Articolo metodologico

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

2.2K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/66579

⸱

6 settembre 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Nanoscale Biophysics and Biochemistry, The Rockefeller University, 2Tri-Institutional PhD Program in Chemical Biology

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta una procedura sperimentale dettagliata per la ricostituzione di cavi di DNA contenenti nucleosomi per la forza correlativa a singola molecola e la microscopia a fluorescenza. Descrive inoltre diversi esperimenti a valle che possono essere condotti per visualizzare il comportamento di legame delle proteine che interagiscono con la cromatina e analizzare i cambiamenti nelle proprietà fisiche dei nucleosomi.

Abstract

I nucleosomi costituiscono l'unità primaria della cromatina eucariotica e sono stati al centro di numerose indagini informative su singole molecole riguardanti le loro proprietà biofisiche e le interazioni con le proteine leganti la cromatina. La ricostituzione dei nucleosomi sul DNA per questi studi comporta tipicamente una procedura di dialisi a sale che fornisce un controllo preciso sul posizionamento e sul numero di nucleosomi formati lungo un cavo di DNA. Tuttavia, questo protocollo richiede molto tempo e richiede una notevole quantità di DNA e ottameri istonici come input. Per offrire una strategia alternativa, viene descritto un metodo di ricostituzione nucleosomiale in situ per la forza di una singola molecola e la microscopia a fluorescenza che utilizza l'istone chaperone Nap1. Questo metodo consente agli utenti di assemblare nucleosomi su qualsiasi modello di DNA senza la necessità di forti sequenze di posizionamento dei nucleosomi, regolare la densità dei nucleosomi su richiesta e utilizzare meno reagenti. La formazione dei nucleosomi in situ avviene in pochi secondi, offrendo un flusso di lavoro sperimentale più semplice e una comoda transizione verso le misure di singole molecole. Vengono ulteriormente descritti esempi di due saggi a valle per sondare la meccanica dei nucleosomi e visualizzare il comportamento di singole proteine sulla cromatina.

Introduzione

L'unità di confezionamento primaria della cromatina eucariotica è il nucleosoma, in cui ~147 coppie di basi (bps) di DNA sono avvolte attorno a un ottamerodi proteine istoniche 1,2. Oltre all'impacchettamento del genoma, l'architettura del nucleosoma funge da un altro ricco strato di regolazione biofisica che può essere sfruttato dalle proteine leganti la cromatina durante l'esecuzione delle loro varie funzioni 3,4. L'accesso sperimentale e la misurazione delle caratteristiche fisiche dei nucleosomi è stato tecnicamente impegnativo poiché queste unità si comportano su scale minuscole (ad esempio, lunghezze nanometriche, forze di piconewton) e, quindi, il loro sondaggio richiede una sensibilità e una precisione sufficienti per informare in modo significativo la funzione. Inoltre, le proteine leganti la cromatina spesso interagiscono con i loro substrati in modo transitorio e la maggior parte degli approcci d'insieme manca di un'adeguata risoluzione temporale per informare la cinetica di queste interazioni5. Fortunatamente, l'avvento delle tecniche a singola molecola ha reso possibile visualizzare e manipolare singole proteine e le loro interazioni in tempo reale, rivelando informazioni meccanicistiche su questi eventi molecolari che si verificano su scala nanometrica6. In particolare, la microscopia a fluorescenza e forza correlativa a singola molecola (smCFFM) sfrutta sia il rilevamento della fluorescenza ad alta risoluzione che gli strumenti di manipolazione della forza per risolvere simultaneamente la meccanica, la composizione e la coordinazione della cromatina e dei complessi cromatina-proteina 7,8.

