Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Sommario

Questo protocollo delinea i passaggi principali per ottenere embrioni di pesce privi di germi (GF) e mantenerli dalle larve fino allo stadio giovanile, compreso il campionamento e il rilevamento del loro stato di sterilità. L'uso di modelli GF con infezione è importante per comprendere il ruolo dei microbi nella salute dell'ospite.

Abstract

I pesci zebra fungono da modelli preziosi per la ricerca sulla crescita, l'immunità e il microbiota intestinale grazie alle loro somiglianze genomiche con i mammiferi, agli embrioni trasparenti sviluppati in un ambiente corionico relativamente pulito e allo sviluppo estremamente rapido delle larve rispetto ai modelli di roditori. Il pesce zebra privo di germi (Danio rerio) è fondamentale per valutare la tossicità degli inquinanti e stabilire modelli di malattie simili a quelle umane correlate alle funzioni microbiche. Rispetto ai modelli allevati in modo convenzionale (CR) (pesci in allevamento comune), il pesce zebra GF consente una manipolazione più accurata del microbiota dell'ospite, aiutando a determinare la relazione causale tra microrganismi e ospiti. Di conseguenza, svolgono un ruolo fondamentale nel far progredire la nostra comprensione di queste relazioni. Tuttavia, i modelli di pesce zebra GF sono tipicamente generati e studiati durante le prime fasi di vita (dagli embrioni alle larve) a causa delle limitazioni nella funzione immunitaria e nell'assorbimento dei nutrienti. Questo studio ottimizza la generazione, il mantenimento e l'identificazione dei primi modelli di pesce zebra GF senza alimentazione e con alimentazione a lungo termine utilizzando alimenti GF (come Artemia sp., artemia salina). Durante tutto il processo, sono stati eseguiti campionamenti e colture giornalieri e identificati attraverso rilevamenti multipli, tra cui piastre e sequenziamento dell'rRNA 16S. Sono stati registrati il tasso asettico, la sopravvivenza e gli indici di sviluppo del pesce zebra GF per garantire la qualità e la quantità dei modelli generati. È importante sottolineare che questo studio fornisce dettagli sull'isolamento batterico e sulle tecniche di infezione per i pesci GF, consentendo la creazione efficiente di modelli di pesci GF dalle larve agli stadi giovanili con supporto alimentare GF. Applicando queste procedure nella ricerca biomedica, gli scienziati possono comprendere meglio le relazioni tra le funzioni batteriche intestinali e la salute dell'ospite.

Introduzione

Il microbiota (cioè Archaea, Batteri, Eucarya e virus) svolge un ruolo cruciale nel mantenimento della salute dell'ospite e contribuisce allo sviluppo di varie malattie influenzando i processi fisiologici e patologici attraverso interazioni simbiotiche all'interno della barriera intestinale, della superficie epiteliale e delle funzioni della mucina negli individui ^1,2,3. La composizione del microbiota nelle diverse fasi della vita, dall'infanzia alla giovinezza, all'età adulta e all'invecchiamento, nonché la sua presenza in vari luoghi come narici, siti orali, cutanei e intestinali, è modellata dinamicamente da diversi habitat e ambienti⁴. Il microbiota intestinale negli organismi è coinvolto nell'assorbimento dei nutrienti, nella risposta immunitaria, nell'invasione dei patogeni, nella regolazione metabolica, ecc. ^5,6. Studi su pazienti hanno dimostrato che le interruzioni del microbiota intestinale sono correlate all'obesità umana, ai disturbi del sonno, alla depressione, alle malattie infiammatorie intestinali (IBD), alle malattie neurodegenerative (Parkinson, Alzheimer), all'invecchiamento e a vari tipi di cancro ^7,8,9. Inoltre, i percorsi interattivi tra il microbiota intestinale e gli ospiti coinvolgono fattori infiammatori, neurotrasmettitori, metaboliti, barriera intestinale e stress ossidativo, come osservato in precedenti ricerche utilizzando modelli di topi e pesci^10,11.

Recentemente, sono stati esplorati diversi approcci o terapie correlate ai batteri, inclusi potenziali probiotici e trapianto di microbiota fecale (FMT), per questi disturbi in modelli clinici e animali. Queste esplorazioni si basano su scoperte relative all'asse microbiota-intestino-cervello/fegato/rene, ai prodotti derivati dal microbiota e all'alterazione dell'attività dei recettori^12,13. Tuttavia, lo sviluppo, le varie funzioni e i meccanismi del sistema microbiota-ospite sono ancora incompleti e identificati a causa della complessità della comunità microbica e della sfida di generare potenti modelli di malattia simili a quelli umani.

Per affrontare questi problemi, a metà del^{XIX secolo furono} proposti con urgenza modelli animali privi di germi (GF) e sviluppati principalmente nel corso del XX^secolo. I successivi perfezionamenti, compresi i modelli trattati con antibiotici e gnotobiotici, insieme ai progressi nelle tecnologie di rilevamento e osservazione microbica, hanno ulteriormente perfezionato questi modelli 14,15,16. Gli animali GF, creati cancellando il proprio background ed evitando i microbi ambientali, offrono un'eccellente strategia per esplorare le interazioni tra i microrganismi e i loro ospiti¹⁷. Attraverso l'applicazione di modelli animali e protocolli raffinati, i ricercatori hanno replicato con successo composizioni microbiche simili trovate nei pazienti nei topi e nei pesci GF. Inoltre, altri modelli animali GF, come cani, polli e maiali, forniscono diverse opzioni come soggetti di ricerca 18,19,20,21. Questo approccio ha permesso di studiare i potenziali effetti terapeutici dei microbiomi commensali su varie malattie, tra cui l'immunoterapia del cancro nell'uomo^16,18. I modelli GF offrono informazioni più accurate sulle caratteristiche e sui meccanismi di specifica colonizzazione, migrazione, moltiplicazione e interazione batterica all'interno degli ospiti. Ciò fornisce nuove informazioni cruciali sull'insorgenza e lo sviluppo di malattie correlate al microbiota^22,23. La storia della creazione e dell'applicazione del pesce zebra GF nella ricerca microbica si è evoluta dai rapporti di Rawls et al. nel 2004 e Bates et al. nel 2006 al protocollo di Melancon et al. nel 2017 16,24,25. Tuttavia, la fattibilità di modelli GF adulti o riproduttori è ancora un processo prolungato, accompagnato da longevità, tassi di successo e problemi di salute variabili.

Tra i vari modelli animali, il pesce zebra (Danio rerio) si distingue come uno strumento fondamentale sia per la ricerca di base che per quella biomedica grazie alla sua vantaggiosa somiglianza con gli organi umani e la genomica, il breve ciclo di sviluppo, l'elevata fecondità e gli embrioni trasparenti^19,26. I pesci zebra, che fungono da modelli affidabili di malattie umane, offrono una rappresentazione visiva dei processi fisiologici e patologici in vivo, fornendo informazioni sulle caratteristiche interessanti delle interazioni ospite-microbo. In particolare, il pesce zebra mostra linee cellulari distinte, consentendo l'imaging della fisiologia intestinale, della dinamica microbica, delle gonadi e dello sviluppo riproduttivo, della maturazione del sistema immunitario dell'ospite, del comportamento e del metabolismo²⁷. Gli embrioni di pesce zebra si sviluppano all'interno di corioni protettivi fino alla schiusa, diventando larve a 3 giorni dopo la fecondazione (dpf). Cercano attivamente cibo a 5 dpf e raggiungono la maturità sessuale circa 3 mesi dopo la fecondazione (mpf)²⁸. Il primo pesce zebra privo di germi (GF) di successo, riportato da Rawls et ^al.24, ha mostrato che le larve alimentate con mangime autoclavato dopo l'assorbimento del tuorlo mostravano necrosi tissutale da 8 dpf e morte totale a 20 dpf. Ciò ha indicato gli effetti della dieta o l'importanza di considerare l'apporto di nutrienti esogeni negli esperimenti che coinvolgono pesci GF a lungo termine (>7 dpf)²⁹. Studi successivi hanno migliorato il protocollo di generazione dei pesci GF, impiegando cibo sterile e metodi perfezionati in diversi modelli di pesce¹⁶.

