Rapida separazione e visualizzazione di agenti fibrinogenolitici attivi in Sipunculus nudus attraverso l'elettroforesi su gel di fibrinogeno-poliacrilammide

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo di elettroforesi su gel di fibrinogeno-poliacrilammide (PAGE) per separare e visualizzare rapidamente gli agenti fibrinogenolitici di Sipunculus nudus.

Abstract

Gli agenti fibrinogenolitici in grado di sciogliere direttamente il fibrinogeno sono stati ampiamente utilizzati nel trattamento anticoagulante. In generale, l'identificazione di nuovi agenti fibrinogenolitici richiede prima la separazione di ciascun componente e quindi il controllo delle loro attività fibrinogenolitiche. Attualmente, l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) e la cromatografia sono utilizzate principalmente nella fase di separazione. Nel frattempo, il test su piastra di fibrinogeno e i prodotti di reazione basati su PAGE sono solitamente adottati per mostrare le loro attività fibrinogenolitiche. Tuttavia, a causa della separazione spazio-temporale di questi due stadi, è impossibile separare e visualizzare gli agenti fibrinogenolitici attivi con lo stesso gel. Per semplificare i processi di separazione e visualizzazione dell'identificazione degli agenti fibrinogenotici, abbiamo costruito un nuovo metodo fibrinogeno-PAGE per separare e visualizzare rapidamente gli agenti fibrinogenolitici dei vermi delle arachidi (Sipunculus nudus) in questo studio. Questo metodo include la preparazione del fibrinogeno-PAGE, l'elettroforesi, la rinaturazione, l'incubazione, la colorazione e la decolorazione. L'attività fibrinogenolitica e il peso molecolare della proteina possono essere rilevati simultaneamente. Secondo questo metodo, abbiamo rilevato con successo più di un agente fibrinogenolitico attivo di omogenato di verme di arachidi entro 6 ore. Inoltre, questo metodo fibrinogeno-PAGE è rispettoso in termini di tempo e costi. Inoltre, questo metodo potrebbe essere utilizzato per studiare gli agenti fibrinogenolitici di altri organismi.

Introduzione

Negli ultimi anni, a causa del continuo aumento delle malattie trombotiche, le malattie trombotiche sono diventate un nuovo importante problema sanitario globale¹. Attualmente, i farmaci antitrombotici sono classificati in tre gruppi: farmaci antiaggreganti piastrinici, anticoagulanti e farmaci trombolitici. Tra questi, i farmaci trombolitici, come l'urochinasi (UK), l'attivatore del plasminogeno tissutale (tPA), ecc., sono gli unici farmaci clinicamente utilizzati in grado di idrolizzare il trombo². Nel frattempo, farmaci trombolitici più sicuri ed efficaci sono in fase di sviluppo grazie all'identificazione di nuovi agenti trombolitici³.

Tuttavia, l'identificazione di nuovi agenti trombolitici richiede molto tempo e lavoro, il che coinvolge principalmente le fasi di separazione/purificazione e caratterizzazione/controllo. Il primo è quello di separare ogni componente, e il secondo è quello di mostrare le loro attività fibrino(geno)litiche ^4,5. In studi precedenti, nonostante il fatto che abbiamo isolato con successo un nuovo enzima fibrino(geno)litico (sFE) dal verme delle arachidi (Sipunculus nudus) mediante cromatografia di affinità e saggio su piastra di fibrina(ogeno) ^6,7,8, questi processi richiedono molto tempo e lavoro. In primo luogo, è necessario determinare se gli omogenati di verme delle arachidi hanno attività fibrino(geno)litica con il metodo della piastra di fibrina(ogen) e dei prodotti di reazione basati su PAGINA⁹. Quindi, per la separazione e^{la purificazione} devono essere eseguite una serie di cromatografie, come la cromatografia a scambio ionico, la cromatografia con filtrazione su gel, la cromatografia di affinità e altri metodi. Successivamente, viene eseguito nuovamente il saggio della piastra di fibrina per verificare l'attività fibrinogenolitica di ciascun componente separato. Infine, vengono eseguiti native-PAGE e sodium dodecyl sulfate (SDS)-PAGE per determinare il peso molecolare degli agenti fibrinogenolitici attivi¹². Pertanto, è fondamentale separare e visualizzare rapidamente gli agenti fibrinogenolitici attivi.

