Ruolo delle cellule T CD4 nell'encefalomielite autoimmune sperimentale recidivante-remittente

Sommario

Un modello sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE) nei topi è stato impiegato per studiare il ruolo delle cellule T CD4 nell'iniziale e nella recidiva dell'EAE dal punto di vista della fase di attivazione e della funzione dell'effetto immunitario.

Abstract

La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune caratterizzata dall'infiltrazione di cellule immunitarie e dalla demielinizzazione nel sistema nervoso centrale (SNC). L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) funge da modello animale prototipico per lo studio della SM. In questo studio, abbiamo mirato a indagare il ruolo delle cellule T CD4 nell'inizio e nella recidiva dell'EAE, concentrandoci sulla fase di attivazione e sulla risposta immunitaria. Per creare il modello di topi EAE, le femmine di topo sono state immunizzate con glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG)35-55 emulsionata con adiuvante di Freund completo (CFA). I punteggi clinici sono stati valutati giornalmente e i risultati hanno dimostrato che i topi nel gruppo EAE mostravano un classico modello recidivante-remittente. L'analisi della colorazione con ematossilina-eosina (H&E) e luxol fast blue (LFB) ha rivelato una significativa infiltrazione di cellule infiammatorie nel SNC e demielinizzazione nei topi EAE. Per quanto riguarda la fase di attivazione, sia le cellule T effettrici CD4⁺CD69⁺ (Teff) che le cellule T effettrici di memoria CD4⁺CD44⁺CD62L^- (Tem) possono contribuire all'inizio dell'EAE, tuttavia, la fase di recidiva era probabilmente dominata dalle cellule CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem. Inoltre, in termini di funzione immunitaria, le cellule helper T (Th)1 sono principalmente coinvolte nell'avvio dell'EAE. Tuttavia, entrambe le cellule Th1 e Th17 contribuiscono alla fase di recidiva e la funzione immunosoppressiva delle cellule T regolatorie (Treg) è stata inibita durante il processo patologico EAE.

Introduzione

La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune caratterizzata dall'infiltrazione del sistema nervoso centrale (SNC) con cellule immunitarie e demielinizzazione ^1,2. Uno studio recente ha dimostrato che è la malattia invalidante più comune che colpisce i giovani, con una sua incidenza in continuo aumento in tutto il mondo³. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un prototipo animale di SM che simula molti aspetti della fase infiammatoria della SM⁴ umana. Dal punto di vista delle funzioni immunitarie, le cellule T CD4 iniziali che non hanno ancora incontrato antigeni sono indicate come cellule helper T(Th) 0. Queste cellule subiscono processi di maturazione e attivazione per esibire varie funzioni. Le cellule T CD4 possono essere classificate in diversi sottogruppi in base alle loro funzioni specifiche, che includono Th1, Th2, T regolatori (Treg), helper follicolare T (Tfh), Th17, Th9 e cellule Th22⁵. È opinione comune che i sottotipi cellulari Th1 e Th17 siano fattori cruciali di patogenesi dell'EAE⁶. Le cellule Th1 potrebbero secernere interferone γ (IFN-γ) e le cellule Th17 secernono interleuchina (IL)-17 e altri fattori infiammatori, che potrebbero attivare altre cellule immunitarie come le cellule microgliali e gli astrociti. Queste cellule producono citochine infiammatorie⁷, come IL-18, IL-12, IL-23 e IL-1β, che potrebbero indurre ulteriormente la risposta immunitaria delle cellule Th1/Th17, con conseguente demielinizzazione progressiva e danno assonale. Dal punto di vista della fase di attivazione, le cellule T CD4 possiedono un destino predeterminato di svilupparsi in sottoinsiemi cellulari distinti e stati differenziati, tra cui cellule T naive, effettrici e di memoria⁸. Le cellule T CD4 iniziali proliferano e si differenziano in una varietà di sottogruppi di effettori con funzioni diverse in ambienti diversi⁹. La maggior parte delle cellule effettrici ha vita breve, con una piccola popolazione di cellule T che si sviluppa in cellule T di memoria che mostrano rapide funzioni effettrici quando si incontrano nuovamente gli stessi antigeni e forniscono all'ospite una protezione altamente potente e a lungo termine^10,11.

Sebbene la ricerca attuale suggerisca che le cellule T CD4 svolgano un ruolo significativo nello sviluppo dell'EAE, non è ancora chiaro come i diversi sottogruppi di cellule T CD4, classificati in base alla loro fase di attivazione e alla funzione dell'effetto immunitario, contribuiscano all'inizio e alla recidiva dell'EAE. Nel presente studio, abbiamo stabilito il modello EAE nei topi C57BL6/J immunizzando il peptide della glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG)35-55 e abbiamo studiato l'inizio e la recidiva dell'EAE, concentrandoci sulla fase di attivazione e sulla funzione immunitaria delle cellule T CD4.

