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Articolo metodologico

Ruolo delle cellule T CD4 nell'encefalomielite autoimmune sperimentale recidivante-remittente

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DOI:

10.3791/66553

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19 gennaio 2024

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1School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, 2Preparation Center, General Hospital of Ningxia Medical University, 3Institute of Neurological Diseases, First People's Hospital of Shizuishan, 4Department of Neurology, Xianyang Hospital of Yan’an University, 5Department of Pharmacy, People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, 6Department of Pharmacy, General Hospital of Ningxia Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Un modello sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE) nei topi è stato impiegato per studiare il ruolo delle cellule T CD4 nell'iniziale e nella recidiva dell'EAE dal punto di vista della fase di attivazione e della funzione dell'effetto immunitario.

Abstract

La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune caratterizzata dall'infiltrazione di cellule immunitarie e dalla demielinizzazione nel sistema nervoso centrale (SNC). L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) funge da modello animale prototipico per lo studio della SM. In questo studio, abbiamo mirato a indagare il ruolo delle cellule T CD4 nell'inizio e nella recidiva dell'EAE, concentrandoci sulla fase di attivazione e sulla risposta immunitaria. Per creare il modello di topi EAE, le femmine di topo sono state immunizzate con glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG)35-55 emulsionata con adiuvante di Freund completo (CFA). I punteggi clinici sono stati valutati giornalmente e i risultati hanno dimostrato che i topi nel gruppo EAE mostravano un classico modello recidivante-remittente. L'analisi della colorazione con ematossilina-eosina (H&E) e luxol fast blue (LFB) ha rivelato una significativa infiltrazione di cellule infiammatorie nel SNC e demielinizzazione nei topi EAE. Per quanto riguarda la fase di attivazione, sia le cellule T effettrici CD4+CD69+ (Teff) che le cellule T effettrici di memoria CD4+CD44+CD62L- (Tem) possono contribuire all'inizio dell'EAE, tuttavia, la fase di recidiva era probabilmente dominata dalle cellule CD4+CD44+CD62L-Tem. Inoltre, in termini di funzione immunitaria, le cellule helper T (Th)1 sono principalmente coinvolte nell'avvio dell'EAE. Tuttavia, entrambe le cellule Th1 e Th17 contribuiscono alla fase di recidiva e la funzione immunosoppressiva delle cellule T regolatorie (Treg) è stata inibita durante il processo patologico EAE.

Introduzione

La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune caratterizzata dall'infiltrazione del sistema nervoso centrale (SNC) con cellule immunitarie e demielinizzazione 1,2. Uno studio recente ha dimostrato che è la malattia invalidante più comune che colpisce i giovani, con una sua incidenza in continuo aumento in tutto il mondo3. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un prototipo animale di SM che simula molti aspetti della fase infiammatoria della SM4 umana. Dal punto di vista delle funzioni immunitarie, le cellule T CD4 iniziali che non hanno ancora incontrato antigeni sono indicate come cellule helper T(Th) 0. Queste cellule subiscono processi di maturazione e attivazione per esibire varie funzioni. Le cellule T CD4 possono essere classificate in diversi sottogruppi in base alle loro funzioni specifiche, che includono Th1, Th2, T regolatori (Treg), helper follicolare T (Tfh), Th17, Th9 e cellule Th225. È opinione comune che i sottotipi cellulari Th1 e Th17 siano fattori cruciali di patogenesi dell'EAE6. Le cellule Th1 potrebbero secernere interferone γ (IFN-γ) e le cellule Th17 secernono interleuchina (IL)-17 e altri fattori infiammatori, che potrebbero attivare altre cellule immunitarie come le cellule microgliali e gli astrociti. Queste cellule producono citochine infiammatorie7, come IL-18, IL-12, IL-23 e IL-1β, che potrebbero indurre ulteriormente la risposta immunitaria delle cellule Th1/Th17, con conseguente demielinizzazione progressiva e danno assonale. Dal punto di vista della fase di attivazione, le cellule T CD4 possiedono un destino predeterminato di svilupparsi in sottoinsiemi cellulari distinti e stati differenziati, tra cui cellule T naive, effettrici e di memoria8. Le cellule T CD4 iniziali proliferano e si differenziano in una varietà di sottogruppi di effettori con funzioni diverse in ambienti diversi9. La maggior parte delle cellule effettrici ha vita breve, con una piccola popolazione di cellule T che si sviluppa in cellule T di memoria che mostrano rapide funzioni effettrici quando si incontrano nuovamente gli stessi antigeni e forniscono all'ospite una protezione altamente potente e a lungo termine10,11.

