Questo studio ha analizzato i trascrittomi a singolo nucleo di trentatré individui con malattia di Alzheimer (AD), rivelando DEG specifici per il sesso nelle cellule gliali. L'analisi dell'arricchimento funzionale ha evidenziato percorsi sinaptici, neurali e ormonali. Sono stati identificati i geni chiave, vale a dire NLGN4Y e i suoi regolatori, e sono stati proposti potenziali candidati terapeutici per l'AD genere-specifico.
Articolo metodologico
Identificazione di biomarcatori per la specificità di genere della malattia di Alzheimer basata sui profili del trascrittoma gliale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Molti biomarcatori sesso-specifici sono stati recentemente rivelati nella malattia di Alzheimer (AD); tuttavia, le cellule gliali cerebrali sono state riportate raramente. Questo studio ha analizzato 220.095 trascrittomi a singolo nucleo dalla corteccia frontale di trentatré individui AD nel database GEO. I geni differenzialmente espressi (DEG) sesso-specifici sono stati identificati nelle cellule gliali, di cui 243 negli astrociti, 1.154 nelle microglia e 572 negli oligodendrociti. Le analisi di annotazione funzionale dell'ontologia genica (GO) e le analisi di arricchimento del percorso dell'Enciclopedia dei geni e dei genomi di Kyoto (KEGG) hanno rivelato la concentrazione funzionale nei percorsi sinaptici, neurali e ormonali. La rete di interazione proteina-proteina (PPI) ha identificato MT3, CALM2, DLG2, KCND2, PAKACB, CAMK2D e NLGN4Y negli astrociti, TREM2, FOS, APOE, APP e NLGN4Y nelle microglia e GRIN2A, ITPR2, GNAS e NLGN4Y negli oligodendrociti come geni chiave. NLGN4Y era l'unico gene condiviso dalle tre gliali ed è stato identificato come il biomarcatore per la specificità di genere dell'AD. La rete di coregolazione del fattore di trascrizione genica (TF)-miRNA ha identificato i regolatori chiave per NLGN4Y e i suoi MTC bersaglio. Sono stati identificati Ecklonia kurome Okam (Kunbu) e Herba Ephedrae (Mahuang) e sono stati mostrati gli effetti dei principi attivi sull'AD. Infine, l'analisi dell'arricchimento di Kunbu e Mahuang ha suggerito che potrebbero agire come candidati terapeutici per la specificità di genere dell'AD.
Introduzione
La malattia di Alzheimer (AD) è una malattia globale con un'alta incidenza e rappresenta il 60%-80% della demenza1. Nonostante la sua elevata incidenza, la patogenesi meccanicistica dell'AD non è chiaramente delineata e fino ad ora non sono state utilizzate terapie efficaci2. Le principali patologie nell'AD sono state identificate come l'atrofia neuronale e l'accumulo di detriti patologici, principalmente la proteina Tau associata ai microtubuli e la β-amiloide (Aβ)3,4. La patogenesi dell'AD è associata ad autofagia anormale, stress ossidativo, disfunzione mitocondriale, infiammazione e disturbo del metabolismo energetico5. Le indagini di prevalenza hanno dimostrato che due terzi dei pazienti con AD erano donne6. Esistono differenze sesso-specifiche nell'AD nell'eziologia, nelle manifestazioni cliniche, nella prevenzione e nel trattamento. Pertanto, rivelare il meccanismo biologico che causa le differenze sesso-specifiche nell'AD e mirare alla medicina tradizionale cinese (MTC) può potenzialmente fornire un quadro teorico più completo per comprendere la patogenesi dell'AD e per guidare ulteriormente un'accurata strategia di trattamento.
Le cellule neurogliali, in particolare la microglia, gli astrociti e gli oligodendrociti, contribuiscono potenzialmente alla patogenesi dell'AD. Nell'AD, le microglia sono attivate e geneticamente modificate, il che contribuisce alla risposta infiammatoria, alla fagocitosi e alla clearance di Aβ 7,8; l'astrocita è geneticamente modificato, il che influenza l'attività sinaptica, l'omeostasi ionica e il metabolismo energetico e lipidico9; L'oligodendrocita è geneticamente modificato con la specificità sessuale, che contribuisce alla perdita neuronale, ai grovigli neurofibrillari e alle lesioni della sostanza bianca10,11.
In questo studio, abbiamo impiegato il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo (snRNA-seq) come tecnica superiore. Rispetto al sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq), snRNA-seq offre vantaggi in termini di ricchezza del campione, integrità del tipo di cellula e affidabilità dei dati12,13. SnRNA-seq è stato ampiamente utilizzato in studi incentrati sull'AD e sull'esplorazione del ruolo delle cellule gliali 14,15,16. La sua ampia adozione in queste aree di ricerca evidenzia la sua efficacia nel fornire preziose informazioni sulle caratteristiche trascrizionali delle cellule gliali nell'AD. Sfruttando i vantaggi di snRNA-seq, i ricercatori sono stati in grado di scoprire informazioni cruciali riguardanti il coinvolgimento delle cellule gliali nella patologia di AD e identificare potenziali bersagli terapeutici. Al fine di esplorare le caratteristiche trascrizionali neurogliali sesso-specifiche nell'AD e le potenziali MTC per la specificità sessuale dell'AD, questo studio ha analizzato i dati snRNA-seq dalla corteccia frontale dei pazienti con AD dal database pubblico NCBI GEO. I geni differenzialmente espressi (DEG) sesso-specifici, l'ontologia genica (GO), l'Enciclopedia dei geni e dei genomi di Kyoto (KEGG), la rete di interazione proteina-proteina (PPI) e la rete gene-TF-miRNA sono ulteriormente analizzati per rivelare biomarcatori chiave e potenziale patogenesi. Infine, sono stati suggeriti potenziali MTC e i loro principi attivi sono stati visualizzati con tabelle effettuando ricerche nei database Coremine Medical, TCMIP e TCMSP.