Protocollo

Un totale di 18 topi femmina C57BL/6J di età compresa tra sei e otto settimane sono stati divisi casualmente in un gruppo di controllo (n = 6) e un gruppo EAE (n = 12) per questo studio. I topi sono stati acquistati dal centro per animali da esperimento della Ningxia Medical University. I topi sono stati alloggiati in una stanza a temperatura e umidità controllata con un ciclo luce/buio di 12 ore e libero accesso ad acqua fresca e cibo. L'approvazione etica è stata ottenuta dal Comitato Etico per gli Animali Sperimentali della Ningxia Medical University prima dell'inizio dello studio.

1. Sviluppo di EAE recidivante-remittente in topi C57BL/6

1. Dissoluzione del reagente
   1. Sciogliere 5,4 mg di MOG35-55 (Tabella dei materiali) in 1,8 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Pesare 12,6 mg di Mycobacterium tuberculosis H37RA (Tabella dei materiali) e aggiungerlo a 1,8 mL di soluzione completa di adiuvante di Freund (CFA) (Tabella dei materiali). Sciogliere 360 μL di tossina della pertosse (PTX; Tabella dei materiali) in 7,2 mL di PBS utilizzando una pipetta (Tabella dei materiali).
2. Preparazione dell'emulsione di MOG35-55 e CFA
   1. Pipettare la soluzione di MOG35-55 e la soluzione di CFA utilizzando due siringhe da 5 mL preparate al punto 1.1 e collegarle con una valvola a T. Mescolare continuamente con ghiaccio per 1 ora fino ad ottenere un'emulsione lattiginosa di acqua in olio.
      NOTA: L'emulsione viene preparata con successo quando galleggia sulla superficie dell'acqua senza disperdersi dopo averla lasciata cadere in acqua.
3. Anestetizzazione del topo
   1. Svitare il tappo di riempimento all'estremità anteriore dell'evaporatore della macchina per anestesia. Versare lentamente 20 mL di isoflurano lungo la vite di chiusura al centro e bloccare il tappo di chiusura. Commutare l'interruttore della valvola a T per garantire che il flusso d'aria dall'evaporatore della macchina per anestesia venga comunicato con la scatola di induzione dell'anestesia (Tabella dei materiali).
   2. Collegare l'alimentazione della pompa dell'aria, accendere l'interruttore della pompa dell'aria e ruotare e regolare la valvola della fonte d'aria all'estremità anteriore del flussometro di ossigeno in modo che il flusso di gas in uscita sia di 400 ml/min. Aprire l'evaporatore, regolare la concentrazione di induzione al 3% e attendere che l'anestetico riempia la scatola di induzione.
   3. Circa 1 minuto dopo, metti i topi nella scatola di induzione, quindi chiudi la scatola di induzione e attendi che i topi siano in sonno profondo, rilassamento muscolare e respirazione costante; quindi, i topi potrebbero essere determinati come lo stato ideale di anestesia (Tabella dei materiali).
      NOTA: Cambiare l'interruttore della valvola a T per assicurarsi che il flusso d'aria dall'evaporatore della macchina per anestesia venga comunicato con la maschera per anestesia fino a quando i topi non sono completamente anestetizzati.
4. Immunizzazione dei topi
   1. Iniettare per via sottocutanea 200 μL di emulsione preparata al punto 1.2 utilizzando una siringa da 1 mL con l'ago in quattro siti sul dorso del topo, a circa 0,5 cm su entrambi i lati della colonna vertebrale nel piano ascellare e inguinale¹² nei topi del gruppo EAE. Utilizzare 50 μl di emulsione in ogni sito (Tabella dei materiali).
5. Iniezione di PTX
   1. Togli i topi dalla gabbia afferrando la coda e posizionala sul filo della gabbia. Tenere la coda dei topi con il 4° e il 5° dito e tirarla delicatamente verso l'alto per mantenere la tendenza del corpo e degli arti in avanti. Afferra la testa dei topi e cattura la pelle sul retro dei topi usando il medio e l'anulare.
   2. A 0 ore e 48 ore dopo l'immunizzazione nella fase 1.4, iniettare 200 μL di PTX per via intraperitoneale nella posizione di 0,5 cm lungo entrambi i lati della linea addominale media con una profondità di penetrazione di 1-2 cm utilizzando una siringa da 1 ml con ago (Tabella dei materiali).
      NOTA: Prima di iniettare PTX a 48 ore dall'immunizzazione di MOG35-55, è necessario anestetizzare i topi utilizzando le procedure descritte al punto 1.3. I topi devono essere curati fino a quando non hanno riacquistato abbastanza coscienza per mantenere la decubito sternale.
   3. Per i topi del gruppo di controllo, trattare con soluzione salina utilizzando lo stesso metodo e valutare quotidianamente il punteggio clinico.
      NOTA: I topi sono stati valutati per i segni di EAE secondo la seguente scala¹³: 0 = nessun sintomo della malattia, 1 = paralisi completa della coda, 2 = paralisi parziale posteriore/debolezza, 3 = paralisi completa degli arti posteriori, 4 = paralisi degli arti anteriori e posteriori e 5 = stato moribondo.