Sebbene la ricerca attuale suggerisca che le cellule T CD4 svolgano un ruolo significativo nello sviluppo dell'EAE, non è ancora chiaro come i diversi sottogruppi di cellule T CD4, classificati in base alla loro fase di attivazione e alla funzione dell'effetto immunitario, contribuiscano all'inizio e alla recidiva dell'EAE. Nel presente studio, abbiamo stabilito il modello EAE nei topi C57BL6/J immunizzando il peptide della glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG)35-55 e abbiamo studiato l'inizio e la recidiva dell'EAE, concentrandoci sulla fase di attivazione e sulla funzione immunitaria delle cellule T CD4.

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Protocollo

Un totale di 18 topi femmina C57BL/6J di età compresa tra sei e otto settimane sono stati divisi casualmente in un gruppo di controllo (n = 6) e un gruppo EAE (n = 12) per questo studio. I topi sono stati acquistati dal centro per animali da esperimento della Ningxia Medical University. I topi sono stati alloggiati in una stanza a temperatura e umidità controllata con un ciclo luce/buio di 12 ore e libero accesso ad acqua fresca e cibo. L'approvazione etica è stata ottenuta dal Comitato Etico per gli Animali Sperimentali della Ningxia Medical University prima dell'inizio dello studio.

1. Sviluppo di EAE recidivante-remittente in topi C57BL/6

  1. Dissoluzione del reagente
    1. Sciogliere 5,4 mg di MOG35-55 (Tabella dei materiali) in 1,8 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Pesare 12,6 mg di Mycobacterium tuberculosis H37RA (Tabella dei materiali) e aggiungerlo a 1,8 mL di soluzione completa di adiuvante di Freund (CFA) (Tabella dei materiali). Sciogliere 360 μL di tossina della pertosse (PTX; Tabella dei materiali) in 7,2 mL di PBS utilizzando una pipetta (Tabella dei materiali).
  2. Preparazione dell'emulsione di MOG35-55 e CFA
    1. Pipettare la soluzione di MOG35-55 e la soluzione di CFA utilizzando due siringhe da 5 mL preparate al punto 1.1 e collegarle con una valvola a T. Mescolare continuamente con ghiaccio per 1 ora fino ad ottenere un'emulsione lattiginosa di acqua in olio.
      NOTA: L'emulsione viene preparata con successo quando galleggia sulla superficie dell'acqua senza disperdersi dopo averla lasciata cadere in acqua.
  3. Anestetizzazione del topo
    1. Svitare il tappo di riempimento all'estremità anteriore dell'evaporatore della macchina per anestesia. Versare lentamente 20 mL di isoflurano lungo la vite di chiusura al centro e bloccare il tappo di chiusura. Commutare l'interruttore della valvola a T per garantire che il flusso d'aria dall'evaporatore della macchina per anestesia venga comunicato con la scatola di induzione dell'anestesia (Tabella dei materiali).
    2. Collegare l'alimentazione della pompa dell'aria, accendere l'interruttore della pompa dell'aria e ruotare e regolare la valvola della fonte d'aria all'estremità anteriore del flussometro di ossigeno in modo che il flusso di gas in uscita sia di 400 ml/min. Aprire l'evaporatore, regolare la concentrazione di induzione al 3% e attendere che l'anestetico riempia la scatola di induzione.
    3. Circa 1 minuto dopo, metti i topi nella scatola di induzione, quindi chiudi la scatola di induzione e attendi che i topi siano in sonno profondo, rilassamento muscolare e respirazione costante; quindi, i topi potrebbero essere determinati come lo stato ideale di anestesia (Tabella dei materiali).
      NOTA: Cambiare l'interruttore della valvola a T per assicurarsi che il flusso d'aria dall'evaporatore della macchina per anestesia venga comunicato con la maschera per anestesia fino a quando i topi non sono completamente anestetizzati.
  4. Immunizzazione dei topi
    1. Iniettare per via sottocutanea 200 μL di emulsione preparata al punto 1.2 utilizzando una siringa da 1 mL con l'ago in quattro siti sul dorso del topo, a circa 0,5 cm su entrambi i lati della colonna vertebrale nel piano ascellare e inguinale12 nei topi del gruppo EAE. Utilizzare 50 μl di emulsione in ogni sito (Tabella dei materiali).
  5. Iniezione di PTX
    1. Togli i topi dalla gabbia afferrando la coda e posizionala sul filo della gabbia. Tenere la coda dei topi con il 4° e il 5° dito e tirarla delicatamente verso l'alto per mantenere la tendenza del corpo e degli arti in avanti. Afferra la testa dei topi e cattura la pelle sul retro dei topi usando il medio e l'anulare.