Per separare e visualizzare rapidamente gli agenti fibrinogenolitici attivi negli omogenati di vermi delle arachidi, è stato sviluppato un nuovo metodo fibrinogeno-PAGE combinando i metodi PAGE e piastra di fibrinogeno, ovvero i substrati degli agenti fibrinogenici fibrinogeno sono stati aggiunti al gel nativo PAGE. Dopo la PAGE nativa, i componenti sono stati separati in base al loro peso molecolare. Nel frattempo, ogni componente fibrinogenolitico attivo può essere visualizzato mediante colorazione. Con questo metodo, abbiamo rilevato con successo più di un agente fibrinogenolitico attivo dell'omogenato di verme delle arachidi entro 6 ore. Inoltre, questo metodo fibrinogeno-PAGE è rispettoso in termini di tempo e costi. Inoltre, questo metodo potrebbe essere utilizzato per studiare gli agenti fibrinogenolitici di altri organismi.

Protocollo

1. Preparazione dell'omogenato di vermi delle arachidi

1. Aggiungere 50 g di vermi di arachidi e 150 ml di soluzione salina nell'omogeneizzatore.
2. Omogeneizzare a 24000 giri/min per 60 s.
   NOTA: Ripetere 3 volte.
3. Centrifugare l'omogeneizzato a 9710 x g per 30 minuti a 4 °C.
4. Raccogli il surnatante come omogenato di verme delle arachidi per ulteriori studi.

2. Preparazione del gel Fibrinogen-PAGE

1. Pesare 0,01 g di fibrinogeno in un becher di vetro da 50 mL.
2. Aggiungere 1,9 mL di DDH₂O, 1,3 mL di Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) e 0,05 mL di SDS (10%, p/v) nel becher; Mescolare bene pipettando.
3. Posizionare il bicchiere a 37 °C per 30 minuti.
   NOTA: Questo passaggio consiste nello sciogliere il fibrinogeno.
4. Aggiungere 1,7 mL di acrilammide (30%, p/v), 0,05 mL di persolfato di ammonio (APS; 10%, p/v), 0,002 mL di TEMED; Mescolare bene pipettando.
   NOTA: Questo è un gel separatore.
5. Versare il gel separatore in uno stampo per gel a 10 pozzetti.
6. Aggiungere 2 mL di DDH₂O nello stampo in gel; Attendere 30 min.
7. Rimuovere accuratamente l'acqua capovolgendo lo stampo.
8. Aggiungere 1,4 mL di DDH₂O, 0,25 mL di Tris-HCl (1,0 M, pH 6,8), 0,02 mL di SDS (10%, p/v), 0,33 mL di acrilammide (30%, p/v), 0,02 mL di APS (10%, p/v), 0,002 mL di tetrametiletilendiammina (TEMED) nel becher; Mescolare bene pipettando.
   NOTA: Questo è il gel di caricamento.
9. Versare il gel di caricamento nello stesso stampo per gel del passaggio 2.5; Inserire immediatamente il pettine.
   NOTA: Il gel fibrinogeno-PAGE utilizzato qui era composto dal fibrinogeno (0,2%) contenente gel separatore e gel di caricamento. La concentrazione di fibrinogeno può essere regolata secondo necessità.

3. Elettroforesi

1. Posizionare il gel di fibrinogeno-PAGE preparato insieme allo stampo per colla nel serbatoio dell'elettroforesi; versare 1300 mL di soluzione per elettroforesi (1,963 g di Tris, 12,22 g di glicina, 0,65 g di SDS e 1300 mL di DDH₂O) nel serbatoio; Estrarre il pettine.
2. Aggiungere 5 μL di tampone di carico non denaturante 5x ai 20 μL di sFE e ai 20 μL di omogeneizzato di verme di arachidi; mescolare bene pipettando; caricarli nel gel fibrinogen-PAGE preparato.
   NOTA: Non far bollire il composto. sFE è un enzima fibrino(geno)litico identificato in precedenza ^6,7,8 e viene utilizzato come controllo positivo in questo studio. L'omogenato di verme delle arachidi è il campione da rilevare. Tampone di carico non denaturante senza blu di bromofenolo, β-mercaptoetanolo e SDS rispetto al tampone di caricamento SDS-PAGE. Ogni corsia del campione è separata con il tampone di caricamento 1x SDS-PAGE per rilevare chiaramente il movimento della proteina.
3. Eseguire l'elettroforesi a 80 V per 30 minuti o a 120 V per 20 minuti.
4. Rimuovere il gel fibrinogen-PAGE dallo stampo per colla.