Tuttavia, la maggior parte della ricerca sui modelli di pesce zebra GF si è concentrata sulle prime fasi di vita, che coinvolgono l'infezione batterica a 5 dpf per 24-48 ore, con campioni raccolti prima di 7 dpf alla conclusione degli esperimenti 25,30,31. È ampiamente riconosciuto che il microbiota negli organismi, compresi gli esseri umani e il pesce zebra, è colonizzato all'inizio della vita e modellato durante la crescita e lo sviluppo. La composizione rimane stabile negli stadi adulti, con i ruoli del microbiota nell'ospite cruciali per tutta la vita, specialmente negli aspetti dell'invecchiamento, dell'obesità neurodegenerativa e metabolica e delle malattie intestinali³. Pertanto, le prospettive degli animali GF con sopravvivenza più lunga possono fornire informazioni sui meccanismi dei ruoli microbici nello sviluppo e nelle funzioni degli organi ospiti, considerando i sistemi immunitari e riproduttivi immaturi delle larve di pesce nei primi anni di vita. Mentre i ceppi batterici nell'intestino del pesce zebra sono stati isolati e identificati in studi precedenti, offrendo il potenziale per infettare i modelli animali GF per selezionare probiotici o ricercare funzioni batteriche nell'ospite^19,25, la generazione e l'applicazione di modelli di pesce GF sono state principalmente limitate alle prime fasi della vita. Questa limitazione, attribuita al complesso processo di produzione, agli elevati costi di manutenzione e ai problemi associati al cibo e all'immunità, ostacola gli sforzi di ricerca volti a studiare gli effetti dello sviluppo e cronici del microbiota nell'ospite.

Il tasso di sopravvivenza, il comportamento, la crescita, la maturazione e la salute generale dei pesci, specialmente nei modelli privi di germi (GF), sono significativamente influenzati dalle pratiche alimentari, che comprendono l'assunzione e l'assorbimento del nutrimento durante il periodo di apertura della bocca dalle prime larve ai giovani^32,33. Tuttavia, una delle sfide nell'allevamento di pesci GF è la scarsità di diete sterili adeguate, che limita l'efficacia del supporto nutrizionale per sostenere la crescita e la sopravvivenza delle larve. Risolvere questo problema è fondamentale per ripristinare la vita dei pesci GF, considerando i loro meccanismi di difesa dello sviluppo e le deboli capacità di digestione dovute all'assenza di un microbioma intestinale. In termini di cibo, i gamberetti in salamoia vivi (Artemia sp.) emergono come la dieta più adatta per le larve a bocca aperta e per i pesci giovani. È stato osservato che i pesci nutriti con artemia salina vivi mostrano tassi di crescita e sopravvivenza più elevati rispetto a quelli alimentati con tuorlo d'uovo cotto o altre esche naturali e sintetiche³⁴. Mentre i modelli di vita precoce dei pesci GF possono sopravvivere con il supporto del tuorlo e i modelli di larve GF possono essere mantenuti con l'alimentazione sterile, la generazione di modelli a lungo termine dalle larve ai giovani e il raggiungimento della maturità sessuale rimane una sfida. Inoltre, il cibo in scaglie o in polvere è limitato da una composizione nutrizionale ineguale e può influire sulla qualità dell'acqua. Al contrario, l'artemia viva presenta vantaggi come la sopravvivenza sia in acqua salata che in acqua dolce, dimensioni ridotte adatte alle larve agli adulti, facilità di dosaggio e maggiore qualità di schiusa³⁵. Basandoci sui metodi precedenti 16,24,30, abbiamo semplificato il complesso processo di trattamento e affrontato la sfida della dieta stabilendo Artemia sp. GF viva facilmente incubata come alimento sterile per periodi più lunghi rispetto ai pesci GF all'inizio della vita.

Questo studio presenta un protocollo ottimizzato che copre (1) generazione, (2) mantenimento, (3) identificazione del tasso di sterilità e (4) mantenimento e alimentazione per garantire la crescita di zebrafish privo di germi (GF) dagli embrioni alle larve e agli stadi giovanili. I risultati offrono prove preliminari sulla schiusa, la sopravvivenza, la crescita e la sterilità del pesce zebra GF, insieme agli indici essenziali per GF Artemia sp. come alimento sterile. Le fasi dettagliate nella generazione del modello e nella preparazione di alimenti vivi sterili forniscono un supporto tecnico cruciale per la costruzione e l'applicazione di modelli di pesce GF a lungo termine, nonché GF Artemia sp. nella ricerca sull'interazione microbiota-ospite. Il protocollo affronta l'isolamento, l'identificazione e l'infezione batterica su modelli di pesci GF, delineando metodi per l'etichettatura della fluorescenza batterica e osservando la loro colonizzazione nell'intestino dei pesci al microscopio. I pesci GF, i pesci gnotobiotici con infezione batterica o i modelli di microbiota umano trasferiti saranno sottoposti a vari rilevamenti per chiarire le loro funzioni ed effetti sull'immunità dell'ospite, sulla digestione, sul comportamento, sulla regolazione trascrittomica e sugli aspetti metabolici. A lungo termine, questo protocollo può essere esteso a diverse specie ittiche selvatiche, come il medaka marino, e potenzialmente ad altre linee di pesce zebra transgenico selezionate correlate a tessuti o malattie specifici.

Protocollo

Gli esperimenti sui pesci sono stati condotti in conformità con le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali di Chongqing e del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università medica di Chongqing, in Cina, nonché con gli standard per gli animali da esperimento emessi dall'Ufficio statale per la qualità e la supervisione tecnica (ID approvazione: da GB14922-2001 a GBT14927-2001). Il pesce zebra (Danio rerio, wild type, ceppo AB) è stato acquistato dall'Istituto di idrobiologia dell'Accademia cinese delle scienze e mantenuto in laboratorio seguendo le procedure precedentemente riportate³⁶.

1. Mantenimento del pesce zebra adulto e raccolta di embrioni

NOTA: Attingendo alle modifiche apportate a studi e rapporti precedenti 16,37,38,39, il mantenimento del pesce zebra adulto, l'allevamento delle larve e le pratiche per i modelli privi di germi (GF) nel nostro laboratorio sono stati eseguiti seguendo i passaggi descritti di seguito. Il sistema di flusso ultrapuro per l'allevamento ittico è stato ottenuto commercialmente (vedi Tabella dei materiali). L'acqua, mantenuta con un pH bilanciato, sale e alcali, viene sottoposta a filtrazione durante il ciclo per garantire condizioni di pulizia.