    2. A 0 ore e 48 ore dopo l'immunizzazione nella fase 1.4, iniettare 200 μL di PTX per via intraperitoneale nella posizione di 0,5 cm lungo entrambi i lati della linea addominale media con una profondità di penetrazione di 1-2 cm utilizzando una siringa da 1 ml con ago (Tabella dei materiali).
      NOTA: Prima di iniettare PTX a 48 ore dall'immunizzazione di MOG35-55, è necessario anestetizzare i topi utilizzando le procedure descritte al punto 1.3. I topi devono essere curati fino a quando non hanno riacquistato abbastanza coscienza per mantenere la decubito sternale.
    3. Per i topi del gruppo di controllo, trattare con soluzione salina utilizzando lo stesso metodo e valutare quotidianamente il punteggio clinico.
      NOTA: I topi sono stati valutati per i segni di EAE secondo la seguente scala13: 0 = nessun sintomo della malattia, 1 = paralisi completa della coda, 2 = paralisi parziale posteriore/debolezza, 3 = paralisi completa degli arti posteriori, 4 = paralisi degli arti anteriori e posteriori e 5 = stato moribondo.

2. Analisi istologica della colorazione

  1. Collezione Brain
    1. Anestetizzare i topi seguendo il passaggio 1.3. Eutanasia i topi mediante lussazione cervicale e aprire il torace per esporre completamente il cuore. Tagliare il padiglione auricolare in più e perfondere lentamente con una soluzione salina pre-raffreddata utilizzando una siringa da 20 ml con ago al ventricolo sinistro fino a quando il fegato diventa grigio e bianco.
    2. Perfondere lentamente con il 4% di paraformaldeide fino a quando la punta della coda si alza, il corpo diventa rigido e il fegato diventa duro. Decapitare la testa, tagliare il cranio, raccogliere il cervello con una pinzetta e fissarlo in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 24 ore (Tabella dei materiali).
  2. Preparazione delle sezioni di paraffina
    1. Disidratazione in gradiente: immergere i tessuti cerebrali dal passaggio 2.1 successivamente in etanolo al 70% per 1 ora, etanolo all'80% per 1 ora, etanolo al 95% per 1 ora, etanolo anidro per 1 ora, sostituire con etanolo anidro fresco, continuare l'immersione per 1 ora (Tabella dei materiali).
    2. Trasparenza: immergere i tessuti cerebrali del passaggio 2.2.1 nello xilene per 30 minuti, sostituirli con xilene fresco e continuare l'immersione fino a quando i tessuti non sono trasparenti (Tabella dei materiali).
    3. Inclusione: Incorporare i tessuti cerebrali del passaggio 2.2.2 nella paraffina per 1 ora, sostituire con paraffina fresca, continuare l'inclusione per 1 ora, tagliare a fette di 6 μm dopo il rilascio dello stampo, porre il vetrino in acqua calda, asciugare a 37 °C, conservare a temperatura ambiente (Tabella dei materiali).
    4. Decerazione: immergere i tessuti cerebrali del passaggio 2.2.3 nello xilene per 20 minuti, sostituire con xilene fresco, continuare l'immersione per 20 minuti, immergere in etanolo anidro per 5 minuti, sostituire con etanolo anidro fresco, immergere per 5 minuti, etanolo al 75% per 5 minuti, risciacquare con acqua di rubinetto (Tabella dei materiali).
    5. Colorazione con ematossilina-eosina (H&E): colorare i tessuti dal passaggio 2.2.4 con una soluzione di ematossilina per 3-5 minuti e quindi risciacquare con acqua di rubinetto. Trattare brevemente i tessuti con una soluzione di differenziazione dell'ematossilina e risciacquare abbondantemente con acqua di rubinetto. Trattare i tessuti con la soluzione bluing del rubinetto ematossilina Scott e risciacquare con acqua di rubinetto. Immergere in etanolo all'85% per 5 minuti e al 95% di etanolo per 5 minuti e colorare i passaggi con colorante eosina per 5 minuti (Tabella dei materiali).
    6. Disidratare: immergere successivamente i tessuti del passaggio 2.2.5 in etanolo anidro per 5 minuti, sostituire con etanolo anidro fresco, continuare l'immersione per 5 minuti, sostituire con etanolo anidro fresco, immergere per 5 minuti, xilene per 5 minuti, sostituire con xilene fresco, immergere per 5 minuti, sigillare con gomma neutra (Tabella dei materiali).
    7. Osservare al microscopio i tessuti cerebrali ed eseguire l'acquisizione e l'analisi delle immagini (Tabella dei materiali).