Protocollo
Le fasi da 2 a 9 dell'analisi sono state implementate utilizzando il software R (vedi Figura 1 supplementare e File 1 supplementare), mentre le restanti fasi sono state eseguite sulle piattaforme online. I dettagli dei database utilizzati in questo protocollo (insieme ai collegamenti web) sono forniti nella Tabella dei Materiali.
1. Acquisizione dati
- Accedi al database Gene Expression Omnibus (GEO) disponibile al pubblico presso il National Center of Biotechnology Information.
- Cerca i dati GEO denominati malattia di Alzheimer nella casella di ricerca.
- Seleziona l'opzione Organismi superiori come Homo sapiens sul lato destro.
NOTA: I risultati della ricerca erano dati sulla malattia di Alzheimer nell'Homo sapiens. - Dopo aver filtrato le informazioni cercate, scarica i file di dati GSE167490 e GSE183068 , che comprendono features.tsv, barcode.tsv e matrix.mtx per ogni singolo campione di nuclei. I set di dati comprendevano 34 campioni di AD provenienti dalla corteccia frontale, con una distribuzione uguale di 17 campioni maschili e 17 campioni femminili (Tabella supplementare 1).
2. Fusione dei campioni
- Configurare di conseguenza i percorsi dei dati e i nomi degli esempi nel computer. Importare i 34 campioni scaricati e assegnare nomi specifici per genere agli esempi utilizzando i nomi delle funzioni.
- Genera oggetti Seurat per tutti i campioni in modo batch utilizzando l'elenco delle funzioni e Read10X, specificando i parametri come min.cells = 3 e min.features = 200.
- Utilizzare la funzione RenameCells per aggiungere ID campione come prefissi ai codici a barre delle celle per conservare i codici a barre delle celle durante il processo di unione. Ciò ha garantito che ogni cellula mantenesse la sua identità univoca e potesse essere ricondotta alla sua fonte di campionamento originale dopo la fusione.
3. Controllo di qualità (QC)
- Usare la funzione PercentageFeatureSet per calcolare i rapporti dei geni mitocondriali, i rapporti dei geni eritrocitari e i rapporti dei geni dei ribosomi per ogni cellula.
- Memorizza questi rapporti calcolati nei metadati utilizzando l'operatore [[ ]] per collegare queste informazioni direttamente ai metadati di ogni cella.
- Utilizza la funzione subset per eseguire la filtrazione cellulare, specificando i parametri come nFeature_RNA > 200, nFeature_RNA < 10000, nCount_RNA < 60000, percent.mt < 10, percent.rb < 5 e percentuale. HB < 75.
- Escludere GSM5106107 dall'analisi.
4. Controllo dell'effetto batch
- Eseguire l'elaborazione dei dati.
- Normalizzare i dati utilizzando la funzione NormalizeData .
- Identificare le prime 2000 funzionalità variabili nel set di dati utilizzando la funzione FindVariableFeatures .
- Condurre l'analisi delle componenti principali (PCA)17 sui dati utilizzando RunPCA, conservando 50 componenti principali.
- Generare un grafico a gomito utilizzando la funzione ElbowPlot per determinare il numero ottimale di quote per l'analisi successiva. Considera le prime 50 dimensioni.
- Ridimensionare i dati utilizzando ScaleData per assicurarsi che tutte le funzionalità siano su una scala comparabile.
- Identifica i vicini più prossimi utilizzando FindNeighbors in base a 30 dimensioni.
- Applicare l'algoritmo UMAP utilizzando RunUMAP per ridurre la dimensionalità dei dati a 30 dimensioni.
- Visualizzare i dati elaborati utilizzando la funzione DimPlot con il parametro di riduzione impostato su umap e il parametro group.by impostato su orig.ident.
NOTA: questo passaggio potrebbe generare un grafico che visualizza i dati nello spazio UMAP ridotto, raggruppati in base alle identità delle celle originali. Dopo aver esaminato i grafici UPAP, è diventato evidente che c'era una presenza di effetto batch. Il distinto raggruppamento o separazione delle cellule in base al loro lotto o origine sperimentale ha suggerito che i lotti sperimentali avevano influenzato i profili di espressione genica.
5. Integrazione dei dati
- Normalizzare e standardizzare i dati utilizzando la funzione SCTransform .
- Applicare l'algoritmo di armonia18 per integrare i restanti 33 dati a singolo nucleo. Utilizzare il test SCT per l'integrazione e impostare il numero massimo di iterazioni di armonia su 20.
- Utilizzare la funzione FindClusters con un parametro di risoluzione impostato su 0,07 per identificare cluster distinti all'interno dei dati.
- Utilizza la funzione RunUMAP con un numero specificato di dimensioni (dim = 30) per ridurre ulteriormente la dimensionalità dei dati e visualizzare i cluster in uno spazio dimensionale inferiore.
6. Annotazione del tipo di cella
- Raccogliere i geni marcatori (Tabella supplementare 2) delle cellule attraverso un'ampia revisione della letteratura esistente.
- Dopo l'identificazione dell'eterogeneità del cluster cellulare, classificare il tipo di ciascuna cellula del cluster in base ai geni marcatore espressi in modo specifico.
- Presentare vari tipi cellulari con la visualizzazione UMAP utilizzando il pacchetto ggplot2, in cui l'oligodendrocita è stato evidenziato con il codice colore #DB7093, il neurone eccitatorio con #FF69B4, l'astrocita con #1874CD, la microglia con #63B8FF, la cellula precursore degli oligodendrociti con #DB7093, il neurone inibitorio con #FFC0CB e la cellula endoteliale con #FF69B4.