2. Analisi istologica della colorazione

1. Collezione Brain
   1. Anestetizzare i topi seguendo il passaggio 1.3. Eutanasia i topi mediante lussazione cervicale e aprire il torace per esporre completamente il cuore. Tagliare il padiglione auricolare in più e perfondere lentamente con una soluzione salina pre-raffreddata utilizzando una siringa da 20 ml con ago al ventricolo sinistro fino a quando il fegato diventa grigio e bianco.
   2. Perfondere lentamente con il 4% di paraformaldeide fino a quando la punta della coda si alza, il corpo diventa rigido e il fegato diventa duro. Decapitare la testa, tagliare il cranio, raccogliere il cervello con una pinzetta e fissarlo in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 24 ore (Tabella dei materiali).
2. Preparazione delle sezioni di paraffina
   1. Disidratazione in gradiente: immergere i tessuti cerebrali dal passaggio 2.1 successivamente in etanolo al 70% per 1 ora, etanolo all'80% per 1 ora, etanolo al 95% per 1 ora, etanolo anidro per 1 ora, sostituire con etanolo anidro fresco, continuare l'immersione per 1 ora (Tabella dei materiali).
   2. Trasparenza: immergere i tessuti cerebrali del passaggio 2.2.1 nello xilene per 30 minuti, sostituirli con xilene fresco e continuare l'immersione fino a quando i tessuti non sono trasparenti (Tabella dei materiali).
   3. Inclusione: Incorporare i tessuti cerebrali del passaggio 2.2.2 nella paraffina per 1 ora, sostituire con paraffina fresca, continuare l'inclusione per 1 ora, tagliare a fette di 6 μm dopo il rilascio dello stampo, porre il vetrino in acqua calda, asciugare a 37 °C, conservare a temperatura ambiente (Tabella dei materiali).
   4. Decerazione: immergere i tessuti cerebrali del passaggio 2.2.3 nello xilene per 20 minuti, sostituire con xilene fresco, continuare l'immersione per 20 minuti, immergere in etanolo anidro per 5 minuti, sostituire con etanolo anidro fresco, immergere per 5 minuti, etanolo al 75% per 5 minuti, risciacquare con acqua di rubinetto (Tabella dei materiali).
   5. Colorazione con ematossilina-eosina (H&E): colorare i tessuti dal passaggio 2.2.4 con una soluzione di ematossilina per 3-5 minuti e quindi risciacquare con acqua di rubinetto. Trattare brevemente i tessuti con una soluzione di differenziazione dell'ematossilina e risciacquare abbondantemente con acqua di rubinetto. Trattare i tessuti con la soluzione bluing del rubinetto ematossilina Scott e risciacquare con acqua di rubinetto. Immergere in etanolo all'85% per 5 minuti e al 95% di etanolo per 5 minuti e colorare i passaggi con colorante eosina per 5 minuti (Tabella dei materiali).
   6. Disidratare: immergere successivamente i tessuti del passaggio 2.2.5 in etanolo anidro per 5 minuti, sostituire con etanolo anidro fresco, continuare l'immersione per 5 minuti, sostituire con etanolo anidro fresco, immergere per 5 minuti, xilene per 5 minuti, sostituire con xilene fresco, immergere per 5 minuti, sigillare con gomma neutra (Tabella dei materiali).
   7. Osservare al microscopio i tessuti cerebrali ed eseguire l'acquisizione e l'analisi delle immagini (Tabella dei materiali).

3. Analisi della colorazione LFB

1. Raccolta della guaina mielinica: tagliare la colonna vertebrale del topo dal terminale della testa verso l'alto di 2 segmenti al terminale della coda verso il basso di 2 segmenti, soffiare il midollo spinale al terminale della coda e fissare il midollo spinale in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 24 ore.
   NOTA: La guaina mielinica è stata prelevata dagli stessi topi nel passaggio 2.1 e i passaggi per la perfusione cardiaca sono gli stessi del punto 2.1.
2. Deparaffinazione e reidratazione delle sezioni di paraffina: Mettere i vetrini del passaggio 3.1 successivamente nello xilene per 20 minuti, sostituire con xilene fresco, continuare l'immersione per 20 minuti, etanolo anidro per 5 minuti, sostituire con etanolo anidro fresco, immergere per 5 minuti, alcool al 75% per 5 minuti, lavare con acqua di rubinetto.
3. Colorazione blu rapida: Mettere la soluzione di colorazione blu rapida luxol A in un forno a 60 °C e preriscaldare per 30 minuti. Mettere i vetrini del passaggio 3.2 nella soluzione A e coprirli con una membrana di plastica per 1 ora per evitare che le fette si secchino, quindi estrarre i vetrini e lavarli rapidamente con acqua di rubinetto.
4. Differenziazione dello sfondo: Inserire i vetrini del passaggio 3.3 nella soluzione di colorazione blu rapida luxol B per 2 s (mentre il colorante è caldo) e immergere direttamente nella soluzione di colorazione blu rapida luxol C per la differenziazione per 15 s, lavare con acqua fino a quando la guaina mielinica è blu e lo sfondo è quasi incolore.
5. Colorazione antimacchia eosina: Mettere i vetrini del passaggio 3.4 in forno a 65 °C per l'asciugatura. Una volta pronti, toglieteli dal forno e lasciateli raffreddare. Mettere i vetrini in etanolo al 95% e anticolorazione con eosina per 1 minuto.
6. Disidratazione e sigillatura: Mettere i vetrini del passaggio 3.5 successivamente in etanolo anidro per 5 minuti, sostituire con etanolo anidro fresco, continuare l'immersione per 5 minuti, sostituire con etanolo anidro fresco, continuare l'immersione per 5 minuti, xilene 5 minuti, sostituire con xilene fresco, immergere per 5 minuti. Lavare e asciugare i campioni e sigillarli con gomma neutra.
7. Esame al microscopio: Raccogli e analizza le immagini utilizzando un microscopio ottico verticale (Tabella dei materiali).

