/fisherbrand | FB0875713A | posizionare la spugna |
| Microscopio da dissezione | Nikon | SMZ800 | Injceting il |
| Dox Doxorubicina cloridrato | Sigma | D1515-10MG | per la creazione di modello DIC |
| Ecocardiografia | VISUAL SONICS | Vevo 3100 | misurazione della funzione cardiaca |
| Schiuma Spugna | Jaece Industries | L800-D | posizionamento del pesce |
| Hank's balanced salt solution (HBBS) | Thermo Fisher | 14025076 | Vehicle for Dox |
| Microcentrifuge | southernlabware | MyFuge/C1012 | raccoglie la soluzione Dox |
| Bilancia di precisione Torbal | AD60 | Bilancia digitale | |
| Tricaina | Argent | MS-222 | Anestetizzante pesce |
| Tubo | Eppendorf | 1,5 mL | di stoccaggio |
| software vevo LAB | FUJIFILM VISUAL SONICS | 5.6.0 | Quantificazione del cuore |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