3. Analisi della colorazione LFB

  1. Raccolta della guaina mielinica: tagliare la colonna vertebrale del topo dal terminale della testa verso l'alto di 2 segmenti al terminale della coda verso il basso di 2 segmenti, soffiare il midollo spinale al terminale della coda e fissare il midollo spinale in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 24 ore.
    NOTA: La guaina mielinica è stata prelevata dagli stessi topi nel passaggio 2.1 e i passaggi per la perfusione cardiaca sono gli stessi del punto 2.1.
  2. Deparaffinazione e reidratazione delle sezioni di paraffina: Mettere i vetrini del passaggio 3.1 successivamente nello xilene per 20 minuti, sostituire con xilene fresco, continuare l'immersione per 20 minuti, etanolo anidro per 5 minuti, sostituire con etanolo anidro fresco, immergere per 5 minuti, alcool al 75% per 5 minuti, lavare con acqua di rubinetto.
  3. Colorazione blu rapida: Mettere la soluzione di colorazione blu rapida luxol A in un forno a 60 °C e preriscaldare per 30 minuti. Mettere i vetrini del passaggio 3.2 nella soluzione A e coprirli con una membrana di plastica per 1 ora per evitare che le fette si secchino, quindi estrarre i vetrini e lavarli rapidamente con acqua di rubinetto.
  4. Differenziazione dello sfondo: Inserire i vetrini del passaggio 3.3 nella soluzione di colorazione blu rapida luxol B per 2 s (mentre il colorante è caldo) e immergere direttamente nella soluzione di colorazione blu rapida luxol C per la differenziazione per 15 s, lavare con acqua fino a quando la guaina mielinica è blu e lo sfondo è quasi incolore.
  5. Colorazione antimacchia eosina: Mettere i vetrini del passaggio 3.4 in forno a 65 °C per l'asciugatura. Una volta pronti, toglieteli dal forno e lasciateli raffreddare. Mettere i vetrini in etanolo al 95% e anticolorazione con eosina per 1 minuto.
  6. Disidratazione e sigillatura: Mettere i vetrini del passaggio 3.5 successivamente in etanolo anidro per 5 minuti, sostituire con etanolo anidro fresco, continuare l'immersione per 5 minuti, sostituire con etanolo anidro fresco, continuare l'immersione per 5 minuti, xilene 5 minuti, sostituire con xilene fresco, immergere per 5 minuti. Lavare e asciugare i campioni e sigillarli con gomma neutra.
  7. Esame al microscopio: Raccogli e analizza le immagini utilizzando un microscopio ottico verticale (Tabella dei materiali).