1. Mantenere i pesci adulti con la seguente procedura standard nel sistema a ciclo automatico (vedi Tabella dei materiali) con un fotoperiodo al buio: luce = 10 h: 14 h a 28 °C ± 0,5 °C e nutriti con Artemia sp fresca incubata. due volte al giorno.
2. Metti il pesce zebra adulto sessualmente maturo (maschio: femmina = 2:1) in vasche con acqua fresca e pulita la sera prima.
3. Lascia che i pesci depongano le uova la mattina successiva (circa 8:30) sotto una regolare stimolazione luminosa in laboratorio. Dopo 1-2 ore, trasferire il pesce in un'altra vasca.
4. Raccogli gli embrioni nell'acqua dal sistema di autoriciclaggio come terreno di coltura in un piatto di coltura utilizzando una pipetta Pasteur usa e getta.

2. Generazione di pesce zebra GF da embrioni a larve

NOTA: La procedura per la generazione di pesci privi di germi (GF) è delineata nella Figura 1, mentre gli indici di sviluppo di base dei modelli convenzionali (CR) e GF sono presentati nella Figura 1 supplementare. Si prega di seguire i passaggi descritti di seguito in una cappa di sicurezza biologica da banco o in una cappa a flusso laminare utilizzando una tecnica asettica sterile in una camera bianca.

1. Lavare gli embrioni utilizzando l'acqua di coltura dei pesci e rimuovere le feci, le impurità e le uova morte o non fecondate.
2. Trasferire gli embrioni a 2 hpf in piastre sterilizzate (fino a 480 embrioni per piatto sterile con un diametro di 10 cm) riempite con una soluzione di terreno antibiotico privo di germi di zebrafish (AB-GZM, vedi Tabella dei materiali) e coltura a 28,5 °C per 6-8 ore.
   NOTA: AB-GZM viene utilizzato per trattare gli embrioni per diverse ore per eliminare i microrganismi superficiali e GZM senza antibiotici viene utilizzato per allevare pesci GF in successione. Di solito, il tempo di coltura perfezionato è di 6 ore).
3. Escludere le uova con macchie bianche o aspetto biancastro e selezionare quelle che sono normalmente sviluppate, mostrando buste trasparenti e intatte per un'ulteriore lavorazione.
4. Sciacquare gli embrioni con AB-GZM tre volte entro 10 minuti.
5. Immergere gli embrioni in una soluzione di iodio povidone 0,2 g/L (PVP-I) per 1 minuto (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: Una concentrazione più elevata e più lunga di 2 minuti influenzerà la morte e il tasso di schiusa degli embrioni.
6. Lavare gli embrioni utilizzando un terreno di coltura zebrafish privo di germi (GZM) tre volte entro 10 minuti.
7. Aggiungere gli embrioni nella soluzione di lavoro con ipoclorito di sodio (NaClO), coprire bene le provette da microcentrifuga da 50 ml e candegginare per 15 minuti. Durante questo periodo, sospendere gli embrioni in una soluzione di candeggina scuotendoli delicatamente.
8. Lavare gli embrioni con GZM tre volte entro 10 minuti.
9. Trasferire gli embrioni in piastre sterili a 6 pozzetti con 5 embrioni e 10 ml di GZM per pozzetto. Coltivarli in una piattaforma ultra-pulita o in un'incubatrice con un fotoperiodo di buio: luce = 10 h: 14 h a 28 °C ± 0,5 °C.La densità di coltura influenzerà il tasso di sterilità.
10. Rinnovare quotidianamente il terreno di coltura rimuovendo il GZM esaurito, raccogliendolo come campioni per il rilevamento dello stato sterile e riempiendo ogni pozzetto con lo stesso volume di GZM sterile.
11. Registrare gli indici di sviluppo di base degli embrioni/larve GF, inclusi il tasso di sopravvivenza, il tasso di schiusa, i battiti cardiaci, la lunghezza e il peso corporeo, ecc.¹⁹.
12. Trasferire il pesce GF in contenitori adatti (piatti, fiasche per colture cellulari o bottiglie di vetro con coperchio) con volume espanso, fornendo cibo sterile durante tutto il processo di crescita.

3. Mantenimento del pesce zebra GF dalle larve al novellame

1. Rinnovare il GZM senza nutrirlo prima di 7 dpf e rilevare quotidianamente gli stati sterili (vedere il passaggio 5).
2. Somministrare le larve di pesce zebra da 8 dpf agli stadi giovanili con tuorlo d'uovo sterile (10 μL di soluzione madre preparata per pozzetto) una volta al giorno prima di cambiare GZM.
3. Nutrire i giovani GF da 14 dpf con tuorlo d'uovo sterilizzato mescolato con GF Artemia sp. una volta al giorno (1-3 Artemia/larve, vedi passaggio 4), aumentando gradualmente la massa alimentare con la crescita e lo sviluppo dei pesci GF.
4. Fornire tuorlo d'uovo fino a quando tutti i pesci possono consumare naupli di Artemia.
   NOTA: GF Artemia deve essere sottoposto a test di sterilità prima dell'uso. Valuta il numero di naupli di Artemia rimasti, osserva i progressi nell'inseguimento e nella cattura ed esamina il corpo del pesce con il cibo consumato per indicare il successo dell'alimentazione.
5. Da 28 dpf alle prime fasi adulte, somministrare GF Artemia una volta al giorno (3-5 Artemia/larve) e pulire l'Artemia non sfruttata o morta e i pesci morti nei rifiuti GZM come campioni giornalieri.
6. Durante la crescita dei pesci GF, sostituire le piastre a 6 pozzetti dopo 7 dpf con piastre sterili o fiasche per colture cellulari da 8 a 21 dpf e quindi con bottiglie sterili dopo 21 dpf. Aumentare il terreno di coltura e la massa alimentare in base al numero e al peso dei pesci GF in ciascun contenitore.
7. Rinnova GZM quotidianamente e controlla i campioni per garantire il successo dei modelli GF.
   NOTA: Mantenere modelli di pesci privi di germi (GF) fino alla prima età adulta e alla maturità sessuale è impegnativo, con un basso tasso di sopravvivenza medio a 30 dpf, in genere inferiore al 10%. Ciò è principalmente attribuito a un'immunità debole, a uno sviluppo ritardato e a una funzione intestinale compromessa.

4. Preparazione dei naupli di GF Artemia come mangime sterile per modelli di pesci GF cronici

NOTA: Il metodo di coltivazione e preparazione dell'artemia priva di germi (GF) è delineato nella Figura 2. Si noti che tutte le seguenti fasi sono condotte in una cabina di sicurezza biologica da banco, utilizzando una tecnica asettica sterile.

1. Sciacquare 0,25 g di cisti di artemia con 2,4 g/L di ipoclorito di sodio (NaClO, vedi Tabella dei materiali) per 5 minuti.
2. Filtrare le cisti di Artemia risciacquate con un filtro ultra-denso sterilizzato (circa 170 maglie di apertura) e lavare con acqua ultrapura sterilizzata tre volte, ogni volta per 1-2 minuti.
3. Trasferire le cisti di Artemia lavate in 100 ml di acqua salina sterilizzata al 2,5%, mescolare e confezionare per la schiusa asettica secondo i passaggi indicati di seguito.
4. Confezionare la soluzione di miscela di cisti di artemia trattata con 50 ml in un flacone sterile con un volume di 100 ml, sigillarlo con pellicola e incubare in un incubatore agitatore a 150 giri/min, 30 °C per 18 ore a 24 ore con luce.
5. Estrarre circa 30 ml di naupli di Artemia da schiusa dagli strati intermedio e inferiore utilizzando una pipetta Pasteur monouso.
   NOTA: Evitare che le uova galleggianti e i gusci vuoti raggiungano lo strato superiore. Gli indici delle cisti e dei naupli di Artemia privi di germi (GF) incubati per 24 ore sono presentati nella Figura 3.
6. Filtrare le artemie con un filtro sterilizzante e lavarle in un bicchiere sterilizzante con acqua ultrapura sterilizzante tre volte, da circa 30 s a 1 minuto per ogni volta. Infine, aggiungere 4 ml di acqua ultrapura sterilizzata per preparare la soluzione miscelata di Artemia .
7. Utilizzando una pipetta Pasteur monouso, recuperare l'Artemia che nuota attivamente dallo strato superiore, lavare e preparare la soluzione di naupli per l'alimentazione e l'identificazione asettica.