- Calcola le proporzioni di ogni tipo di cellula stratificate per genere.
7. Estrazione dei dati delle cellule gliali
- Estrai i dati degli astrociti dai dati di massa integrati utilizzando la funzione subset.
- Estrarre i dati della microglia dai dati di massa integrati utilizzando la funzione di sottoinsieme.
- Estrai i dati degli oligodendrociti dai dati di massa integrati utilizzando la funzione di sottoinsieme.
8. Cattura di geni differenzialmente espressi (DEG) sessuo-specifici gliali
- Identificare i DEG specifici per sesso degli astrociti utilizzando la funzione FindMarkers (ident.1 = maschio, ident.2 = femmina, group.by = group.sum, assay = RNA) con valori di soglia: p-value < 0,05 e |avg_log2FC| > 30. Etichettare i DEG regolati verso l'alto come Verso l'alto, i DEG regolati verso il basso come Verso il basso e il resto come Stabile.
- Visualizza i DEG utilizzando la funzione ggplot , con l'asse x che rappresenta la differenza in percentuale tra due condizioni (pct.1 - pct.2) e l'asse y che rappresenta il avg_log2FC. I geni sovraregolati sono stati evidenziati utilizzando il colore PaleVioletRed, i geni sottoregolati con Rosa e i geni stabili con DodgerBlue3.
- Identificare i DEG specifici per sesso della microglia utilizzando la funzione FindMarkers (ident.1 = maschio, ident.2 = femmina, group.by = group.sum, assay = RNA) con valori di soglia: p-value < 0,05 e |avg_log2FC| > 1. Etichettare i DEG regolati verso l'alto come Verso l'alto, i DEG regolati verso il basso come Verso il basso e il resto come Stabile.
- Visualizza i DEG utilizzando la funzione ggplot , con l'asse x che rappresenta la differenza in percentuale tra due condizioni (pct.1 - pct.2) e l'asse y che rappresenta il avg_log2FC. I geni sovraregolati sono stati evidenziati utilizzando il colore OrangeRed, i geni sottoregolati con LightSalmon e i geni stabili con SteelBlue1.
- Identificare i DEG specifici per sesso degli oligodendrociti utilizzando la funzione FindMarkers (ident.1 = maschio, ident.2 = femmina, group.by = group.sum, assay = RNA) con valori di soglia: p-value < 0,05 e |avg_log2FC| > 10. Etichettare i DEG regolati verso l'alto come Verso l'alto, i DEG regolati verso il basso come Verso il basso e il resto come Stabile.
- Visualizza i DEG utilizzando la funzione ggplot , con l'asse x che rappresenta la differenza in percentuale tra due condizioni (pct.1 - pct.2) e l'asse y che rappresenta il avg_log2FC. I geni up-regolati sono stati evidenziati utilizzando il colore DeepPink, i geni down-regolati con HotPink e i geni stabili con DeepSkyBlue3.
9. Analisi di arricchimento funzionale di DEG sesso-specifici
- Eseguire l'analisi dell'arricchimento dell'ontologia genica (GO) su DEG sesso-specifici per ciascun tipo di cellula gliale utilizzando la funzione enrichGO . Imposta i seguenti parametri: OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = SYMBOL, ont = ALL, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0,01 e qvalueCutoff = 0,05.
- Converti i simboli dei geni nei corrispondenti ID dei geni utilizzando la funzione bitr. Condurre l'analisi dell'arricchimento dell'Enciclopedia di Kyoto dei geni e dei genomi (KEGG) sui DEG specifici del sesso per ciascun tipo di cellula gliale utilizzando la funzione enrichKEGG . Regola le impostazioni come segue: organism = has, keyType = kegg, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0,01 e qvalueCutoff = 0,05.
10. Statistiche di frequenza dei DEG gliali nelle vie go e kegg, diagrammi di venn di ciascun DEG specifico per sesso gliale e costruzione della rete PPI
- Calcolare la frequenza dei DEG sessuali specifici gliali nelle vie GO e KEGG utilizzando un istogramma di frequenza.
- Accedi al database STRING per costruire le reti PPI.
- Scegli Proteine multiple. Cerca l'elenco dei nomi nella casella di ricerca. Imposta "Organismi" come Homo sapiens.
- Esamina l'elenco delle proteine ottenute dalla ricerca. Fare clic su Continua per procedere.
- Esporta le reti PPI selezionando l'opzione di download , preferibilmente in formato PNG con risoluzione più alta.
- Visualizza la distribuzione della co-espressione per i principali geni sesso-specifici utilizzando i diagrammi di Venn.
- Identificare i geni condivisi come geni chiave nello studio sulla base dell'analisi del diagramma di Venn.
11. Costruzione di reti regolatorie multifattoriali
- Accedere a NetworkAnalyst.
- Fare clic su Gene List Input e specificare l'organismo come H. sapiens (umano). Imposta il tipo di ID come simbolo genetico ufficiale. Inserisci il nome del gene nel campo di ricerca, quindi fai clic su Carica e procedi.
- Seleziona Interazioni gene-miRNA e scegli miRTarBase v8.0. Confermare la selezione cliccando su OK.
- Procedi su Interazioni tra TF e geni e seleziona il database ENCODE . Fare clic su OK per confermare la selezione.
- Quindi, vai a Rete di coregolazione TF-miRNA e fai clic su OK per procedere.
- Infine, scegli Procedi per generare la rete regolatoria multifattoriale che incorpora le interazioni gene-miRNA e TF-gene.
12. Analisi della MTC genica e target
- Accedi al database online di Coremine Medical.
- Inserisci il nome del gene specifico e seleziona il gene corrispondente con il suffisso gene/proteina, umano nella casella di ricerca nella sezione Esplora .