4. Rinaturalizzazione

1. Trasferire il gel fibrinogeno-PAGE in una scatola di plastica.
2. Aggiungere 100 mL di Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) e 2 mL di Triton X-100 nella confezione. Posizionarlo su uno shaker a 60-70 giri/min per 10 min.
3. Rimuovere il tampone di lavaggio mediante pipettaggio.
   NOTA: Ripetere tre volte.

5. Incubazione

1. Aggiungere 50 mL di Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) nella scatola di plastica.
2. Incubare a 37 °C per 4 ore.
   NOTA: Il tempo di incubazione può essere regolato in base all'intensità dell'attività fibrinogenolitica.

6. Colorazione

1. Rimuovere il tampone di incubazione mediante pipettaggio.
2. Aggiungere 50 ml di soluzione colorante Coomassie Brillant Blue nella scatola e posizionare la scatola su uno shaker a 60-70 giri/min per 30 minuti.

7. Decolorazione

1. Rimuovere la soluzione colorante mediante pipettaggio.
2. Aggiungere 50 ml di DDH₂O nella confezione.
3. Posizionare la scatola su uno shaker a 60-70 giri/min per 30 minuti.
   NOTA: In questo caso è stato utilizzato DD H₂O come soluzione decolorante. Il tempo di agitazione può essere regolato in base alla forza dell'attività fibrinogenolitica.

Risultati

Dopo l'elettroforesi, tutte le bande del marcatore sono state chiaramente visualizzate. Le corsie di carico 1x SDS-PAGE mostravano solo bande di 10 kDa (blu bromofenolo). I campioni di sFE e di verme delle arachidi non hanno mostrato alcuna banda osservabile (Figura 1). Sebbene le bande dei campioni non siano visibili, le prestazioni del marcatore e del blu di bromofenolo hanno indicato che l'elettroforesi è andata a buon fine e i campioni sono stati separati in base al loro peso molecolare.

Sebbene l'intero gel sia diventato blu a causa della colorazione, la decolorazione ha reso trasparente l'area in cui il fibrinogeno è stato degradato dagli agenti fibrinogenolitici. Rispetto al marcatore, l'sFE ha indicato una banda fibrinogenolitica attiva vicino a 25 kDa. L'omogeneizzato di verme delle arachidi mostrava 25 kDa, 33 kDa, 43 kDa e una serie di bande più grandi di 70 kDa (Figura 2). I risultati hanno indicato che l'sFE conteneva solo un componente fibrinogenolitico di 25 kDa, ma l'omogenato di verme dell'arachide conteneva componenti dell'sFE e altri agenti fibrinogenolitici. La Figura 1 supplementare è un esempio di un'immagine su gel che mostra il marcatore in blu intenso e i campioni target come bande luminose.

Figura 1: Gel dopo l'elettroforesi. M: Marcatore; Corsia 1: 1x buffer di caricamento SDS-PAGE; Corsia 2: sFE; Corsia 3: 1x buffer di caricamento SDS-PAGE; Corsia 4: omogeneizzato di verme delle arachidi; Corsia 5: 1x buffer di caricamento SDS-PAGE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Gel dopo la decolorazione. M: Marcatore; Corsia 1: 1x buffer di caricamento SDS-PAGE; Corsia 2: sFE; Corsia 3: 1x buffer di caricamento SDS-PAGE; Corsia 4: omogeneizzato di verme delle arachidi; Corsia 5: 1x buffer di caricamento SDS-PAGE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: Immagine del gel che mostra il marcatore in blu intenso e i campioni target come bande luminose. M: Marcatore; Corsia 1: 1x buffer di caricamento SDS-PAGE; Corsia 2: sFE; Corsia 3: 1x buffer di caricamento SDS-PAGE; Corsia 4: omogeneizzato di verme delle arachidi; Corsia 5: 1x buffer di caricamento SDS-PAGE. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

sFE è un nuovo enzima fibrino(geno)litico isolato dai vermi delle arachidi dal nostro team precedentemente 3,6,8,13. Tuttavia, i processi di identificazione dell'sFE richiedevano molto tempo e lavoro, coinvolgendo il rilevamento dell'attività fibrinogenolitica, la separazione dei componenti proteici e le fasi di conferma dell'attività. Come metodo semplice, il test su piastra di fibrinogeno viene utilizzato principalmente nella fase preliminare di screening per verificare l'attività fibrinogenolitica dei campioni. Tuttavia, il metodo del saggio su piastra del fibrinogeno non è in grado di distinguere quale componente è attivo. Pertanto, la cromatografia e la nativa/SDS-PAGE devono essere utilizzate per separare i loro componenti dopo il rilevamento dell'attività. Quindi, i prodotti di reazione vengono nuovamente risolti dalla SDS-PAGE per confermare la degradazione del fibrinogeno del substrato. In questo lavoro, il substrato fibrinogeno è stato aggiunto al gel PAGE per rilevare l'agente fibrinogenolitico. Dopo l'elettroforesi, la rinaturazione, l'incubazione, la colorazione e la decolorazione, il peso molecolare e l'attività fibrinogenolitica degli agenti fibrinogenolitici attivi sono stati chiaramente visualizzati con lo stesso gel. Con questo metodo, abbiamo rilevato con successo più di un agente fibrinogenolitico attivo dall'omogenato di verme delle arachidi entro 6 ore.