4. Analisi della citometria a flusso

  1. Apri la cavità addominale dei topi. Estrarre la milza con una pinzetta e tritarla in piccoli pezzi di 1,5-2,5 cm in PBS su ghiaccio usando le forbici. Macinare la milza in 10 mL di RPMI-1640 contenente il 2% di siero fetale bovino (FBS) utilizzando un pistone siringa da 2,5 mL e spingerlo attraverso un filtro cellulare da 70 μm per ottenere una sospensione unicellulare (Tabella dei materiali).
    NOTA: La milza è stata prelevata dagli stessi topi nel passaggio 2.1.
  2. Trasferire la sospensione ottenuta al punto 4.1 in provette da 15 mL e lisare utilizzando 5 mL di tampone per lisi dei globuli rossi su ghiaccio per 10 min. Lavare con RPMI-1640 contenente il 2% di FBS, centrifugare a 350 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule con RPMI-1640 contenente il 2% di FBS.
  3. Contare le cellule con un contatore automatico di celle (Tabella dei materiali) e regolare la concentrazione a 1 x 106 cellule/mL.
  4. Pipettare 100 μL di sospensione cellulare in provette da 1,5 mL e incubare con 1 μL di anticorpo CD16/3214 (0,5 mg/mL) anti-topo per 30 minuti per bloccare la colorazione non specifica. Lavare con RPMI-1640 e centrifugare a 350 x g per 5 minuti, scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 100 μL di RPMI-1640 contenente il 2% di FBS.
  5. Colorare con anticorpi specifici per CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC) e CD69 (BV674) per le cellule Teff15 per 30 minuti, 2 μL per ogni anticorpo. Colorare con anticorpi specifici per CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC), CD44 (BV421) e CD62L (PE) per le cellule Tem16 per 30 minuti, 2 μL per ciascun anticorpo. Lavare con RPMI-1640 e centrifugare a 350 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 350 μL di PBS. Analizza la proporzione cellulare utilizzando un citometro a flusso e il software associato (Tabella dei materiali).