4. Analisi della citometria a flusso

1. Apri la cavità addominale dei topi. Estrarre la milza con una pinzetta e tritarla in piccoli pezzi di 1,5-2,5 cm in PBS su ghiaccio usando le forbici. Macinare la milza in 10 mL di RPMI-1640 contenente il 2% di siero fetale bovino (FBS) utilizzando un pistone siringa da 2,5 mL e spingerlo attraverso un filtro cellulare da 70 μm per ottenere una sospensione unicellulare (Tabella dei materiali).
   NOTA: La milza è stata prelevata dagli stessi topi nel passaggio 2.1.
2. Trasferire la sospensione ottenuta al punto 4.1 in provette da 15 mL e lisare utilizzando 5 mL di tampone per lisi dei globuli rossi su ghiaccio per 10 min. Lavare con RPMI-1640 contenente il 2% di FBS, centrifugare a 350 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule con RPMI-1640 contenente il 2% di FBS.
3. Contare le cellule con un contatore automatico di celle (Tabella dei materiali) e regolare la concentrazione a 1 x 10⁶ cellule/mL.
4. Pipettare 100 μL di sospensione cellulare in provette da 1,5 mL e incubare con 1 μL di anticorpo CD16/32¹⁴ (0,5 mg/mL) anti-topo per 30 minuti per bloccare la colorazione non specifica. Lavare con RPMI-1640 e centrifugare a 350 x g per 5 minuti, scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 100 μL di RPMI-1640 contenente il 2% di FBS.
5. Colorare con anticorpi specifici per CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC) e CD69 (BV674) per le cellule Teff¹⁵ per 30 minuti, 2 μL per ogni anticorpo. Colorare con anticorpi specifici per CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC), CD44 (BV421) e CD62L (PE) per le cellule Tem¹⁶ per 30 minuti, 2 μL per ciascun anticorpo. Lavare con RPMI-1640 e centrifugare a 350 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 350 μL di PBS. Analizza la proporzione cellulare utilizzando un citometro a flusso e il software associato (Tabella dei materiali).

5. Analisi delle citochine mediante bead array citometrico

1. Utilizzare l'array citometrico di microsfere (Tabella dei materiali) per misurare IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, il fattore di necrosi tumorale (TNF)-α e l'IFN-γ nel cervello dei topi, metodi come descritto di seguito.
2. Raccogli il cervello del topo come descritto nel passaggio 2.1.
3. Estrazione di proteine totali: tagliare e pesare 50 mg di tessuto cerebrale (tre cervelli nel gruppo di controllo, gruppo EAE nella fase di picco e fase RR). Posizionare il cervello in provette da 1,5 ml e aggiungere 500 μl di tampone di lisi contenente PMSF, inibitore della proteasi e inibitori della fosfatasi.
4. Tagliare il cervello in piccoli pezzi di circa 1 mm³, estrarre con omogeneizzatore ad ultrasuoni a 400 W, 5 s ON e 5 s OFF; Ripeti per 5 volte. Mettere la provetta sul ghiaccio per 10 minuti, centrifugare a 12000 x g per 5 minuti e raccogliere il surnatante (Tabella dei materiali).
5. Preparare gli standard di citochine Th1/Th2/Th17 di topo come descritto di seguito.
   1. Aprire una fiala di topo liofilizzato standard Th1/Th2/Th17. Trasferire gli standard in una provetta conica in polipropilene da 15 mL. Etichettare la parte superiore del tubo come standard.
   2. Ricostituire gli standard in 2,0 mL di diluente per saggi. Lasciare equilibrare lo standard ricostituito per 15 minuti a temperatura ambiente. Miscelare delicatamente la proteina ricostituita mediante pipettaggio.
   3. Etichettare le provette da 12 mm x 75 mm e disporle nel seguente ordine di diluizione: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 e 1:256. Pipettare 300 μl di diluente per saggi in ciascuna provetta etichettata.
   4. Eseguire diluizioni seriali: trasferire 300 μl dello standard superiore nella provetta di diluizione 1:2 e miscelare accuratamente mediante pipettaggio. Continuare le diluizioni seriali trasferendo 300 μl dalla provetta 1:2 alla provetta 1:4 e così via fino alla provetta 1:256. Preparare una provetta da 12 mm x 75 mm contenente solo il diluente del test da utilizzare come controllo negativo 0 pg/mL.
      NOTA: Miscelare accuratamente pipettando. Non vorticare per evitare che l'accoppiamento anticorpale sulle microsfere cada.
   5. Per miscelare le perle di cattura delle citochine Th1/Th2/Th17 di topo, preparare 19 provette, inclusi gli standard con 3 campioni in ciascun gruppo (gruppo di controllo, gruppo EAE in fase di picco e stadio RR) per l'esperimento. Agitare energicamente la sospensione del tallone di cattura per 5 s prima di mescolare. Aggiungere 190 μl di ciascuna perlina di cattura in una singola provetta ed etichettarla come microsfere di cattura mista. Agitare accuratamente la miscela di perline.
      NOTA: Le perle coniugate con anticorpi si depositeranno fuori dalla sospensione nel tempo. È necessario agitare il flaconcino prima di assumere un'aliquota di sospensione a tallone.
   6. Per eseguire il saggio, agitare le perle di cattura della miscela. Aggiungere 50 μl di perle a tutte le provette. Aggiungere 50 μl di diluizioni standard di citochine di topo Th1/Th2/Th17 alle provette di controllo come nella Tabella 1.
   7. Aggiungere 50 μl del reagente di rilevazione PE Th1/Th2/Th17 di topo a tutte le provette del saggio. Incubare le provette per 2 ore a temperatura ambiente e proteggerle dalla luce. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio a ciascuna provetta del saggio e centrifugare a 200 x g per 5 minuti. Aspirare ed eliminare con cura il surnatante da ciascuna provetta del saggio.
   8. Aggiungere 300 μl di tampone di lavaggio a ciascuna provetta per risospendere il pellet di microsfere. Analizza i dati delle citochine Th1/Th2/Th17 di topo utilizzando il software FCAP Array (Table of Materials).