5. Identificazione di modelli di pesce GF in tutte le fasi di vita

NOTA: Durante l'intera fase di vita dei pesci privi di germi (GF), gli indici chiave e i rilevamenti giornalieri dei campioni sono fondamentali per garantire il successo dei modelli. Questo passaggio riassume la classificazione comune dei campioni e i metodi usuali per l'identificazione (Figura 4).

1. Osservare e contare quotidianamente lo stato di sopravvivenza e il tasso di larve di pesce zebra GF. Negli esperimenti che calcolano i tassi correlati, i pesci GF vengono allevati in piastre da 24 o 48 pozzetti con un pesce per pozzetto.
   1. Tasso di sopravvivenza = (numero di pesci vivi al momento dell'osservazione / numero totale di uova) × 100%.
   2. Tasso di sterilità = (numero di pesci sterili/numero di pesci sopravvissuti) × 100%.
      NOTA: Questo protocollo si concentra sul tasso di sterilità dei pesci vivi. Il numero di pesci sterili è determinato contando i pesci GF riusciti dopo molteplici controlli tra i pesci vivi. Eventuali modelli GF di pesci morti o pesci vivi che hanno fallito a causa della presenza batterica vengono eliminati durante le successive procedure di GF.
2. Raccogli i seguenti campioni di larve di pesce zebra GF.
   1. Terreno di coltura di pesce zebra GF da ogni pozzetto o contenitore bottiglia.
   2. Cibo per pesci, come tuorlo d'uovo sterile e GF Artemia.
   3. Terreno di scarto, compresi frammenti di membrana dell'uovo dopo la schiusa e residui di cibo o feci durante i periodi di alimentazione dalle larve al novellame.
   4. Campioni di pesce morto per identificare la presenza di batteri.
   5. Terreno di coltura e agenti utilizzati nel trattamento degli embrioni come controllo sterile.
   6. Campioni di materiali, piattaforma operativa e incubatore, ecc.
3. Rileva i campioni raccolti quotidianamente utilizzando più metodi.
   1. Per prima cosa, utilizzare il metodo della piastra di diffusione e le piastre di coltura in un incubatore a 30 °C.
      1. Rivestire con 20-50 μl di campione di terreno di scarto sulla piastra Trypticase Soy Agar (TSA) (vedi Tabella dei materiali) in condizioni aerobiche.
      2. Rivestire con 20-50 μl di campione di terreno di scarto sulla piastra TSA in condizioni anaerobiche.
      3. Rivestire con 20-50 μl di campione di terreno di scarto sulle piastre TSA del sangue (vedere Tabella dei materiali) in condizioni aerobiche.
      4. Rivestire con 20-50 μl di campione di terreno di scarto sulle piastre TSA del sangue in condizioni anaerobiche.
   2. In secondo luogo, utilizzare il metodo della coltura liquida.
      1. Prelevare 200 μl di campione in provette aerobiche con il terreno di infusione del cuore cerebrale (BHI) (vedere la tabella dei materiali) e la coltura nell'incubatore di agitazione a 30 °C, 150-180 giri/min.
      2. Aggiungere 200 μl di campione in provette anaerobiche con terreno BHI e coltura nell'incubatore a 30 °C.
      3. Aggiungere 200 μl di campione in provette aerobiche con terreno di brodo di soia tripticasi (TSB), quindi coltivare nell'incubatore di agitazione a 30 °C, 150-180 giri/min.
      4. Aggiungere 200 μl di campione in provette anaerobiche con terreno TSB e coltura nell'incubatore a 30 °C.
   3. In terzo luogo, utilizzare tecniche molecolari: test di reazione a catena della polimerasi (PCR) 16s.
      1. Analizzare il campione di acque reflue con due coppie di primer 27F e 1492R, nonché 63F e 1387R (Tabella 1).
         NOTA: La miscela master PCR è stata preparata secondo la Tabella 2 utilizzando un kit di DNA polimerasi disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) e la macchina PCR è stata configurata con il programma specificato nella Tabella 3.
      2. Al termine del programma PCR, esaminare i prodotti mediante elettroforesi su gel di agarosio^{all'1% 40} in bande target di 1465 bp (utilizzando i primer 27F e 1492R) o 1324 bp (utilizzando i primer 63F e 1387R) per dedurre la sterilità dei campioni.
4. Registrare e osservare i test di sterilità, comprese le colture su piastra e terreno da 24 ore a 3 giorni e 7 giorni, durante i quali nessuna colonia su piastre e nessuna torbidità nel liquido indicano il successo della costruzione dei modelli GF. Osservare e registrare la lastra e il mezzo a 24 ore, 48 ore, 72 ore, 96 ore, 120 ore, 144 ore e 168 ore.

6. Identificazione dei campioni di GF Artemia prima di nutrirsi con pesci GF

NOTA: Per rilevare i campioni di artemia GF, che sono indispensabili come cibo vivo prima di nutrirsi con pesci GF (Figura 4), seguire i passaggi seguenti.

1. Raccogliere campioni di modelli GF Artemia .
   1. Cisti di artemia non trattate.
   2. Cisti di artemia GF trattate.
   3. Naupli di Artemia GF schiusa.
   4. Acqua ultrapura sterilizzata come controllo.
2. Rilevare GF Artemia con i seguenti metodi.
   1. Utilizzare il metodo della piastra di diffusione per rilevare i campioni rivestendoli su piastre TSA e piastre TSA di sangue in condizioni aerobiche e anaerobiche. Incubarli a 30 °C.
   2. Utilizzare un mezzo liquido per rilevare i campioni nelle provette aerobiche e anaerobiche TSB e BHI. Coltura in agitatore a 150-180 giri/min, 30 °C.
   3. Utilizzare il test PCR per rilevare la presenza di batteri nei campioni raccolti utilizzando i primer dei geni bersaglio dell'RNA ribosomiale 16s 27F e 1492R, 63F e 1387R (Tabella 1). Il volume e il programma sono mostrati nella Tabella 2 e nella Tabella 3.
3. Registrare i risultati: rilevare il prodotto della PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio^{all'1% 40} per bande target che misurano 1465 bp (utilizzando i primer 27F e 1492R) o 1324 bp (utilizzando i primer 63F e 1387R). I risultati delle piastre e del mezzo liquido possono garantire lo stato sterile di GF Artemia prima di essere utilizzato come mangime per pesci GF.

7. Isolamento e identificazione di ceppi batterici intestinali da zebrafish

NOTA: Per esplorare le funzioni intestinali in vitro e in vivo, è necessario isolare i ceppi batterici del pesce zebra, che forniscono anche la fonte di specie per potenziali probiotici sottoposti a screening per infezione utilizzando animali GF (Figura 5). In questo protocollo, descriviamo il metodo di dissezione tradizionale per ottenere contenuti intestinali, mentre i campioni possono anche essere raccolti direttamente da pesci vivi anestetizzati (dati non mostrati).