5. Analisi delle citochine mediante bead array citometrico

  1. Utilizzare l'array citometrico di microsfere (Tabella dei materiali) per misurare IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, il fattore di necrosi tumorale (TNF)-α e l'IFN-γ nel cervello dei topi, metodi come descritto di seguito.
  2. Raccogli il cervello del topo come descritto nel passaggio 2.1.
  3. Estrazione di proteine totali: tagliare e pesare 50 mg di tessuto cerebrale (tre cervelli nel gruppo di controllo, gruppo EAE nella fase di picco e fase RR). Posizionare il cervello in provette da 1,5 ml e aggiungere 500 μl di tampone di lisi contenente PMSF, inibitore della proteasi e inibitori della fosfatasi.
  4. Tagliare il cervello in piccoli pezzi di circa 1 mm3, estrarre con omogeneizzatore ad ultrasuoni a 400 W, 5 s ON e 5 s OFF; Ripeti per 5 volte. Mettere la provetta sul ghiaccio per 10 minuti, centrifugare a 12000 x g per 5 minuti e raccogliere il surnatante (Tabella dei materiali).
  5. Preparare gli standard di citochine Th1/Th2/Th17 di topo come descritto di seguito.
    1. Aprire una fiala di topo liofilizzato standard Th1/Th2/Th17. Trasferire gli standard in una provetta conica in polipropilene da 15 mL. Etichettare la parte superiore del tubo come standard.
    2. Ricostituire gli standard in 2,0 mL di diluente per saggi. Lasciare equilibrare lo standard ricostituito per 15 minuti a temperatura ambiente. Miscelare delicatamente la proteina ricostituita mediante pipettaggio.
    3. Etichettare le provette da 12 mm x 75 mm e disporle nel seguente ordine di diluizione: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 e 1:256. Pipettare 300 μl di diluente per saggi in ciascuna provetta etichettata.
    4. Eseguire diluizioni seriali: trasferire 300 μl dello standard superiore nella provetta di diluizione 1:2 e miscelare accuratamente mediante pipettaggio. Continuare le diluizioni seriali trasferendo 300 μl dalla provetta 1:2 alla provetta 1:4 e così via fino alla provetta 1:256. Preparare una provetta da 12 mm x 75 mm contenente solo il diluente del test da utilizzare come controllo negativo 0 pg/mL.
      NOTA: Miscelare accuratamente pipettando. Non vorticare per evitare che l'accoppiamento anticorpale sulle microsfere cada.
    5. Per miscelare le perle di cattura delle citochine Th1/Th2/Th17 di topo, preparare 19 provette, inclusi gli standard con 3 campioni in ciascun gruppo (gruppo di controllo, gruppo EAE in fase di picco e stadio RR) per l'esperimento. Agitare energicamente la sospensione del tallone di cattura per 5 s prima di mescolare. Aggiungere 190 μl di ciascuna perlina di cattura in una singola provetta ed etichettarla come microsfere di cattura mista. Agitare accuratamente la miscela di perline.
      NOTA: Le perle coniugate con anticorpi si depositeranno fuori dalla sospensione nel tempo. È necessario agitare il flaconcino prima di assumere un'aliquota di sospensione a tallone.
    6. Per eseguire il saggio, agitare le perle di cattura della miscela. Aggiungere 50 μl di perle a tutte le provette. Aggiungere 50 μl di diluizioni standard di citochine di topo Th1/Th2/Th17 alle provette di controllo come nella Tabella 1.
    7. Aggiungere 50 μl del reagente di rilevazione PE Th1/Th2/Th17 di topo a tutte le provette del saggio. Incubare le provette per 2 ore a temperatura ambiente e proteggerle dalla luce. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio a ciascuna provetta del saggio e centrifugare a 200 x g per 5 minuti. Aspirare ed eliminare con cura il surnatante da ciascuna provetta del saggio.
    8. Aggiungere 300 μl di tampone di lavaggio a ciascuna provetta per risospendere il pellet di microsfere. Analizza i dati delle citochine Th1/Th2/Th17 di topo utilizzando il software FCAP Array (Table of Materials).

  

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Risultati

Valutazione dei punteggi clinici
Come mostrato nella Figura 1, i topi del gruppo di controllo non hanno mostrato alcun sintomo clinico. I topi del gruppo EAE, che sono stati immunizzati con MOG35-55, hanno mostrato paralisi della coda circa 12 giorni dopo l'immunizzazione. Entro il giorno 16, i sintomi hanno raggiunto la paralisi completa degli arti posteriori (definita come fase di picco, picco). Successivamente, i sintomi sono stati gradualmente dimessi. I sintomi clini...

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Discussione

La SM è la malattia demielinizzante autoimmune più diffusa del SNC, che colpisce milioni di persone in tutto il mondo17. L'EAE è il tipico modello animale per simulare le caratteristiche cliniche patologiche della SM18. Gli studi hanno dimostrato che gli individui con SM sperimentano un deterioramento cognitivo e altre disabilità dovute alla degenerazione degli assoni e dei neuroni nel SNC 19,20,21.