  

Risultati

Valutazione dei punteggi clinici
Come mostrato nella Figura 1, i topi del gruppo di controllo non hanno mostrato alcun sintomo clinico. I topi del gruppo EAE, che sono stati immunizzati con MOG35-55, hanno mostrato paralisi della coda circa 12 giorni dopo l'immunizzazione. Entro il giorno 16, i sintomi hanno raggiunto la paralisi completa degli arti posteriori (definita come fase di picco, picco). Successivamente, i sintomi sono stati gradualmente dimessi. I sintomi clinici dei topi si sono aggravati intorno al giorno 25 e hanno raggiunto la paralisi completa degli arti posteriori intorno al giorno 30 (definita come stadio recidivante, RR). In particolare, i sintomi sono durati più a lungo rispetto alla volta precedente, che ha sviluppato una classica caratteristica recidivante-remittente. La manifestazione principale dei topi EAE recidivante-remittente sperimenta diversi stadi di focolaio, remissione e recidiva durante la progressione della malattia, che hanno una certa periodicità e fluttuazione.

Analisi istologica
I topi del gruppo di controllo mostravano una struttura del tessuto cerebrale intatta con vasi sanguigni uniformemente distribuiti e chiaramente definiti, senza alcuna infiltrazione di cellule infiammatorie. (Figura 2A). Nella fase di picco dei topi del gruppo EAE, è stata osservata una significativa infiltrazione di cellule infiammatorie nel cervello (Figura 2B), formando cambiamenti simili a bracciali attorno ai vasi sanguigni (indicati dalla freccia rossa). Allo stesso modo, nei topi del gruppo EAE allo stadio RR, c'era un'evidente infiltrazione di cellule infiammatorie (Figura 2C), con un'aggregazione predominante attorno ai vasi sanguigni (indicata dalla freccia rossa).

Analisi della colorazione LFB
Nel gruppo di controllo, la guaina mielinica della sostanza bianca spinale appariva blu, indicando che la sua struttura era intatta e strettamente impacchettata (Figura 3A). Nella fase di picco del gruppo EAE, la sostanza bianca spinale mostrava un colore azzurro chiaro o bianco; la struttura appariva allentata e discontinua, con una significativa presenza di degenerazioni vacuolari indicate da una freccia rossa (Figura 3B). Nella fase RR del gruppo modello EAE, è stata osservata un'estesa perdita di mielina della sostanza bianca nel midollo spinale. La struttura sembrava essere allentata e si poteva osservare un numero significativo di degenerazioni vacuolari (indicate da frecce rosse; Figura 3C).

Saggio di citometria a flusso
I risultati illustrati nella Figura 4A, B hanno dimostrato un aumento significativo della proporzione di cellule Teff CD4⁺CD69⁺ nei topi EAE allo stadio di picco rispetto al gruppo di controllo (P < 0,0001). Inoltre, la proporzione di queste cellule è aumentata anche durante la fase RR, sebbene la differenza non fosse statisticamente significativa (P > 0,05). La Figura 4C,D ha rivelato un notevole aumento della proporzione di cellule CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem nei topi EAE sia allo stadio di picco che a RR, rispetto al gruppo di controllo (P < 0,0001).