Nell'smCFFM che impiega specificamente "pinzette ottiche" come metodo di manipolazione della forza, un laser strettamente focalizzato viene utilizzato per intrappolare un oggetto dielettrico, tipicamente una perlina di plastica di dimensioni micron, in tre dimensioni9. Un biopolimero come un pezzo di DNA può essere coniugato alla perlina (tramite, ad esempio, streptavidina-biotina, digossigenina-anti-digossigenina) e l'utente può applicare una forza calibrata e misurare la forza/spostamento generata dal sistema10. Il modulo di fluorescenza aggiunto consente l'imaging a fluorescenza multicolore simultaneo per monitorare la composizione e il comportamento delle proteine.

Il metodo tradizionale per la ricostituzione dei modelli di nucleosomi per smCFFM prevede l'assemblaggio di nucleosomi su modelli di DNA personalizzati mediante dialisi a sale 11,12,13. In questa procedura, gli ottameri istonici purificati vengono incubati con modelli di DNA in un tampone ad alto contenuto di sale (~1 M di cloruro di sodio) e, mentre il sale viene lentamente dializzato, i nucleosomi si assemblano spontaneamente sul DNA in modo posizionale sequenziale-dipendente14,15. Pertanto, è consuetudine che sequenze di posizionamento dei nucleosomi forti (ad esempio, Widom 60116, X. laevis 5S rDNA17) siano incorporate all'interno dei modelli di DNA per generare array di nucleosomi personalizzati. Sebbene questo metodo consolidato offra un controllo preciso sul posizionamento e sul numero di nucleosomi nel DNA, soffre di diversi svantaggi: (1) l'incorporazione di sequenze di DNA di posizionamento dei nucleosomi forti può generare nucleosomi artificialmente stabili che influenzano l'attività delle proteine leganti la cromatina, (2) il processo di dialisi salina per la formazione dei nucleosomi richiede elevate quantità di DNA e ottsomeri, e (3) la procedura richiede da uno a diversi giorni di lavoro, nonché uno sforzo considerevole per titolare il corretto rapporto DNA/ottamero per una densità ottimale dell'array di nucleosomi.

In questo manoscritto, descriviamo un metodo alternativo per formare nucleosomi lungo il DNA in situ all'interno di una forza correlativa a singola molecola e microscopio a fluorescenza utilizzando l'istone ricombinante chaperone Nap1, che assomiglia al percorso fisiologico della formazione dei nucleosomi in vivo 18,19,20,21,22. Questo metodo consente agli utenti di assemblare nucleosomi su sequenze di DNA non specifiche, regolare facilmente la densità dei nucleosomi e utilizzare quantità significativamente inferiori di reagenti, il tutto in pochi minuti. Inoltre, la formazione di cavi di DNA nucleosomico in situ consente un flusso di lavoro sperimentale più semplice e la comodità della visualizzazione e della manipolazione di singole molecole integrate. Pertanto, quando il posizionamento uniforme e specifico dei nucleosomi non è una necessità, questo protocollo offre un'opzione utile per lo studio della meccanica dei nucleosomi o del comportamento delle proteine sulla cromatina, per i quali descriviamo anche saggi di esempio.

Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione del DNA biotinilato

  1. Preparare una reazione in volume da 120 μL contenente 20 μg di λ DNA, 33 μM di biotina-dCTP, 33 μM di biotina-dUTP, 33 μM di biotina-dATP, 33 μM di dGTP, 10 unità di enzima Klenow e 1x NEB Buffer 2.
    NOTA: Questa procedura utilizza specificamente il DNA genomico λ del batteriofago lineare a doppio filamento (ds) privo di metilazione (48.502 bps), che contiene 12 nucleotidi (nt) 5' sporgenza di DNA a singolo filamento (ss)23. Tuttavia, il protocollo può essere adattato per utilizzare qualsiasi lunghezza o sequenza di dsDNA lineare, a condizione che contenga almeno diversi nt di sporgenze di ss 5', la lunghezza e la sequenza nt determinano il numero di nt biotinilati installati su ciascuna estremità per il tethering a valle tra trappole ottiche. Inoltre, la reazione può essere ridimensionata. Ad esempio, 5 μg di DNA possono essere utilizzati in una reazione di volume di 30 μl. Inoltre, i substrati di DNA generati in questo modo non sono vincolati torsionalmente. Per i protocolli per la creazione di DNA vincolato alla torsione, fare riferimento ai rapporti precedentemente pubblicati24,25.
  2. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 15 minuti.
  3. Aggiungere 10 mM di EDTA e incubare a 75 °C per 20 minuti.
  4. Eseguire la precipitazione dell'etanolo per ottenere il prodotto del DNA biotinilato.
    1. Aggiungi 0,1 volte il volume di acetato di sodio 3 M e 3 volte il volume di etanolo al 100% ghiacciato. Conservare a -20 °C per almeno 1 ora fino a tutta la notte. Centrifugare a 13.500 x g per 30 min a 4 °C.
    2. Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet e aggiungere 1 mL di etanolo al 75%. Centrifugare a 13.500 x g per 1 min a 4 °C.
    3. Ripetere le fasi di rimozione del surnatante, aggiunta di etanolo e centrifugazione.
    4. Rimuovere con cura tutto il surnatante e lasciare asciugare il pellet all'aria per 10 minuti. Sciogliere il pellet in 100-200 μL di tampone TE o ddH2O (può incubare a 37 °C per facilitare la dissoluzione). Misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro Nanodrop.

2. Preparazione dei canali in una cella a flusso

NOTA: Questa procedura si basa su un chip microfluidico disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) ma può essere adattata a qualsiasi strumento smCFFM con una cella di flusso multicanale.

  1. Passivare i canali (cap.) 4 e 5 (o qualsiasi canale che contenga proteine) (vedere lo schema dei canali in Figura 1A). Aggiungere 500 μl di BSA allo 0,1% in ciascun canale e fluire a 0,8 bar (~0,45 μl/s per tubi con un diametro interno di 0,010 pollici) per 8 minuti. Rimuovere la soluzione.
  2. Aggiungere 500 μl di Pluronic-F127 allo 0,05% a ciascun canale e far fluire a 0,8 bar per 8 minuti. Rimuovere la soluzione e sciacquare le siringhe con 1x PBS. Aggiungere 2 mL di 1x PBS a ciascun canale e fluire a 0,8 bar per 27 min.
  3. Agitare la soluzione madre di perle rivestite di streptavidina (questa procedura utilizza perle di dimensioni di 3,13 μm) e aggiungere 2,15 μL della soluzione di perline a 1 mL di 1x PBS. Aggiungere al cap. 1.
    NOTA: La dimensione e la concentrazione delle perle rivestite di streptavidina possono essere regolate in base alle preferenze dell'utente.
  4. Aggiungere 30-80 ng di λ DNA biotinilato a 1 mL di 1x PBS. Aggiungere al capitolo 2.
    NOTA: La concentrazione di DNA biotinilato può essere regolata in base alle preferenze dell'utente. Quantità maggiori di DNA aumenteranno la frequenza di formazione di cavi di DNA, ma aumenteranno anche la frequenza di legare più molecole di DNA contemporaneamente, il che può aumentare la difficoltà dell'esperimento.