- Naviga nella sezione Farmaci e identifica i MTC associati ai farmaci cercati.
NOTA: I farmaci statisticamente significativi sono stati contrassegnati in blu. - Determina le prime cinque MTC in base al loro valore di "significatività" come MTC terapeutiche.
13. Riepilogo della ricerca sugli ingredienti della MTC nel targeting del gene chiave
- Accedi alla piattaforma di ricerca integrativa basata sulla farmacologia della medicina tradizionale cinese (TCMIP) e alla piattaforma di farmacologia dei sistemi di medicina tradizionale cinese (TCMSP). Inserisci i nomi delle erbe nella barra di ricerca per recuperare gli ingredienti corrispondenti.
- Recupera gli ingredienti nel database di PubMed con un limite di tempo fino al 10 aprile 2023. I termini di ricerca utilizzati includevano il nome della molecola in TCMSP e i componenti chimici in TCMIP come termini di ricerca ed erano limitati agli articoli pubblicati in inglese.
- Riassumi e analizza le erbe e i loro ingredienti corrispondenti che agiscono sull'AD.
14. Conferma della funzione terapeutica mirata delle MTC nella specificità sessuale dell'AD
- Importa le erbe nel TCMIP e vai alla pagina di descrizione corrispondente.
- Utilizza la funzione Esporta dati e seleziona il formato CSV per scaricare i termini di arricchimento di GO - Processo biologico, GO - Componente cellulare, GO - Funzione molecolare e Reactome Pathway.
- Visualizza i termini di arricchimento scaricati per ogni erba utilizzando i grafici a barre.
Risultati
Analisi SnRNA-seq dei profili del trascrittoma gliale frontale e annotazione dei tipi cellulari
In totale, sono stati ottenuti 220.095 nuclei e 32.077 geni nella corteccia frontale di 17 AD maschili e 17 AD femminili (Figura 1A). Il grafico UMAP ha visualizzato i trascrittomi frontali totali a singolo nucleo, mostrando tipi distinti di nuclei dopo l'analisi della riduzione dimensionale (Figura 1B). È stato mostrato il numero totale di nuclei annotati catturati per sesso, che hanno portato la somma di 58.902 astrociti, 14.265 microglia, 77.466 oligodendrociti, 3.520 neuroni endoteliali, 25.252 neuroni eccitatori, 31.268 neuroni inibitori e 9.422 cellule progenitrici degli oligodendrociti (Figura 1C). Le espressioni medie dei marcatori di tipo cellulare noti per ciascuna glia sono state proiettate sui grafici UMAP per identificare le popolazioni cellulari (Figura 1D).
I DEG sesso-specifici negli astrociti
Sono stati analizzati 58.902 nuclei astrocitici (Figura 2A), di cui 27.504 da AD maschi (46,69%) e 31.398 da AD femmine (53,31%). I DEG sesso-specifici hanno rivelato la sovraregolazione di 138 geni, tra cui DST, CACNA2D3 e AC016831.7, la sottoregolazione di 105 geni, tra cui CNTN5, RORA, RASSF8 e CADM2, e 4995 geni immutati (Figura 2B). Inoltre, le analisi GO e KEGG hanno identificato che tali DEG si concentrano principalmente nelle vie dei neuroni, delle sinapsi e degli ormoni, con le vie neuronali che includono la regolazione dello sviluppo del progetto neuronale, della colonna vertebrale dei neuroni, ecc., le vie sinaptiche che includono l'organizzazione sinaptica e la sinapsi glutammatergica/colinergica e le vie ormonali che includono la sintesi dell'ormone tiroideo e la secrezione di insulina (Figura 2C, D). Sono stati ottenuti trenta geni con la massima frequenza (Figura 2E), con PLCB1 al primo posto. Le reti PPI sono state costruite per esplorare la relazione tra questi geni (Figura 2F) e hanno identificato DLG2, CAMK2D, CALM2 e PRKACB come geni principali. I grafici UMAP hanno mostrato differenze tra i DEG selezionati: KCND2, CAMK2D, MT3, LINC00278 e XIST erano più alti nell'AD femminile e più bassi nell'AD maschile, mentre NLGN4Y, DLG2, PRKACB, CALM2, UTY e TTTY14 erano opposti (Figura 2G). MT3, CALM2, DLG2, KCND2, PRKACB, CAMK2D e NLGN4Y sono stati infine determinati come DEG sesso-specifici degli astrociti, come mostrato nella Tabella 1.
I DEG sesso-specifici nella microglia
Sono stati analizzati 14.265 nuclei microgliali (Figura 3A), di cui 5.327 (37,34%) da AD maschile e 8.938 (62,66%) da AD femmina. I DEG sesso-specifici hanno rivelato una sovraregolazione di 224 geni, tra cui KCNIP4 e LRRTM4, e una sottoregolazione di 930 geni, tra cui APOE, MT-CO3 e FTL, e 13.111 geni immutati (Figura 3B). Inoltre, le analisi GO e KEGG hanno identificato che tali DEG si concentrano principalmente nelle vie dei neuroni, dei fagosomi, degli ormoni e di altri, con le vie neuronali che includono la sinapsi neurone-neurone, le vie fagocitiche tra cui il fagosoma e la regolazione della fagocitosi, le vie ormonali tra cui la via di segnalazione degli estrogeni, la via di segnalazione dell'ossitocina, ecc. e altre tra cui la regolazione della risposta infiammatoria, l'apprendimento o la memoria, la clearance dell'amiloide-beta, ecc. (Figura 3C, D). Sono stati ottenuti trenta geni con la massima frequenza, con TLR2 e TREM2 al secondo posto a pari merito (Figura 3E). Le reti PPI sono state costruite per esplorare la relazione tra questi geni (Figura 3F) e hanno identificato ACTB, APP e FYN come geni principali. I grafici UMAP hanno mostrato differenze tra i DEG selezionati: APP, FOS, XIST e CTSD erano più alti nell'AD femminile e più bassi nell'AD maschile, mentre NLGN4Y, TREM2, LINC0028, APOE, UTY e TTTY14 erano opposti (Figura 3G). TREM2, FOS, APOE, APP e NLGN4Y sono stati infine determinati come DEG sesso-specifici della microglia, come mostrato nella Tabella 2.