Citochine misurate mediante array di microsfere citometriche
I risultati illustrati nella Figura 5 dimostrano che, rispetto al gruppo di controllo, i livelli di IL-4 (P < 0,0001), IL-6 (P < 0,001), IFN-γ (P < 0,0001) e TNF-α (P < 0,0001) erano significativamente elevati nel gruppo EAE nella fase di picco. Sebbene anche l'espressione di IL-17A sia aumentata, la differenza non era statisticamente significativa (P > 0,05). Inoltre, il livello di IL-2 non ha mostrato alcun cambiamento durante la fase di picco dei topi EAE (P > 0,05); tuttavia, è aumentato significativamente durante la fase RR (P < 0,01). Inoltre, entrambe le espressioni di TNF-α (P < 0,001) e IL-17A (P < 0,01) nello stadio RR erano significativamente più alte di quelle osservate nel gruppo di controllo. Al contrario, l'espressione di IL-10 nel gruppo EAE era significativamente inferiore a quella del gruppo di controllo, sia allo stadio di picco che a quello RR (P < 0,0001).

Figura 1: Valutazione del punteggio clinico. Il punteggio clinico è stato valutato giornalmente e mostra che i topi hanno sviluppato un classico EAE recidivante-remittente immunizzato con MOG35-55. (A) Il diagramma della progressione dei sintomi dei topi EAE. (B) La valutazione dei topi EAE attraverso punteggi clinici medi. I dati sono espressi come media ± SEM, n = 6. I dati sono stati analizzati utilizzando l'ANOVA unidirezionale con confronti post-hoc per valutare differenze statisticamente significative. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Mappa microscopica della colorazione H&E cerebrale. (A) Cervello di topi nel gruppo di controllo. (B) Cervello di topi EAE in fase di picco. Le cellule infiammatorie sono state infiltrate nel cervello nella fase di picco nei topi del gruppo EAE e distribuite intorno ai vasi sanguigni per formare un cambiamento simile a un bracciale (freccia rossa). (C) Cervello di topi EAE in stadio RR. Cellule infiammatorie in topi del gruppo EAE allo stadio RR aggregate attorno ai vasi sanguigni (freccia rossa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Mappa microscopica della colorazione LFB della guaina mielinica. (A) Guaina mielinica dei topi nel gruppo di controllo. (B) Guaina mielinica di topi EAE in fase di picco. La sostanza bianca spinale era azzurra o bianca, la struttura era sciolta e discontinua e appariva un gran numero di degenerazioni vacuolari (freccia rossa). (C) Guaina mielinica di topi EAE in stadio RR. La mielina della sostanza bianca del midollo spinale era ampiamente persa, la struttura era allentata e appariva un gran numero di degenerazioni vacuolari (freccia rossa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: L'immunizzazione con MOG35-55 ha indotto l'up-regolazione della proporzione delle cellule CD4 Teff e Tem sia nello stadio di picco che in quello RR nei topi EAE. (A) Diagramma di flusso illustrativo che mostra l'immunocolorazione delle cellule CD4⁺CD69⁺ . (B) Percentuale di cellule Teff CD4⁺CD69⁺ . (C) Diagramma di flusso illustrativo che mostra l'immunocolorazione delle cellule CD44⁺CD62L⁺ (gate sulle cellule T CD4). (D) Percentuale di cellule Tm CD44⁺CD62L⁺ . I dati sono espressi come media ± SEM, n = 5. I dati sono stati analizzati utilizzando l'ANOVA unidirezionale con confronti post-hoc per valutare differenze statisticamente significative. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Livello di citochine nel cervello di topo analizzato mediante array citometrico di bigere. I dati sono espressi come media ± SEM, n = 3. I dati sono stati analizzati utilizzando l'ANOVA unidirezionale con confronti post-hoc per valutare differenze statisticamente significative. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Etichetta del tubo	Concentrazione (pg/mL)	Citochine Diluizione standard
1	0 (controllo negativo)	nessuna diluizione standard (solo diluente per saggi)
2	20	1:256
3	40	1:128
4	80	1:64
5	156	1:32
6	312.6	1:16
7	625	1:8
8	1250	1:4
9	2500	1:2
10	5000	Di alto livello

Tabella 1: Elenco delle diluizioni standard delle citochine nelle provette di controllo.

Discussione

La SM è la malattia demielinizzante autoimmune più diffusa del SNC, che colpisce milioni di persone in tutto il mondo¹⁷. L'EAE è il tipico modello animale per simulare le caratteristiche cliniche patologiche della SM¹⁸. Gli studi hanno dimostrato che gli individui con SM sperimentano un deterioramento cognitivo e altre disabilità dovute alla degenerazione degli assoni e dei neuroni nel SNC 19,20,21. Al picco e allo stadio RR del modello EAE, i topi mostravano paralisi alla coda e agli arti posteriori. Inoltre, è stato osservato che le cellule infiammatorie si infiltrano nel SNC, portando a vari gradi di perdita della guaina mielinica. Questi risultati hanno indicato il successo dell'istituzione del modello EAE in questo esperimento.