3. Formazione di nucleosomi in situ mediata da Nap1

  1. Aggiungere 500 μL di tampone immagine privo di proteine al capitolo 3.
    NOTA: La composizione del tampone nel capitolo 3 è flessibile e dovrebbe essere appropriata sia per i nucleosomi che per la proteina specifica di interesse. Opzionalmente, gli utenti possono scegliere di aggiungere sistemi di evacuazione dell'ossigeno per ridurre il fotosbiancamento dei fluorofori e/o del DNA concorrente per rimuovere gli ottameri istonici che non sono correttamente avvolti nei nucleosomi.
  2. Aggiungere 2 nM di S. cerevisiae Nap1 e 2-5 nM di ottamero (HO) istonico H4 marcato con LD655 a 500 μL di 1x tampone HR18. Aggiungere al capitolo 4.
    NOTA: Gli ottameri istonici e Nap1 possono essere acquistati commercialmente o preparati internamente (vedi Tabella dei materiali). Il numero di nucleosomi da formare lungo ciascun DNA legato dipende dalla concentrazione di ottamero e dal tempo trascorso in questo canale. La densità nucleosomica desiderata e approssimativa dell'utente lungo ciascuna molecola di DNA può essere modulata regolando uno o entrambi questi parametri. Inoltre, l'utente può scegliere di etichettare gli ottameri istonici con il fluoroforo preferito.
  3. Opzionale: aggiungere la proteina legante la cromatina o un'altra proteina di interesse al capitolo 5 in un tampone appropriato.
  4. Fluire tutti i canali a 1,0 bar (~0,55 μL/s nell'attuale configurazione sperimentale) per 30 s per lavare i canali della cella di flusso con i campioni.
  5. Impostare il flusso su 0,2 bar (~0,16 μL/s nell'attuale configurazione sperimentale). Spostare le trappole ottiche (OT) al capitolo 1 e catturare un paio di perle rivestite di streptavidina adatte.
  6. Spostare gli OT al canale 3, eseguire una calibrazione della forza per la coppia di perline, accendere il laser confocale rosso (o un'altra linea laser a scelta) e calibrare l'area di imaging.
  7. Imposta il flusso a 0,2 bar e sposta gli OT al canale 2. Cattura il DNA biotinilato.
  8. Sposta gli OT al capitolo 3 e ferma il flusso. Aumenta la distanza tra gli OT per allungare il DNA e monitora la curva forza-distanza (FD) associata per confermare la presenza di un singolo cavo del DNA (al contrario di più fili). La curva dovrebbe seguire il modello a catena a forma di verme per il dsDNA alla lunghezza del contorno data26.
  9. Regolare la distanza tra gli OT in modo che la tensione del DNA sia di circa 1 pN.
    NOTA: 1 pN di tensione è abbastanza basso da consentire ai nucleosomi di rimanere avvolti dal DNA27 , ma è abbastanza alto da posizionare l'intera molecola di DNA all'interno dell'asse di imaging a scansione lineare.
  10. Attiva la scansione in linea per iniziare a raccogliere un chimografo con il laser rosso acceso.
    NOTA: È possibile ottenere chimografi o scansioni 2D del DNA legato, in base alle preferenze dell'utente.
  11. Spostare gli OT al canale 4 con il flusso disattivato. Facilitati da Nap1, gli HO vengono caricati sul DNA e avvolti per formare nucleosomi in tempo reale. Il carico dei nucleosomi è visualizzato come traiettorie fluorescenti che appaiono sul DNA all'interno di chimografi. Allo stesso tempo, la formazione di nucleosomi sul DNA può essere monitorata dall'aumento della forza man mano che vengono caricati più HO quando le posizioni degli OT vengono mantenute costanti.
    NOTA: Il laser di eccitazione a fluorescenza può essere disattivato durante le fasi di formazione del nucleosoma per evitare il fotosbiancamento dei fluorofori. Inoltre, il legame non specifico degli ottameri istonici al DNA in cui gli ottameri non sono avvolti nei nucleosomi potrebbe verificarsi utilizzando questo protocollo. Questi eventi di legame non generano uno "strappo" quando il DNA viene allungato, come descritto nel protocollo Unwrapping Nucleosomes (fase 4) di seguito, e talvolta possono essere lavati via da un flusso di tampone delicato, in particolare se il tampone contiene DNA concorrente libero.
  12. Quando si forma il numero approssimativo desiderato di nucleosomi, iniziare a raccogliere i dati.