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Natural Science Foundation of Ningxia (2022AAC03601 e 2023AAC02087) e dalla Research Foundation of Ningxia Medical University (XM2019052). Grazie per il supporto del Centro di Ricerca sulla Scienza e la Tecnologia Medica della Ningxia Medical University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Evaporatore per macchina per anestesiaNorvap20-17368
  IsofluraneSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.
70 μ filtro per cellule mXIYAN Co.,Ltd.15-1070
Alexa Fluor 700 anti-topo CD45 AnticorpoBiolegend103128
APC anti-topo CD4 AnticorpoBiolegend100616
Contatore automatico di celluleJiangsu JIMBIO technology Co., LTDJIMBIO iCyta S2
BD* Kit CBA citometrico per topi Th1/Th2/Th17 BDBiosciences560485
Biotina anti-topo CD16/32 AnticorpoBiolegend101303
Brilliant Violet 510 anti-topo CD69 AnticorpoBiolegend104532
BV786 Rat Anti-Mouse CD62L(MEL-14)BD Pharmingen563109
Colonna Tissue& Kit di estrazione di proteine cellulariShanghai Epizyme Biomedical Technology Co., LtdPC201Plus
Completo di Freund adiuvanteSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. 
EssiccatoreDIAPATHDonatello
Siringa sterilizzata monouso (1 mL)Yikang Group210820
Siringa sterilizzata monouso (2,5 mL)Yikang Group210820
Siringa sterilizzata monouso (5 mL)Yikang Group210820
Macchina per tinturaDIAPATHGiotto
Macchina per l'inclusioneWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
EtanoloSCRC100092683
Fetale Siero BovinoProcell Life Science& Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.FSP500
FITC Criceto Anti-Topo CD3e(145-2C11)BD Pharmingen553062
Citometro a flussoBecton,Dickinson and CompanyFACSCelesta
Citometro a flussoBecton,Dickinson and CompanyAccuri C6
Flow Jo softwareBD Biosciences10.8.1
Piattaforma congelataWuhan Junjie Electronics Co., Ltd JB-L5
VetrinoServicebioG6004
HE Set di soluzioni colorantiServicebioG1003
Soluzione ematossilina-eosinaServicebioG1002
Centrifuga refrigerata ad alta velocitàThermo Fisher ScientificMogafugo8R
Sistema di imagingNikonNIKON DS-U3
Kit di colorazione blu veloce LuxolServicebioG1030
Ms CD44 BV421 IM7BD Pharmingen564970
Mycobacterium tuberculosis H37RABD Pharmingen231141
Glicoproteina oligodendrocitaria mielina (MOG35-55)AnaSpecAS-60130-1
Gomma neutraSCRC10004160
OrganizerKEDEEKD-P
FornoLaboteryGFL-230
Affettatrice patologicaLeicaRM2016
Tossina pertosse da Bordetella pertussisSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.P7208
Soluzione salina tamponata con fosfatoServicebioG4202
Pipetta 0,5-10 μ LDLAB Scientific7010101004
Pipetta 100-1000 μ LDLAB Scientific 7010101014
Pipetta 20-200 μ LDLAB Scientific7010101009
RPMI-1640Procell Life Science& Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.
Valvola a TGuangdong Kanghua Medical Co., LTDA06
Spalmatore di tessutiZhejiang Kehua Instrument Co., LtdKD-P
Microscopio ottico verticaleNikonNIKON ECLIPSE E100
XileneSCRC10023418
792632SLCH4887PM150110