Il processo di emulsione di MOG35-55 e CFA deve essere condotto su ghiaccio per prevenire la degradazione di MOG35-55 causata dalla generazione di calore durante il processo di omogeneizzazione. PTX viene somministrato per via intraperitoneale per migliorare la permeabilità vascolare, consentendo alle cellule T di attraversare facilmente la barriera emato-encefalica e raggiungere la guaina mielinica che circonda i neuroni²². Ciò che richiede particolare attenzione è che nei casi in cui i topi si paralizzano e non possono sopportare di mangiare o bere da soli, è importante fornire vassoi di cibo e acqua nella loro gabbia o nutrirli manualmente per prevenire sete e fame eccessive.

La citometria a flusso è stata utilizzata per analizzare la proporzione di cellule Teff CD4⁺CD69⁺ e cellule CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem. La proporzione di cellule Teff CD4⁺CD69⁺ nella milza dei topi EAE era notevolmente aumentata nella fase di picco. Inoltre, era superiore a quello del gruppo di controllo nella fase di recidiva, sebbene questa differenza non raggiungesse la significatività statistica. D'altra parte, la proporzione di cellule Tem CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem era significativamente più alta nei topi EAE rispetto al gruppo di controllo sia allo stadio di picco che a RR. Ciò ha suggerito che l'inizio dell'EAE potrebbe coinvolgere sia le cellule CD4⁺CD69⁺ Teff che le cellule CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem nello stadio di picco, mentre lo stadio RR è forse principalmente dominato dalle cellule CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem. CD69 è la prima molecola di superficie della membrana espressa durante l'attivazione dei linfociti. Svolge un ruolo cruciale nella modulazione dell'adesione e della migrazione delle cellule T, aiutando così le cellule immunitarie a identificare e localizzare i siti di infezione o infiammazione all'interno del corpo²³. Le cellule T a riposo non esprimono CD69, ma quando sono stimolate e attivate da attivatori anti-CD3/TCR possono essere espresse induttivamente²⁴. Dopo la fase effettrice, una parte significativa delle cellule T va incontro ad apoptosi poiché non sono in grado di differenziarsi ulteriormente. Questa riduzione del numero è causata principalmente dall'assenza di citochine pro-sopravvivenza, tra cui l'IL-2, che vengono prodotte durante la stimolazione dell'antigene. Inoltre, la sottoregolazione dei recettori per queste citochine contribuisce ulteriormente a questo fenomeno di contrazione clonale²⁵. Inoltre, l'eliminazione dell'agente infettivo attraverso una risposta immunitaria adattativa porta alla contrazione clonale delle cellule T, lasciando in ultima analisi un minor numero di cellule di memoria a lunga vita per fornire una risposta immunitaria all'ospite in caso di reinfezione con l'agente patogeno²⁶. Nel presente studio, la proporzione di cellule T CD4⁺CD69⁺ era notevolmente elevata nella fase di picco, ma diminuiva nella fase RR, il che indicava che le cellule Teff CD4 non sono in grado di sopravvivere per un periodo prolungato e alla fine vanno incontro ad apoptosi, solo una piccola frazione di cellule T antigene-specifiche si sviluppa in cellule T di memoria a lunga vita. Le cellule Tem hanno una bassa espressione di CD62L. Tuttavia, sono in grado di esprimere alcuni recettori delle chemochine e molecole di adesione che facilitano la loro migrazione verso i tessuti infiammati. Dopo la riattivazione dell'antigene, il tasso di proliferazione è relativamente lento, ma le citochine vengono rapidamente rilasciate per avviare la funzione effettrice²⁷. Nel presente studio, gli antigeni nei topi rilasciati dall'emulsione e attaccati nuovamente il sistema immunitario, le cellule Tem possono essere riattivate e rilasciare un gran numero di citochine, come IL-6 e IFN-γ, che possono provocare la recidiva dei topi EAE.

Le principali popolazioni di cellule T CD4 pro-infiammatorie associate a malattie autoimmuni (inclusa la SM) sono cellule Th1 che secernono IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α e cellule Th17 che secernono IL-17. È stato dimostrato che l'IFN-γ associato alle cellule Th1 può avere un effetto dannoso diretto sugli oligodendrociti, con conseguente danno ai neuroni del SNC del paziente²⁸. Le cellule Th17 svolgono anche un ruolo significativo in diverse malattie autoimmuni, tra cui la SM. La ricerca ha osservato livelli elevati di cellule Th17 e di mRNA IL-17 nelle lesioni cerebrali dei pazienti con SM rispetto agli individui senza la malattia²⁹. Le cellule Treg, che sono caratterizzate dalla produzione di IL-10 e TGF-β³⁰, hanno un effetto immunosoppressivo e svolgono un ruolo cruciale nel mantenere la tolleranza del sistema immunitario agli autocomponenti, consentendo così all'organismo di mantenere l'omeostasi immunitaria. Qui abbiamo osservato una significativa sovraregolazione dell'espressione di IL-4, IL-6, IFN-γ e TNF-α nel gruppo EAE allo stadio di picco. Inoltre, anche l'espressione di IL-17A è stata aumentata, sebbene non vi fosse alcun significato. Al contrario, i livelli di espressione di TNF-α e IL-17A nello stadio RR erano significativamente più alti rispetto al gruppo di controllo. Ciò suggerisce che lo stadio di picco dell'EAE è guidato principalmente dalle cellule Th1 piuttosto che dalle cellule Th17, mentre lo stadio RR dell'EAE è stato avviato da entrambe le cellule Th1 e Th17. Vale la pena notare che l'espressione di IL-10 nel gruppo EAE sia nel periodo di picco che nel periodo RR era marcatamente inferiore a quella del gruppo di controllo, suggerendo che la funzione immunosoppressiva delle cellule Treg era ostacolata durante la processione patologica di EAE.