1. Scegli pesci zebra adulti sani e lavali con acqua sterile. Eseguire i seguenti passaggi nel banco pulito.
2. Anestetizzare il pesce con 100 mg/L MS-222 per 5-10 minuti.
3. Usa il 75% di alcol per trattare la superficie corporea del pesce.
4. Sezionare l'intestino del pesce ed estrudere il contenuto intestinale con TSB o BHI medium.
5. Incubare il surnatante intestinale applicando TSA, piastra sanguigna, TSB e terreno BHI in condizioni aerobiche e anaerobiche.
6. Tradurre i batteri per ottenere il ceppo del segnale e registrare le caratteristiche delle diverse colonie.
7. Conservare i batteri entro il 30% di glicerolo a -80 °C.
8. Quindi, identifica i batteri intestinali mediante estrazione del DNA genomico e sequenziamento PCR.
   NOTA: Le fasi principali dell'estrazione del DNA genomico batterico includono la centrifugazione liquida, la dissociazione della RNasi A e della proteasi K, l'estrazione dell'alcol etilico, il risciacquo e la dissoluzione utilizzando kit disponibili in commercio seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
9. Analizzare le sequenze 16S utilizzando il National Center for Biotechnology Information (NCBI) e il Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) con il database Bacteria and Archaea^40,41 (vedi Tabella dei materiali).
10. Scegli i batteri e i caratteri meglio abbinati per identificare i ceppi intestinali isolati a livello di genere.
11. Rilevare le funzioni metaboliche dei ceppi batterici utilizzando kit disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali).

8. Marcatura dell'influenza, infezione e colonizzazione dei batteri nell'intestino del pesce zebra GF

NOTA: Prima di infettare GF zebrafish, i batteri isolati sono stati modificati con coloranti e contati, rendendo la colonizzazione e la migrazione microbica visibili in modo continuo e in vivo (Figura 6).

1. Scegli potenziali batteri benefici o ceppi dominanti con elevata abbondanza nell'ospite per infettare i modelli di pesci GF.
   NOTA: I batteri utilizzati in questo studio erano Aeromonas sp. e Vibrio sp. (vedi Tabella dei materiali), selezionati tra gli 8 generi che sono stati isolati e identificati da pesci zebra adulti di tipo selvatico in laboratorio⁴².
2. Etichettare i batteri freschi con coloranti CM-Dil (vedi Tabella dei materiali) ed esporli a GF zebrafish a 5 dpf con una concentrazione di 10^{6-10 8} unità formanti colonie (CFU)/mL.
3. Osservare la fluorescenza al microscopio a fluorescenza con ingrandimento di 3× per indicare la colonizzazione e la distribuzione dei batteri nell'intestino delle larve di pesce zebra GF da 6 dpf e 14 dpf.
4. Contare manualmente il numero di batteri nei pesci GF mediante coltura su piastra in ogni momento.
5. Rileva le colonie e le sequenze per garantire che l'infezione abbia avuto successo con i ceppi batterici bersaglio.
6. Raccogliere campioni di pesci GF con infezione batterica per i successivi saggi, inclusi neuro-comportamenti, indici di sviluppo, analisi istopatologiche e misurazioni ormonali, ecc. 43,44,45.
   NOTA: I batteri utilizzati nell'esperimento di infezione devono essere nuovamente recuperati e appena coltivati dal mezzo liquido.

Risultati

I modelli GF zebrafish possono essere prodotti in modo efficiente utilizzando le abbondanti uova deposte dalle coppie di zebrafish, con il protocollo ottimizzato sulla base dei precedenti modelli di pesce GF³⁵. Una singola piastra a 6 pozzetti può coltivare circa 30-48 embrioni/larve, consentendo un'ampia raccolta di dati e analisi statistiche. Dopo il trattamento sterile, gli embrioni GF vengono coltivati in un'incubatrice pulita fino alla schiusa in larve a 48-72 ore e cambiati GZM ogni giorno con il rilevamento dei campioni raccolti, che è fondamentale per mantenere lo stato privo di germi (Figura 1). Dopo 7 dpf, il cibo di tuorlo d'uovo e artemia viva dovrebbe essere preparato per le larve fino agli stadi giovanili. Durante la crescita e lo sviluppo dei pesci, il volume, il contenitore e la densità di GZM devono essere regolati o modificati in tempo per evitare la morte e il fallimento dello stato di sterilità. Se il rilevamento non mostra inquinamento batterico, i modelli GF di successo possono essere mantenuti come cronici dall'età giovanile alla prima età adulta, ma il tasso di sopravvivenza è molto più basso nella pratica. Infine, è possibile misurare il tasso di sterilità, il tasso di sopravvivenza, l'indice di sviluppo, il comportamento, l'analisi istopatologica e il profilo di trascrizione dei modelli di pesci GF e CR per esplorare l'influenza del microbiota e dei campi di screening farmacologico. In questo studio, sono stati confrontati i principali indici di sviluppo (Figura supplementare 1) e il tasso di schiusa dei pesci GF era inferiore del 45,7% rispetto ai pesci CR, con il 60% a 72 hpf. La frequenza cardiaca delle larve GF a 7 dpf era significativamente più bassa a 18,2 battiti/10 s rispetto ai pesci CR con 22,6 battiti/10 s, ma non c'era differenza tra i due gruppi a 14 dpf con frequenze di 23,5-23,8 battiti/10 s. Il tasso di sopravvivenza dei pesci GF a 7 dpf era lo stesso dei pesci CR all'86,7%, ma è diminuito al 60% a 14 dpf rispetto all'80% dei pesci CR. Tuttavia, i tassi di sopravvivenza dei pesci GF e CR sono diminuiti al 25%-10% dopo il periodo di apertura della bocca quando hanno acquisito capacità o abitudini alimentari. L'incapacità di mantenere lo stato sterile dei pesci è stata una delle ragioni del basso tasso di sopravvivenza. Pertanto, l'alimentazione e il mantenimento dei nutrienti dalla fase giovanile a quella della prima età adulta sono sfide critiche nell'allevamento ittico.

Un altro fattore chiave che influenza la crescita e lo sviluppo dei pesci è l'alimentazione. In questo studio, esploriamo diversi metodi per ottenere GF Artemia come cibo vivo per larve di pesce zebra GF a lungo termine per giovani e adulti (processo mostrato nella Figura 2). A causa dell'uso quotidiano di mangime per pesci GF, il protocollo ottimizzato per GF Artemia dovrebbe essere facile, veloce ed economico nella pratica. Dopo aver confrontato il movimento attivo e la morte/immobilità dei naupli osservati al microscopio, le caratteristiche dei naupli, le uova non schiuse e il guscio, il metodo viene perfezionato. Dopo l'incubazione giornaliera, sono stati osservati e misurati al microscopio gli indici di GF Artemia fresca ottenuti dalle bottiglie, tra cui il tasso di schiusa, sopravvivenza e deformità, la lunghezza e il peso dei naupli (Figura 3). Dopo il trattamento, il tasso di schiusa delle cisti di Artemia era elevato, con una media dell'88,15%, la sopravvivenza dei naupli nuotatori era del 77,83% e il tasso di malformazione era dell'1,87%. La lunghezza del corpo dei naupli era di 546,70 μm e l'indice di peso corporeo era di 3,80 mg/100, che sono adatti per la cattura e l'alimentazione dei pesci dal periodo di apertura del mese delle larve agli stadi giovanili e adulti.