Per ottenere risultati ottimali, è necessario prestare maggiore attenzione alla preparazione, alla rinaturazione e all'incubazione del gel fibrinogen-PAGE. In generale, più bassa è la concentrazione di fibrinogeno, più incolore è la zona fibrinogenolitica, che indica l'attività fibrinogenolitica degli agenti. Tuttavia, più bassa è la concentrazione di fibrinogeno, più incolore è lo sfondo e più difficile è distinguere la zona fibrinogenolitica dallo sfondo. Il tempo di rinaturazione influenzerà significativamente l'attività fibrinogenolitica dei componenti. Se questo tempo è troppo breve per lavare via la SDS nel gel PAGE, l'attività fibrinogenolitica dei componenti sarà inibita dalla SDS rimanente. Allo stesso modo, se il tempo di incubazione è troppo breve, la reazione fibrinogenolitica non è completa. Anche se il tempo di incubazione è troppo lungo, il marcatore utilizzato per indicare il peso molecolare verrà lavato via. In questo studio, sebbene tali condizioni siano state ottimizzate, queste condizioni sono state impostate per separare e visualizzare gli agenti fibrinogenolitici dai vermi delle arachidi. Pertanto, le condizioni personalizzate di questi passaggi critici dovrebbero essere impostate in base a specifici agenti fibrinogenolitici.

È importante ricordare che questo fibrinogeno-PAGE è adatto solo per lo screening degli agenti fibrinogenolitici con attività litica del fibrinogeno, ma non per gli agenti con attività litica del fibrinogeno o attività di attivazione del plasminogeno. Se vogliamo mostrare queste attività, il metodo può essere ottimizzato sostituendo il fibrinogeno con fibrina o plasminogeno. Un altro punto degno di nota è che gli agenti fibrinogenolitici attivi testati in questo studio erano monomeri, che non sono stati influenzati nella condizione di elettroforesi SDS. Pertanto, se gli agenti testati sono polimeri, questo metodo deve essere regolato su una condizione nativa di PAGE che non può visualizzare il peso molecolare. Pertanto, il metodo fibrinogeno-PAGE qui introdotto era solo una versione di base generale, che può essere ottimizzata per lo screening rapido degli altri agenti fibrinogenolitici.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1  M Tris-HCl (pH 6,8)	Solarbio	T1020
1,5 M Tris-HCl (pH 8,8)	Solarbio	T1010
30% acrilammide/bis-acrilammide	Biosharp	BL513B
Persolfato di ammonio	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
Becher	PYREX	2-9425-02
Provetta da centrifuga (1,5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Incubatore a temperatura costante	JINGHONG	JHS-400
Coomas Brillant Blue Soluzione di colorazione	Beyotime	P0017F
Bilancia analitica elettronica	DENVER	TP-213
Fibrinogeno	Solarbio	F8051
Puntali per pipette con caricamento in gel, Bulk	Biosharp	BS-200-GTB
Omogeneizzatore	AHS	ATS-1500
Oscillatore a rotazione orizzontale	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Riferimento	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina	Sigma	T9281
Puntale per pipetta (1 mL)	Puntale per pipette Axygene	T-1000XT-C
(10 &; micro; L)	Puntale	Axygene T-10XT-C
(200 &; micro; L)	Pipettatore Axygene	T-200XT-C
(1 mL)	ZY18723		Thermo Fisher Scientific
(10µ L)	ZX98775		Thermo Fisher Scientific
(200 &5; L)	ZY20280		Thermo Fisher Scientific
(50 &; micro; L)	Thermo Fisher Scientific	ZY15331
Centrifuga refrigerata	cence	H1650R
Sodio dodecil solfato	Sigma-Aldrich	V900859
Tris	Solarbio	T8060
Tris-HCl	Solarbio	T8230
Triton X-100	Solarbio	T8200