I DEG sesso-specifici negli oligodendrociti
Sono stati analizzati 77.466 nuclei oligodendrocitici (Figura 4A), di cui 42.469 da AD maschi (54,82%) e 34.997 da AD femmine (45,18%). I DEG sesso-specifici hanno rivelato la sovraregolazione di 384 geni, tra cui PCDH9, MT-CO1, NEAT1 e NPAS3, la sottoregolazione di 188 geni, tra cui FRMD4A, PLP1 e LSAMP, e i restanti 76.894 geni invariati (Figura 4B). Inoltre, le analisi GO e KEGG hanno identificato che tali DEG si concentrano principalmente nelle vie dei neuroni, delle sinapsi e degli ormoni, con le vie neuronali che includono la colonna vertebrale dei neuroni, le vie sinaptiche tra cui la sinapsi neurone-neurone e la sinapsi glutammatergica/dopaminergica e le vie ormonali tra cui la via di segnalazione delle neurotrofine, la sintesi e la secrezione dell'aldosterone, la via di segnalazione del calcio, ecc. (Figura 4C, D). Sono stati ottenuti trenta geni con la massima frequenza (Figura 4E), con GRIN2A e PSEN1 al secondo posto a pari merito. Le reti PPI sono state costruite per esplorare la relazione tra questi geni (Figura 4F) e hanno identificato GRIN2A e GRIA2 come geni principali. I grafici UMAP hanno mostrato differenze nei DEG selezionati: GRIN2A, ITPR2, GNAS e XIST erano più alti nell'AD femminile e più bassi nell'AD maschile, mentre NLGN4Y, UTY e TTTY14 erano opposti (Figura 4G). GRIN2A, ITPR2, GNAS e NLGN4Y sono stati infine determinati come DEG sesso-specifici degli oligodendrociti, come mostrato nella Tabella 3.
Interazione tra geni chiave e i primi 30 geni delle cellule gliali e NLGN4Y come gene comune condiviso
I diagrammi di Venn e le reti PPI hanno fornito una panoramica della stretta interazione tra i geni chiave (Figura 5A, B) e i primi 30 geni (Figura 5C, D) di ciascuna cellula gliale. I risultati hanno mostrato che ACYB, APP, JUN, PRKACB e DLG2 erano al centro della rete PPI e NLGN4Y era un gene comune condiviso per i DEG sesso-specifici in tutte le cellule gliali.
Costruzione della rete gene-TF-miRNA
La rete NLGN4Y-TF-miRNA conteneva 13 nodi e 12 bordi (Figura 6A). NLGN4Y è stato regolato da 1 TF, ovvero CTCF, e 11 miRNA, tra cui has-miR-185, has-miR-137 e has-miR-9.
Visualizzazione del farmaco target e della MTC di NLGN4Y con la rete
Un totale di 1 farmaco target NLGN4Y e 64 MTC bersaglio indiretto sono stati recuperati in Coremine Medical. Le MTC con significatività statistica nei risultati sono state contrassegnate in blu. Sono stati visualizzati il farmaco antitrombina III e cinque MTC con la rete, vale a dire Heikunbu, Wulingzhi, Xiazhicao, Shuizhi e Mahuang, che sono stati considerati statisticamente significativi (Figura 6B).
Effetti delle MTC bersaglio e dei corrispondenti principi attivi sull'AD
Per Kunbu, sono stati recuperati 10 ingredienti in TCMIP e 48 ingredienti in TCMSP. Attraverso la ricerca nel database PubMed, sono stati recuperati 5 ingredienti correlati all'AD: fucosterolo, saringosterolo, tiamina, acido stearidonico e florofucofuroeckol-A, di cui la biodisponibilità orale (OB) dei primi due era del ≥30% e simile al sesso del farmaco (DL) era di ≥0,18. I dettagli sono riportati nella Tabella 4. Per quanto riguarda il Mahuang, sono stati recuperati 28 ingredienti in TCMIP e 363 ingredienti in TCMSP. Con lo stesso metodo di Kunbu, sono stati recuperati 25 ingredienti correlati all'AD. Tra questi, 6 ingredienti con OB ≥30% e DL ≥0,18: quercetina, eriodictyol, naringenina, taxifolina, stigmasterolo e luteolina, sono elencati nella parte superiore della Tabella 5.
Rete di malattie genetiche di Hurb e analisi dell'arricchimento
La rete Hurb-gene-malattia è mostrata nella Figura 6C. Il gene bersaglio condiviso da Kunbu e Mahuang era ACHE, le cui malattie associate erano l'AD e i deficit cognitivi. I geni bersaglio del solo Kunbu erano ALKBH3 e ELOVL4, malattie correlate alle quali erano rispettivamente l'invecchiamento e l'atrofia cerebrale.
I risultati degli arricchimenti OB (BP, MF e CC) per Kunbu (Figura 7A, Figura 8A, Figura 9A) e Mahuang (Figura 7B, Figura 8B, Figura 9B) vengono visualizzati con grafici a barre. Sono mostrate anche le vie del reattoma per Kunbu (Figura 10A) e Mahuang (Figura 10B). I termini arricchiti contrassegnati con frecce erano correlati all'asse "ormone-sinapsi-neurone", come l'attività del recettore degli ormoni steroidei, la proiezione dei neuroni e la via di segnalazione mediata dagli ormoni steroidei in Kunbu e la trasmissione sinaptica chimica, l'espressione genica estrogeno-dipendente e il processo del sistema nervoso in Mahuang.