Riferimenti

  1. Swanberg, K., et al. Multiple sclerosis diagnosis and phenotype identification by multivariate classification of in vivo frontal cortex metabolite profiles. Sci Rep. 12 (1), 13888(2022).
  2. Zahoor, I., et al. An emerging potential of metabolomics in multiple sclerosis: a comprehensive overview. Cell Mol Life Sci. 78 (7), 3181-3203 (2021).
  3. Vitturi, B., et al. Spatial and temporal distribution of the prevalence of unemployment and early retirement in people with multiple sclerosis: A systematic review with meta-analysis. PloS one. 17 (7), 0272156(2022).
  4. Brambilla, R. The contribution of astrocytes to the neuroinflammatory response in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Acta neuropathologica. 137 (5), 757-783 (2019).
  5. Niedźwiedzka-Rystwej, P., Tokarz-Deptuła, B., Deptuła, W. Characteristics of T lymphocyte subpopulations. Postepy Hig Med Dosw. 67, 371-379 (2013).
  6. Loos, J., et al. Functional characteristics of Th1, Th17, and ex-Th17 cells in EAE revealed by intravital two-photon microscopy. J neuroinflammation. 17 (1), 357(2020).
  7. Prajeeth, C., et al. Effectors of Th1 and Th17 cells act on astrocytes and augment their neuroinflammatory properties. J neuroinflammation. 14 (1), 204(2017).
  8. Nielsen Birgitte, R., et al. Characterization of naïve, memory and effector T cells in progressive multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 310, 17-25 (2017).
  9. Xie, L., et al. The role of CD4+ T cells in tumor and chronic viral immune responses. Med Comm. 4 (5), e390(2023).
  10. Sun, L., et al. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  11. Kawabe, T., et al. Memory-phenotype CD4+ T cells spontaneously generated under steady-state conditions exert innate TH1-like effector function. Sci Immunol. 2 (12), (2017).
  12. Moon, J., et al. A study of experimental autoimmune encephalomyelitis in dogs as a disease model for canine necrotizing encephalitis. J Vet Sci. 16 (2), 203-211 (2015).
  13. Pérez-Nievas, B., et al. Chronic immobilisation stress ameliorates clinical score and neuroinflammation in a MOG-induced EAE in Dark Agouti rats: mechanisms implicated. J neuroinflammation. 7, 60(2010).
  14. Zheng, J., et al. Prostaglandin D2 signaling in dendritic cells is critical for the development of EAE. J Autoimmun. 114, 102508(2020).
  15. Adamczyk, M., et al. The expression of activation markers CD25 and CD69 increases during biologic treatment of Psoriasis. J Clin Med. 12 (20), 6573(2023).
  16. Meng, R., et al. Echinococcus multilocularisIndoleamine 2,3-dioxygenase 1 signaling orchestrates immune tolerance in -infected mice. Front Immunol. 13, 1032280(2022).
  17. Sheinin, M., et al. Suppression of experimental autoimmune Encephalomyelitis in mice by β-Hydroxy β-Methylbutyrate, a body-building supplement in humans. J Immunol. 211 (2), 187-198 (2023).
  18. Ghareghani, M., et al. Hormones in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) animal models. Transl Neurosci. 12 (1), 164-189 (2021).
  19. Pérez-Miralles, F., et al. Clinical impact of early brain atrophy in clinically isolated syndromes. Mult Scler. 19 (14), 1878-1886 (2013).
  20. Nygaard, G., et al. Cortical thickness and surface area relate to specific symptoms in early relapsing-remitting multiple sclerosis. Mult Scler. 21 (4), 402-414 (2015).
  21. Biberacher, V., et al. Atrophy and structural variability of the upper cervical cord in early multiple sclerosis. Mult Scler. 21 (7), 875-884 (2015).
  22. Ma, Y., et al. Epsilon toxin-producing Clostridium perfringens colonize the multiple sclerosis gut microbiome overcoming CNS immune privilege. J Clin Invest. 133 (9), e163239(2023).
  23. Cibrián, D., Sánchez, M. CD69: from activation marker to metabolic gatekeeper. Eur J Immunol. 47 (6), 946-953 (2017).
  24. Clarkson Benjamin, D., et al. Preservation of antigen-specific responses in cryopreserved CD4 and CD8 T cells expanded with IL-2 and IL-7. J Transl Autoimmun. 5, 100173(2022).
  25. Raeber Miro, E., et al. The role of cytokines in T-cell memory in health and disease. Immunol Rev. 283 (1), 176-193 (2018).
  26. Ville, S., et al. Co-stimulatory blockade of the CD28/CD80-86/CTLA-4 balance in transplantation: Impact on memory T cells. Front Immunol. 6, 411(2015).
  27. Natalini, A., et al. OMIP-079: Cell cycle of CD4+ and CD8+ naïve/memory T cell subsets, and of Treg cells from mouse spleen. Cytometry A. 99 (12), 1171-1175 (2021).
  28. Joffre, O., et al. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  29. Montes, M., et al. Oligoclonal myelin-reactive T-cell infiltrates derived from multiple sclerosis lesions are enriched in Th17 cells. Clin Immunol. 130 (2), 133-144 (2009).
  30. Feruglio, S., Kvale, D., Dyrhol, R. T. Cell responses and regulation and the impact of in vitro IL-10 and TGF-β modulation during treatment of active tuberculosis. Scand J Immunol. 85 (2), 138-146 (2017).

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