Il rilevamento di GF fish e GF Artemia è importante anche per il mantenimento del modello. In base alla raccolta del campione e ai molteplici metodi di test, i risultati possono fornire il successo degli embrioni di zebrafish trattati e delle cisti di Artemia nella piastra coltivata e nel terreno liquido (Figura 4). I vari campioni raccolti giornalmente devono essere rilevati come sterili in tutti i metodi di prova, che possono quindi indicare i modelli GF al momento della raccolta. L'artemia GF deve essere rilevata prima di nutrirsi con pesci GF, oppure i risultati della piastra e dell'incubatrice media devono riferirsi allo stato sterile dei naupli vivi freschi. Cioè, coltivare GF Artemia da cisti su piastre TSA o vetro medio liquido TSB o BHI in incubazione con agitazione, che potrebbe essere utilizzato per generare GF Artemia e verifica sterile allo stesso tempo. Il protocollo GF Artemia può ospitare un numero limitato di larve per l'alimentazione. Durante il processo di alimentazione, era evidente che la GF Artemia nuotava all'interno del GZM e poi veniva catturata e consumata dalle larve di pesce GF.

Le applicazioni dei modelli di pesce GF coinvolgono vari campi della biologia e della medicina, consentendo lo studio delle funzioni microbiche, della crescita e dello sviluppo, dei meccanismi della malattia e dello screening di probiotici o farmaci, tra gli altri⁴⁶. In questo studio, ad esempio, due importanti batteri intestinali, Aeromonas sp. e Vibrio sp., sono stati isolati dal pesce zebra. Sono state eseguite le caratteristiche e l'identificazione della colonia e sono state misurate molteplici funzioni metaboliche in vitro utilizzando kit disponibili in commercio (Figura 5). Questi batteri sono stati isolati e identificati con il sequenziamento 16S e i risultati dell'esplosione sono stati presentati in un precedente rapporto⁴². I ceppi batterici identificati consentono la ricerca scientifica sull'impatto del microbiota singolo o combinato sulla salute dell'ospite infettando i modelli di pesci GF. La trasparenza delle larve di pesce consente l'osservazione di cellule batteriche marcate con fluorescenza utilizzando coloranti CM-Dil, rivelando la colonizzazione e la distribuzione nell'intestino dei pesci GF (mostrato in Figura 6). Dopo l'infezione batterica a 5 dpf, le larve di pesce zebra GF possono essere visualizzate con un microscopio a fluorescenza e osservate continuamente da 6 a 14 dpf, fornendo informazioni sulle funzioni microbiche combinate con indici di sviluppo, cambiamenti istopatologici e alterazioni molecolari⁴⁷.

Figura 1: Protocollo del pesce zebra GF dagli embrioni alle larve e ai giovani. I passaggi chiave nella generazione del pesce zebra GF includono: (1) Raccolta di embrioni da pesce zebra wild-type e posizionamento in AB-GZM. (2) Trattamento di risciacquo con agenti PVP-I e NaClO per garantire la completa sterilità. (3) Coltura di embrioni/larve GF in piastre a 6 pozzetti con GZM, rinnovando il terreno quotidianamente. (4) Regolazione delle condizioni di coltura per una crescita e uno sviluppo ottimali. (5) Campionamento in varie fasi di sviluppo, seguito da test di sterilità con metodi su piastra e mezzo liquido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Protocollo della preparazione dell'artemia GF come cibo vivo per i pesci GF. I passaggi chiave includono: (1) Trattamento di risciacquo delle cisti artemiche per la completa sterilità. (2) Preparazione di cisti GF nel terreno. (3) Incubazione in soluzione salina per 24 ore per favorire la schiusa. (4) Filtrazione della mancata schiusa e delle uova vuote per raccogliere i naupli attivi. (5) Lavaggio dei naupli raccolti per rimuovere i detriti, garantendo alimenti vivi di alta qualità e privi di contaminanti. (6) Test di sterilità dell'artemia GF prima dell'alimentazione delle larve di pesce GF. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Indici di cisti e naupli di Artemia GF incubati per 24 ore. (A) Cisti di Artemia non trattate con pellicola di impurità (barra della scala: 500 μm). (B) Cisti di artemia trattate con una superficie leggermente convessa dopo l'assorbimento d'acqua e un aspetto più pulito (barra graduata: 500 μm). (C) Esame microscopico di naupli di Artemia GF vivi appena incubati (barra della scala: 2000 μm) e (D) ingrandimento con una barra della scala di 1000 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Rilevamento sterile di pesci GF in ogni fase della vita e GF Artemia. (A) Test sterili di campioni di pesce CR e GF utilizzando terreno liquido TSB e BHI, TSA e piastre di sangue in condizioni aerobiche e anaerobiche. (B) Test sterili di cisti artemiche non trattate, cisti di artemia GF e naupli utilizzando terreno liquido TSB e BHI, TSA e piastre di sangue in condizioni aerobiche e anaerobiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Isolamento e identificazione dei batteri intestinali nel pesce zebra. (A) Ceppi batterici, caratteristiche delle colonie, mappe di sequenziamento 16S (esempi: Aeromonas sp. e Vibrio sp.). (B) Genere e accessioni NCBI. (C) Funzioni metaboliche di batteri isolati dall'intestino del pesce zebra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Infezione e colonizzazione di ceppi di batteri intestinali nel pesce zebra GF. (A) Recupero di ceppi batterici isolati e identificati per esperimenti di infezione. (B) Marcatura di batteri con coloranti fluorescenti e infezione di larve di pesce zebra GF a 5 dpf. Ingrandimento: 1x. (C) Osservazione della distribuzione e della colonizzazione dei batteri (Vibrio sp.) nei tessuti intestinali in vivo. Ingrandimento: 3x. (D) Conteggio delle CFU di batteri (Aeromonas sp. e Vibrio sp.) in ciascuna larva di pesce mediante campionamento giornaliero. I dati presenti significano ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Primer	Sequenze (5'-3')	Lunghezza del prodotto
27F	AGAGTTTGATCMTGGCTCAG	1465 punti base
1492R	ACGGYTACCTTGTTACGACTT
63F	CAGGCCTAACACATGCAAGTC	1324 punti base
1387R	GGGCGGWGTGTACAAGGC

Tabella 1: Primer utilizzati per la rilevazione batterica.

Componenti	Unità	Volume (μL)
Taq DNA polimerasi	2,5 U/μL	0.1
10× tampone (mg2+)	---	2.1
Miscela dNTP	2,5 mM	1.6
Primer 27F	10 μM	1
Primer 1492R	10 μM	1
Senza DNA/RNA H2O	---	13.2
DNA modello	---	1
Volume totale	---	20

Tabella 2: Concentrazione finale e volume dei componenti per reazione.

Passo	Temperatura	Ore	Cicli
Denaturazione iniziale	95 °C	4 minuti	--
Denaturazione	94 °C	1 minuto	35
Ricottura	55 °C	1 minuto
Estensione	72 °C	1 minuto
Estensione finale	72 °C	10 minuti	--
Tenere	4 °C	∞	--

Tabella 3: Programma PCR per l'amplificazione del gene 16S rRNA.