Figura 1: Acquisizione dei dati di espressione genica, profilazione dell'RNA-seq a singolo nucleo e caratterizzazione del tipo cellulare. (A) Campioni ottenuti da GEO DataSets per la preparazione dell'analisi. (B) Grafico UMAP bidimensionale della somma dei nuclei (N = 116,101 per il maschio; N = 103.994 per le femmine). (C) Proporzioni per ogni tipo di cellula suddivisa per genere. (D) Espressione media di 5 marcatori di tipo cellulare ben consolidati proiettati sul grafico UMAP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Gli astrociti sono eterogenei e hanno cambiamenti trascrittomici specifici per sesso nella malattia di Alzheimer. (A) Grafico UMAP dei nuclei astrocitici (N = 59.010). (B) DEG specifici per sesso. (C, D) I grafici circolari hanno illustrato i termini significativi e funzionalmente arricchiti dei DEG astrocitici ottenuti dai database GO e KEGG (GO: C, KEGG: D). (E) I primi 30 DEG astrociti-sesso più frequenti nelle vie GO e KEGG. (F) Rete PPI dei primi 30 DEG astrociti-sesso più frequenti nelle vie GO e KEGG. (G) Espressione media di notevoli DEG sesso-specifici proiettati sui grafici UMAP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Le microglia sono eterogenee e presentano cambiamenti trascrittomici specifici per sesso nella malattia di Alzheimer. (A) Grafico UMAP dei nuclei microgliali (N = 14.265). (B) DEG specifici per sesso. (C, D) I grafici circolari hanno illustrato i termini significativi e funzionalmente arricchiti dei DEG microgliali ottenuti dai database GO e KEGG (GO: C, KEGG: D). (E) I primi 30 DEG microglia-sesso più frequenti inGO e KEGGpathways. (F) Rete PPI dei primi 30 DEG microglia-sesso più frequenti nelle vie GO e KEGG. (G) Espressione media di notevoli DEG sesso-specifici proiettati sui grafici UMAP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Gli oligodendrociti sono eterogenei e hanno cambiamenti trascrittomici specifici per sesso nella malattia di Alzheimer. (A) Grafico UMAP dei nuclei oligodendrocitici (N = 77.466). (B) DEG specifici per sesso. (C, D) I grafici circolari hanno illustrato i termini significativi arricchiti funzionalmente dei DEG oligodendrocitici ottenuti dai database GO e KEGG (GO: C, KEGG: D). (E) I primi 30 DEG oligodendrociti-sesso più frequenti nelle vie GO e KEGG. (F) Rete PPI dei primi 30 DEG sessuali degli oligodendrociti più frequenti nelle vie GO e KEGG. (G) Espressione media di notevoli DEG sesso-specifici proiettati sui grafici UMAP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Sovrapposizioni di DEG e reti PPI di DEG ad alta frequenza. (A,B) Diagramma di Venn che illustra i geni chiave per ciascuna glia e la corrispondente rete PPI. (C, D) Diagramma di Venn che illustra i primi 30 DEG frequenti sesso-specifici per ciascuna glia arricchita nelle vie GO e KEGG e la corrispondente rete PPI. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Diagramma di rete con NLGN4Y e i suoi TCM di targeting come nucleo. (A) Rete di coregolazione gene-TF-miRNA. (B) Rete gene-farmaco-MTC per NLGN4Y. (C) Rete MTC-gene-malattia di Kunbu e Mahuang. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Analisi dell'arricchimento OB (BP) per Kunbu e Mahuang. (A) I 20 principali processi biologici arricchiti di Kunbu. (B) I 20 migliori processi biologici arricchiti di Mahuang. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Analisi dell'arricchimento GO (MF) per Kunbu e Mahuang. (A) Le 20 principali funzioni molecolari arricchite di Kunbu. (B) Le 20 principali funzioni molecolari arricchite di Mahuang. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Analisi dell'arricchimento GO (CC) per Kunbu e Mahuang. (A) I 20 principali componenti cellulari arricchiti di Kunbu. (B) I 20 migliori componenti cellulari arricchiti di Mahuang. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Vie del reattoma per Kunbu e Mahuang. (A) Vie del reattoma di Kunbu. (B) Vie del reattoma di Mahuang. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Geni chiave dei DEG sesso-specifici negli astrociti. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Geni chiave dei DEG sesso-specifici nelle microglia. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Geni chiave dei DEG sesso-specifici negli oligodendrociti. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 4: Principi attivi Kunbu' su AD. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 5: Principi attivi di Mahuang' sull'AD. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Figura 1 supplementare: Screenshot per l'utilizzo del software R. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 1: Informazioni di esempio. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 2: Geni marcatori. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 1: Il CODICE R. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussione
La specificità di genere è stata identificata nell'epidemiologia, nella patologia e nella manifestazione clinica dell'AD19. Qui, abbiamo confermato il potenziale meccanismo patologico dell'asse ormone-sinapsi-neurone" da geni gliali specifici per genere e percorsi correlati nei pazienti con AD. NLGN4Y era l'unico gene condiviso nelle tre gliali ed è stato scelto come biomarcatore per la specificità di genere dell'AD. Il TF e i miRNA che regolano NLGN4Y erano fortemente legati alle differenze di genere e allo sviluppo del sistema nervoso. Inoltre, si è ritenuto che i MTC bersaglio Kunbu e Mahuang influenzassero potenzialmente l'asse "ormone-sinapsi-neurone" e sono stati identificati come candidati terapeutici per l'AD attraverso la regolazione della specificità di genere.