In conclusione, i nostri studi suggeriscono il successo della creazione di un modello EAE recidivante-remittente nei topi attraverso l'immunizzazione con il peptide MOG35-55. Dal punto di vista della fase attiva, lo stadio di picco dell'EAE è stato probabilmente iniziato dalle cellule CD4⁺CD69⁺ Teff e CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem, mentre la recidiva dello stadio EAE RR potrebbe essere principalmente dominata dalle cellule CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem. Dal punto di vista della funzione dell'effetto immunitario, lo stadio di picco dell'EAE è stato principalmente avviato non dalle cellule Th17 ma dalle cellule Th1. Tuttavia, lo stadio RR dell'EAE è stato avviato dalle cellule Th1 e Th17. La funzione immunosoppressiva delle cellule Treg è stata inibita durante il processo patologico EAE. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base dell'attivazione delle cellule Th1/Th17 e della soppressione delle cellule Treg richiedono ulteriori indagini.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Evaporatore per macchina per anestesia	Norvap	20-17368
Isoflurane	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.
70 μ filtro per cellule m	XIYAN Co.,Ltd.	15-1070
Alexa Fluor 700 anti-topo CD45 Anticorpo	Biolegend	103128
APC anti-topo CD4 Anticorpo	Biolegend	100616
Contatore automatico di cellule	Jiangsu JIMBIO technology Co., LTD	JIMBIO iCyta S2
BD* Kit CBA citometrico per topi Th1/Th2/Th17 BD	Biosciences	560485
Biotina anti-topo CD16/32 Anticorpo	Biolegend	101303
Brilliant Violet 510 anti-topo CD69 Anticorpo	Biolegend	104532
BV786 Rat Anti-Mouse CD62L(MEL-14)	BD Pharmingen	563109
Colonna Tissue& Kit di estrazione di proteine cellulari	Shanghai Epizyme Biomedical Technology Co., Ltd	PC201Plus
Completo di Freund adiuvante	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.
Essiccatore	DIAPATH	Donatello
Siringa sterilizzata monouso (1 mL)	Yikang Group	210820
Siringa sterilizzata monouso (2,5 mL)	Yikang Group	210820
Siringa sterilizzata monouso (5 mL)	Yikang Group	210820
Macchina per tintura	DIAPATH	Giotto
Macchina per l'inclusione	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5
Etanolo	SCRC	100092683
Fetale Siero Bovino	Procell Life Science& Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.	FSP500
FITC Criceto Anti-Topo CD3e(145-2C11)	BD Pharmingen	553062
Citometro a flusso	Becton,Dickinson and Company	FACSCelesta
Citometro a flusso	Becton,Dickinson and Company	Accuri C6
Flow Jo software	BD Biosciences	10.8.1
Piattaforma congelata	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5
Vetrino	Servicebio	G6004
HE Set di soluzioni coloranti	Servicebio	G1003
Soluzione ematossilina-eosina	Servicebio	G1002
Centrifuga refrigerata ad alta velocità	Thermo Fisher Scientific	Mogafugo8R
Sistema di imaging	Nikon	NIKON DS-U3
Kit di colorazione blu veloce Luxol	Servicebio	G1030
Ms CD44 BV421 IM7	BD Pharmingen	564970
Mycobacterium tuberculosis H37RA	BD Pharmingen	231141
Glicoproteina oligodendrocitaria mielina (MOG35-55)	AnaSpec	AS-60130-1
Gomma neutra	SCRC	10004160
Organizer	KEDEE	KD-P
Forno	Labotery	GFL-230
Affettatrice patologica	Leica	RM2016
Tossina pertosse da Bordetella pertussis	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.	P7208
Soluzione salina tamponata con fosfato	Servicebio	G4202
Pipetta 0,5-10 μ L	DLAB Scientific	7010101004
Pipetta 100-1000 μ L	DLAB Scientific 7010101014
Pipetta 20-200 μ L	DLAB Scientific	7010101009
RPMI-1640	Procell Life Science& Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.
Valvola a T	Guangdong Kanghua Medical Co., LTD	A06
Spalmatore di tessuti	Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd	KD-P
Microscopio ottico verticale	Nikon	NIKON ECLIPSE E100
Xilene	SCRC	10023418