Figura 1 supplementare: Gli indici critici di sviluppo dei modelli di zebrafish GF e CR. (A) Il tasso di schiusa del pesce zebra CR e GF a 72 hpf, e (B) battiti cardiaci/10 s dei pesci CR e GF a 7 dpf e 14 dpf. I tassi di sopravvivenza (%) dei pesci CR e GF sono diminuiti da 7 giorni e 14 giorni con l'86%, 60%-80% a 10%-25% a 30 dpf. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

Passaggi critici all'interno dei protocolli di GF fish e preparazione del cibo GF
Durante la generazione di modelli di pesci GF, sono state coinvolte diverse fasi critiche, tra cui la preparazione di materiali sterili, la sterilizzazione degli embrioni, il rinnovo giornaliero del GZM, la raccolta di vari campioni e l'esame sterile di ciascun campione utilizzando più metodi. Tra questi passaggi, il trattamento iniziale degli embrioni è fondamentale e decisivo per il successo dei modelli GF. Gli agenti di controllo, le loro concentrazioni e i tempi di trattamento sono fondamentali per ottenere tassi di sterilizzazione ottimali e il successo della schiusa. È necessaria un'attenzione particolare quando si maneggiano embrioni di pesce GF in larve, comportando cambi giornalieri del terreno e assicurandosi che i materiali e le piattaforme siano accuratamente sterilizzati utilizzando la luce ultravioletta o in autoclave quando si rimuovono le piastre dall'incubatrice. Il monitoraggio delle condizioni di temperatura e del tempo di funzionamento durante l'inverno è essenziale per prevenire la morte larvale causata da temperature più basse nei banchi puliti.

Il tuorlo d'uovo sterile e l'artemia GF devono essere rilevati prima di essere somministrati ai pesci dopo 7 dpf per garantire il loro stato sterile per i modelli GF a lungo termine. Durante il periodo di alimentazione, la pulizia dei residui di cibo è importante come parte dei campioni raccolti per il rilevamento durante il rinnovo del mezzo di scarto. Il contenitore, il volume di GZM e la massa di cibo devono essere regolati insieme alle fasi di crescita e sviluppo per prevenire la perdita di pesci GF a causa dell'ambiente limitato e dei problemi di qualità dell'acqua. Il monitoraggio regolare e le regolazioni di questi parametri contribuiscono al mantenimento di successo dei modelli di pesce GF.

Modifiche e significato di questi protocolli
Il processo semplificato in tre fasi per la generazione di embrioni GF zebrafish, che coinvolge agenti, concentrazioni e tempi di esposizione ottimizzati delle soluzioni AB-GZM, PVP-I e NaClO, garantisce un elevato tasso di sterilità e un sano sviluppo dei modelli. Inoltre, i metodi di rilevamento sterile per i campioni giornalieri sono stati perfezionati per includere piastre e colture di terreno liquido in condizioni aerobiche e anaerobiche, insieme a tecniche molecolari che utilizzano comuni primer batterici. Ulteriori esperienze nei test per contaminanti batterici e fungini mirano a ottimizzare i contaminanti isolatori e i test sterili durante le tecniche di GF su animali⁴⁸.

Il protocollo specifico per i naupli GF Artemia come cibo vivo per modelli di pesci è stato studiato nel nostro studio e un brevetto è stato concesso a PPJ e DSP dalla China National Intellectual Property Administration (n. ZL202210482684.8). I modelli di pesce GF a lungo termine sono costantemente limitati da un'alimentazione inadeguata e inadatta, esacerbando le debolezze nelle funzioni intestinali legate alla digestione e all'assorbimento. Come fonte di cibo credibile per i modelli di medaka e zebrafish in diverse fasi di vita, GF Artemia sp. dovrebbe essere facile da preparare con una procedura semplice, un breve tempo di incubazione e un rilevamento sterile in tempo reale per l'uso quotidiano. In questo metodo, le cisti artemiche normali vengono risciacquate in una concentrazione sufficiente di NaClO per essere asettiche e quindi incubate in un flacone rivestito con film, nonché su una piastra e in un mezzo liquido per la rilevazione. Questo supporta i naupli appena nati per l'alimentazione dei pesci GF. Il tasso di sterilità e il tasso di schiusa dell'Artemia, così come la lunghezza del corpo, il peso e l'attività di, sono eccellenti, indicando le applicazioni disponibili nella pratica.

Il significato di queste modifiche nei protocolli alimentari GF fish e GF avvantaggia i ricercatori nella generazione di modelli a embrioni, larve, stadi giovanili e persino primi stadi adulti e adulti in modalità marina e d'acqua dolceμspecies. Gli animali GF a lungo termine forniranno il permesso come modelli in vivo nella ricerca sullo screening dei farmaci e sulle funzioni microbiche durante la crescita e lo sviluppo dell'ospite, in particolare nella maturità dell'immunità e delle relative linee cellulari intestinali. Ad esempio, le larve di pesce zebra possiedono un'immunità innata solo nella prima settimana, quindi sviluppano il sistema immunitario adattativo durante 7-21 dpf, insieme alla maturità del timo ^31,49. Inoltre, i modelli di pesce GF possono fornire la possibilità di analizzare le interazioni batteri-batteri e microbiota-ospite con l'osservazione dal vivo dei processi di colonizzazione e migrazione dinamica negli organismi^50,51.

Limitazioni del metodo
L'allevamento di pesci GF da giovani a primi adulti (28 dpf-2,5 mpf) e adulti sessualmente maturi (>2,5 mpf) rimane difficile a causa dell'aumento della mortalità e del rischio di contaminazione batterica durante il mantenimento del modello. Queste limitazioni derivano principalmente dall'assenza di sistemi di autocoltura adatti per i pesci che vivono in un ambiente GF. Questi sistemi dovrebbero includere aria pulita, acqua e un sistema alimentare per mantenere efficacemente gli animali e i loro ambienti, garantendo il completo isolamento dai microrganismi esterni. A differenza di altri modelli animali GF come topi e polli⁵², ottenere il pesce zebra GF attraverso operazioni anatomiche dai genitori CR è difficile a causa delle loro abitudini acquatiche e dello stile di fecondazione naturale.

Anche trattare gli animali adulti come completamente privi di microbiota intestinale è difficile. Mentre il trattamento antibiotico può indurre uno stato simile a quello degli animali privi di patogeni specifici (SPF), caratterizzato da un microbiota ridotto rilevato nei campioni fecali, il raggiungimento di veri modelli di pesci adulti GF rimane difficile. Le sfide legate alla creazione e al mantenimento dei modelli di GF, specialmente durante la transizione dagli stati giovanili a quelli a lungo termine, sono significative. L'importanza della prole GF, come le uova GF F1 o F2 di pesci GF adulti, nella ricerca microbica è riconosciuta. Tuttavia, superare le sfide nella creazione e nel mantenimento di modelli di pesci GF adulti a lungo termine richiede molto tempo.

Vale la pena notare che è stato sviluppato un pesce zebra gnotobiotico con una specifica colonizzazione batterica, che mostra una sopravvivenza cronica basata su modelli GF. Tuttavia, rimane incerto se questi modelli possano servire come valide alternative ai modelli GF nelle infezioni batteriche e nella ricerca biomedica.

Applicazioni future dei modelli di pesce GF
In questo studio, abbiamo perfezionato il protocollo per la generazione di modelli di pesce zebra GF, progredendo dagli embrioni ai giovani. Questo progresso ha applicazioni significative nella biologia dello sviluppo, nell'immunologia, nella ricerca sulle malattie umane e nell'organogenesi. Attraverso l'isolamento e l'identificazione di massa, lo studio esplora le funzioni, i meccanismi e i metaboliti derivati dall'intestino di singoli ceppi batterici. L'indagine prevede l'infezione dei modelli di pesce zebra GF dopo che lo sfiato ha aperto la fase^47,53. Inoltre, i batteri marcati con fluorescenza facilitano l'osservazione della colonizzazione e della distribuzione nelle larve di GF vive, prive di altre influenze microbiche⁵⁴. Modelli di pesci GF simili, come la medaka marina o d'acqua dolce, possono essere creati utilizzando metodi comparabili con vari agenti o cambiamenti del mezzo.