L'algoritmo Harmony ha fornito vantaggi distinti rispetto ad altri algoritmi di integrazione integrando i dati in celle rare, ottimizzando l'utilizzo della memoria e la velocità di calcolo per campioni di grandi dimensioni e adattandosi a progetti sperimentali complessi con diverse fonti cellulari e piattaforme tecnologiche18. Le sezioni di controllo qualità e integrazione dei dati sono state componenti fondamentali per migliorare l'accuratezza e l'affidabilità dell'analisi, consentendo ai ricercatori di raccogliere informazioni più approfondite sulla biologia dell'AD e di altre malattie neurodegenerative. L'esecuzione meticolosa di questi passaggi è fondamentale per ottenere la qualità e la validità complessive dei risultati derivati dagli esperimenti di sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo.
Una delle modifiche apportate a questo protocollo è stata l'uso della funzione SCTransform per normalizzare e standardizzare i dati20. Questo passaggio ha garantito che i dati fossero comparabili e standardizzati per ulteriori analisi. Per mitigare l'effetto batch, è stata eseguita un'ulteriore fase di integrazione dei dati, che ha contribuito a correggere l'effetto batch e a migliorare l'accuratezza dei risultati. La risoluzione dei problemi è stata condotta quando uno dei campioni (GSM5106107) ha mostrato prestazioni insolite rispetto agli altri campioni ed è stato escluso dall'analisi.
Una limitazione di questo studio riguardava la dimensione relativamente piccola del campione impiegato, che può limitare la rappresentatività dei risultati alla popolazione più ampia. Inoltre, l'utilizzo di dati provenienti da più laboratori e gruppi di ricerca ha introdotto un'eterogeneità intrinseca, limitando potenzialmente la riproducibilità e la generalizzabilità dei risultati. Sebbene l'identificazione dei fattori regolatori chiave per NLGN4Y sia stata ottenuta attraverso una rete di coregolazione gene-TF-miRNA, è stata necessaria un'ulteriore verifica sperimentale per accertare i ruoli funzionali e i meccanismi sottostanti attribuiti a questi fattori regolatori. Mentre l'analisi dell'arricchimento suggeriva che Mahuang e Kunbu fossero potenziali candidati per il trattamento dell'AD specifico per genere, basarsi esclusivamente sulle previsioni bioinformatiche non era sufficiente per stabilirne l'efficacia e la sicurezza. Ulteriori esperimenti e studi clinici erano indispensabili per convalidare gli effetti terapeutici di questi farmaci promettenti.
L'approccio delineato in questo studio ha mostrato un notevole potenziale per diversi domini di ricerca, in particolare nel discernimento dei DEG sesso-specifici all'interno delle cellule gliali nell'AD. Tali indagini sono promettenti per chiarire le disparità patogene sfumate tra individui maschi e femmine, facilitando di conseguenza la formulazione di interventi terapeutici specifici per sesso. Inoltre, l'applicabilità del metodo si è estesa ad altre condizioni neurodegenerative, offrendo l'opportunità di identificare DEG sesso-specifici e aumentare la comprensione dei meccanismi sottostanti le malattie.
In conclusione, lo studio ha presentato un protocollo completo e robusto per l'analisi dei dati di sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo dei pazienti con AD, aprendo potenzialmente la strada allo sviluppo di interventi terapeutici su misura. Inoltre, la metodologia impiegata in questo studio può essere estesa ad altre condizioni neurodegenerative, offrendo l'opportunità di scoprire modelli di espressione genica sesso-specifici e approfondire la comprensione di queste malattie complesse.
Dichiarazioni
Non vi è alcun conflitto di interessi in questo manoscritto e tutti gli autori hanno approvato la presentazione per la pubblicazione.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati a Jessica S Sadick, Michael R O'Dea, Philip Hasel, ecc., per aver fornito il GSE167490 set di dati. Gli autori apprezzano il fatto che Faten A Sayed, Lay Kodama, Li Fan, ecc., offrano il GSE183068 set di dati. Gli autori ringraziano Shuqing Liu per l'aiuto con l'analisi dei dati e Wen Yang per aver fornito la piattaforma di analisi dei dati. Questo studio è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (82174511), dall'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu Apricot Grove Scholars, dal Discipline Talent Research Enhancement Program (QJJJ2022001), dal LiaoNing Revitalization Talents Program (XLYC 1807083), dal Sichuan Administration Bureau Fund of Chinese Medicine and Herbs (2023MS578), dal National Undergraduate Innovation and Entrepreneurship Training Project (202310633003X) e da Argomenti innovativi di pratica di ricerca scientifica per studenti universitari dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (ky-2023100). Hanjie Liu e Hui Yang hanno contribuito alla progettazione dello studio, alla raccolta, all'interpretazione dei dati e alla stesura e revisione del manoscritto. Shuqing Liu e Siyu Li hanno partecipato alla progettazione dello studio, alla raccolta dei dati e alla stesura del manoscritto. Wen Yang e Anwar Ayesha erano responsabili della raccolta e dell'interpretazione dei dati. Xin Tan ha preparato figure e/o tabelle. Cen Jiang, Yi Liu e Lushuang Xie hanno concepito lo studio e hanno rivisto/curato il manoscritto. Tutti gli autori hanno contribuito all'articolo e hanno approvato la versione inviata.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Database | |||
| Coremine Database medico | Sviluppato congiuntamente dalla Norvegia, dall'Accademia Cinese delle Scienze, dall'Accademia Cinese delle Scienze Mediche, dalla Biblioteca Medica Nazionale degli Stati Uniti e da altre istituzioni | Quando si esplorano i concetti in CoreMine Medical, si accede a un database strutturato in modo da mettere in relazione concetti importanti, classificati in base alla rilevanza statistica, al tuo argomento. Ad esempio, se si digita "malattia di Alzheimer", oltre a recuperare documenti e risorse che discutono della malattia, sarà possibile visualizzare reti ed elenchi che mostrano in che modo il concetto di query è correlato ad altri concetti biomedici. Ciò fornisce una panoramica dei concetti relativi alla tua ricerca, oltre ad essere un'interfaccia per la navigazione delle informazioni su questi concetti. Weblink: https://coremine.com/medical/ | |
| Gene Expression Omnibus (GEO) | National Center for Biotechnology Information in the United States (NCBI) | GEO è un repository pubblico di dati di genomica funzionale che supporta l'invio di dati conformi a MIAME. Sono accettati dati basati su array e sequenze. Vengono forniti strumenti per aiutare gli utenti a interrogare e scaricare esperimenti e profili di espressione genica curati. Weblink: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | |
| Piattaforma di ricerca integrata basata sulla farmacologia della medicina tradizionale cinese (TCMIP, versione: 2.0) | Nessuno | Introduzione alla piattaforma di ricerca computazionale di rete basata sulla farmacologia integrata per la medicina tradizionale cinese [TCMIP v2.0], http://www.tcmip.cn/ ) È un data mining intelligente piattaforma basata sul database online dell'Enciclopedia della Medicina Tradizionale Cinese (ETCM), che integra la gestione dei big data medici e i servizi di calcolo farmacologico. Ha lo scopo di rivelare la connotazione scientifica della teoria della medicina tradizionale cinese e il valore scientifico del pensiero originale nella medicina tradizionale cinese, riassumere e trasmettere l'esperienza di medici famosi, controllare la qualità della medicina tradizionale cinese, spiegare i principi dell'azione della medicina tradizionale cinese, ricerca e sviluppo di nuova medicina cinese, in particolare la scoperta e l'ottimizzazione delle moderne combinazioni di farmaci, Fornisci una solida base di dati e strumenti analitici. Sulla base di TCMIP v1.0, viene implementato un aggiornamento completo, che include cinque database principali e sette moduli funzionali. Attraverso l'integrazione del sistema e dell'integrazione dei moduli, è possibile ottenere rapidamente un'analisi completa della correlazione multilivello della rete di interazione della "prescrizione della sindrome della malattia". Come piattaforma di data mining intelligente, TCMIP v2.0 fornirà una solida base di dati e una piattaforma di analisi per rivelare la connotazione scientifica della teoria della medicina tradizionale cinese e il valore scientifico del pensiero originale nella medicina tradizionale cinese, riassumendo ed ereditando l'esperienza di medici famosi, il controllo di qualità della medicina tradizionale cinese, chiarendo i principi dell'azione della medicina tradizionale cinese, ricerca e sviluppo di nuovi farmaci della medicina tradizionale cinese, in particolare la scoperta e l'ottimizzazione di combinazioni di farmaci moderni. Weblink: http://www.tcmip.cn/TCMIP | |
| NetworkAnalyst | None Networkanalyze | è una piattaforma online di analisi della visualizzazione per l'analisi dell'espressione genica e la meta-analisi. Può eseguire analisi comparative, quantitative, differenziali e di arricchimento dell'espressione genica, analisi dell'interazione proteina-proteina, analisi dell'integrazione di più set di dati e può anche disegnare immagini di alto valore come PCA, diagramma di rete di interazione proteina-proteina, mappa di calore, diagramma del vulcano, diagramma di Wayne, ecc. Weblink: database https://www.networkanalyst.ca/NetworkAnalyst/ | |
| PubMed | Centro nazionale per l'informazione biotecnologica negli Stati Uniti (NCBI) | Il database Pubmed è un database di letteratura biomedica gestito dalla National Library of Medicine (NLM) negli Stati Uniti, volto a fornire i più recenti risultati della ricerca medica a scienziati, medici, ricercatori e studenti di tutto il mondo. Questo database raccoglie letteratura biomedica da tutto il mondo, inclusi articoli di riviste, documenti, libri, ecc. A partire da ora, il database Pubmed ha raccolto oltre 30 milioni di articoli e viene continuamente aggiornato ogni settimana. Weblink: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/ | |
| R software | Ross Ihaka e Robert Gentleman | R è un linguaggio e un ambiente per il calcolo statistico e la grafica. Si tratta di un progetto GNU simile al linguaggio e all'ambiente S sviluppato presso i Bell Laboratories (precedentemente AT& T, ora Lucent Technologies) di John Chambers e colleghi. R può essere considerato come una diversa implementazione di S. Ci sono del codice scritto per S viene eseguito inalterato sotto R. Weblink: https://www.r-project.org/ | |
| Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) | Zhejiang Jiuwei Health Co., Ltd | TCMSP non è solo un archivio di dati, ma anche una piattaforma di analisi per gli utenti per studiare in modo completo le medicine tradizionali cinesi (MTC): compresa l'identificazione dei componenti attivi, lo screening dei bersagli farmacologici e la generazione di reti composto-bersaglio-malattie, nonché le informazioni dettagliate sulla farmacocinetica dei farmaci che coinvolgono la somiglianza con i farmaci (DL), la biodisponibilità orale (OB), la barriera emato-encefalica (BBB), la permeabilità epiteliale intestinale (Caco-2), ALogP, l'area superficiale negativa frazionaria (FASA-) e il numero di H-bond donatore/accettore (Hdon/Hacc). Finora, il TCMSP ha attirato un'ampia attenzione e diversi gruppi hanno pubblicato più di 10 articoli utilizzando il nostro database TCMSP in circa un anno. Weblink: https://tcmsp-e.com |
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