Per sondare i meccanismi delle malattie umane, lo studio utilizza metodi FMT, trasferendo campioni da pazienti o donatori ad animali sani o modelli GF⁵⁵. A differenza degli animali allevati in modo convenzionale (CR), i modelli GF offrono prove solide di funzioni, impatti o risposte microbiche nell'ospite, in particolare se combinati con batteriofagi per regolare i batteri bersaglio nel microbiota⁴⁶.

In sintesi, i pesci zebra GF fungono da potenti modelli per valutare la sicurezza batterica, l'efficacia dei farmaci, la tossicità degli inquinanti o l'interferenza dei composti, grazie al loro ambiente intestinale sensibile e puro. L'esplorazione futura delle applicazioni dei pesci GF dovrebbe comprendere vari campi, con la necessità di creare modelli di pesci GF adulti per una comprensione più profonda delle funzioni microbiche nelle diverse fasi della vita.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
AB-GZM	Amfotericina:Solarbio;   kanamicina:Solarbio; Ampicillina:Solarbio.	Amfotericina:CAS:1397-89-3; kanamicina:CAS: 25380-94-0; Ampicillina: CAS: 69-52-313.	49,6 mL GZM, 50 &; micro; L. soluzione madre di amfotericina (250 µ g/mL), 25 µ L. kanamicina soluzione madre (10 mg/mL) e 250 µ L. soluzione madre di ampicillina (20 mg/mL).
Provette EP da 1,5 mL, 15 mL, 50 mL	biosharp	BS-15-M	Per raccogliere campioni e trattenere agenti
2,4 g/L NaClO	XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.	CAS: 7681-52-9	Diluito con soluzione acquosa di ipoclorito di sodio all'8%.
piastre a 6 pozzetti, piastre a 24, 48 pozzetti	LABSELECT	11112	Per allevare pesci
Aeronomas	NCBI database	n.MK178499	2019-JPP-ESN
Piastre TSA anaerobiche	triptone:Ossoide ; peptone di soia:Solarbio ; NaCl:Biosharp; agar in polvere: BioFroxx.	triptone:LP0042B; peptone di soia:Gatto#S9500; NaCl:BS112; POLVERE DI AGAR: 9002-18-0.	Le piastre TSA sono state preparate con 400 ml di terreno contenente 6 g di triptone, 2 g di peptone di soia, 2 g di NaCl e 6 g di polvere di agar sotto il sistema anaerobico.
Stazione di lavoro anaerobica	GENE SCIENCE	E200G	Isolamento batterico, test sterili
Analisi GraphPad	Prism 5	v6.07	Per analizzare i
dati API 20 E kits	BioMerieux SA, Francia	No.1005915090	Ref 20100 Kit per rilevare il metabolismo batterico
Artemia (Gamberetti in salamoia)	Shangjia Aquarium Co., Ltd.	di marca Aquamaster	e uova di artemia salina
Sistema di ciclo automatico per l'allevamento di pesci	Ningbo Hairui Technology Co., Ltd	No Cat	Mantenere il pesce
Autoclave	Zeal Way	G154DWS	Preparare i materiali
BHI Aerobic	Coolaber	Cat#PM0640	BHI medium è stato preparato, in cui 100 mL di terreno includevano 3,7 g di polvere BHI.
BHI Anaerobic	Coolaber	Cat#PM0640	Il terreno BHI è stato preparato e diviso in tubi anaerobici sotto il sistema anaerobico.
Incubatore biochimico	LongYue Co., Ltd	SPX	Per pesci e piatti
Armadio di biosicurezza	Haier	HR40-IIA2	Trattamento e test sterili
Agente sbiancante di 0,02 g/L NaClO	XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.	CAS: 7681-52-9	Soluzione di lavoro con ipoclorito di sodio (NaClO) concentrazione: diluita con soluzione acquosa di ipoclorito di sodio all'8% o 166,6 uL di ipoclorito di sodio al 6% con 500 mL di acqua distillata.
Piastre di sangue	di pecora: Solarbio	N. di cat. TX0030	Il sangue di pecora defibrinato sterile è stato aggiunto alla TSA per preparare piastre di sangue al 5%.
Pallone per colture cellulari	Corning	430639	Per la coltura di pesci
Coloranti CM-Dil	Sonde molecolari	Cat#C7000	Per etichettare i batteri
Incubatore con agitazione a temperatura costante	Peiving Co., Ltd	HZQ-X100	Database di colture batteriche
	NCBI Database di	batteri e archei	Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Batteri FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Pipetta Pasteur monouso	biosharp	bs-xh-03l	Utilizzato per cambiare l'acqua e trasferire le uova
Piastra di Petri monouso	biosharp	BS-90-D	Per la coltura di kit di DNA di pesce
	Solaribio	Cat#D1600	Kit di estrazione del DNA genomico batterico...
Pipetta elettrica	SCILOGEX	Levo me	Cambia l'acqua
Exiguobacterium	NCBI database	n.MK178504	2019-JPP-ESN
GZM	Sale marino:LANDEBAO Co., Ltd.	No Cat	Composto da 1 L di acqua e 1,5 mL di soluzione di sale marino (40 g/L), sterilizzato in autoclave. Il contenuto di sale marino nella soluzione di GZM era di 60 mg/L.
Sistema di acqua pura da laboratorio	Hitech Co., Ltd	Prima-S15	Preparare gli agenti
Microscopio	Nikon	SMZ18	Con luce fluorescente per osservare le larve di pesce
Kit PCR	TIANGEN	Cat#ET101	Taq Kit DNA polimerasi
Pipetta	LABSELECT	sp-013-10	Cambia l'acqua
: iodio povidone (PVP-I)	Aladdin	Lot#H1217005	Soluzione acquosa, iodio povidone 0,4 g/L di acqua pura.
Convertitore di temporizzazione	PinYi Co., Ltd	AL-06	Per regolare la luce
TSA piastre	triptone: Oxoid ; peptone di soia:Solarbio ; NaCl:Biosharp; agar in polvere: BioFroxx.	triptone:LP0042B; peptone di soia:Gatto#S9500; NaCl:BS112; POLVERE DI AGAR: 9002-18-0.	Le piastre TSA sono state preparate con 400 ml di terreno contenente 6 g di triptone, 2 g di peptone di soia, 2 g di NaCl, 6 g di agar in polvere.
TSB Triptone aerobico	:Ossoide ; peptone di soia:Solarbio ; NaCl:Biosharp;	triptone:LP0042B; peptone di soia:Gatto#S9500; NaCl:BS112;	È stato preparato un terreno TSB, in cui 400 ml di terreno includevano 6 g di triptone, 2 g di peptone di soia e 2 g di NaCl.
TSB Triptone anaerobico	:Ossoide ; peptone di soia:Solarbio ; NaCl:Biosharp;	triptone:LP0042B; peptone di soia:Gatto#S9500; NaCl:BS112;	Il terreno TSB è stato preparato e diviso nei tubi anaerobici sotto il sistema anaerobico.
Banco da lavoro ultra-pulito	Airtech	SW-CJ-2FD	Trattamento e test sterili
Sistema di flusso ultrapuro per l'allevamento ittico	Azienda di attrezzature biologiche marine	No Cat	Produce acqua per pesci
Vibrio	NCBI database	n.MK178501	2019-JPP-ESN