4. Scartare i nucleosomi

  1. Completa i passaggi 2 e 3.
  2. Dopo aver formato un cavo di DNA contenente nucleosomi, spostare gli OT al capitolo 3.
  3. Preparati per gli esperimenti di srotolamento dei nucleosomi riducendo la distanza tra gli OT fino a quando la forza non è approssimativamente zero. Azzerare la forza.
  4. Iniziare ad allontanare l'OT 1 dall'OT 2 ad una velocità costante di 0,1 μm/s. Su un chimografo, la perlina in OT 1 si sposterà visivamente più lontano dalla perlina in OT 2. Sulla curva FD, la forza aumenterà all'aumentare della distanza. Man mano che i nucleosomi si srotolano, appariranno "strappi" o transizioni nella forza (~8-37 pN) che significano il disfacimento dell'involucro interno dei singoli nucleosomi 27,28,29.
    NOTA: La forza con cui avviene lo srotolamento dipende dalla velocità di trazione, che è prevista per i processi di non equilibrio. A volte, più nucleosomi si srotolano contemporaneamente, producendo una variazione di distanza maggiore nella transizione sulla curva FD. Inoltre, il disfacimento dell'involucro esterno del nucleosoma non è facilmente visibile in questo contesto sperimentale (vedi la sezione Discussione).

5. Visualizzazione del legame delle proteine alla cromatina

  1. Completa i passaggi 2 e 3.
  2. Aggiungere 10 nM di istone H1.4 marcato con Cy3 a 500 μL di tampone di immagine nel cap. 5.
    NOTA: Qualsiasi proteina di interesse può essere aggiunta al capitolo 5 a una concentrazione a scelta (tipicamente inferiore a 100 nM per la visualizzazione di una singola molecola).
  3. Dopo aver formato un cavo di DNA contenente nucleosomi, accendi il laser verde oltre al laser rosso e sposta gli OT al canale 5 per l'imaging in tempo reale del legame H1 alla cromatina.
  4. Continuare a raccogliere chimografi o scansioni fino a quando non sono state raggiunte statistiche sufficienti (almeno ~10-20 chimografi a seconda della frequenza degli eventi e della difficoltà sperimentale).

Risultati

Utilizzando la configurazione descritta nel passaggio 3 (Figura 1A), la formazione di nucleosomi lungo il cavo del DNA è stata visualizzata come l'aspetto di focolai fluorescenti rossi su una scansione 2D (Figure 1B, a sinistra) o traiettorie nel tempo su un chimografo (Figura 1B, a destra). I nucleosomi correttamente avvolti hanno prodotto traiettorie di fluorescenza che sono rimaste stazionarie nel tempo entro il limite di diffrazione del rilevamento confocale (~300 nm). In particolare, più nucleosomi formati l'uno vicino all'altro al di sotto del limite di diffrazione non possono essere risolti spazialmente e appaiono come focolai o traiettorie più luminose. Tuttavia, sono state analizzate le fasi di fotobleaching delle singole traiettorie nucleosomiche e spesso hanno mostrato eventi di fotobleaching a 1 fase (Figura 1C) o a 2 fasi (Figura 1D), il che indica che i focolai contenevano principalmente mononucleosomi dato il tasso di marcatura di circa il 70% della proteina H4 in questo campione. Inoltre, sulla base del numero medio di fotoni per un singolo fluoroforo LD655 in questa condizione sperimentale, è stato stimato il numero di copie H4 marcate in ciascuna traiettoria del nucleosoma e ha mostrato che i loci nucleosomici contenevano prevalentemente (>75%) 1 o 2 copie H2A marcate (Figura 1E), ancora una volta in linea con l'idea che fossero caricati principalmente come mononucleosomi spazialmente separati. Gli altri focolai più luminosi contenevano più di 3 copie di H4 marcato, probabilmente rappresentanti più nucleosomi entro il limite di diffrazione.

La formazione dei nucleosomi è stata monitorata anche da un aumento della tensione lungo il cavo quando le posizioni degli OT sono rimaste costanti man mano che più DNA è stato avvolto attorno agli ottameri istonici (Figura 1B, in basso). In assenza di Nap1, gli ottameri istonici possono ancora legare il DNA ma rimanere per lo più sfasciati, poiché la tensione associata quando le posizioni OT sono state mantenute è rimasta costante (Figura 1F). È possibile che il legame non specifico degli ottameri istonici al DNA avvenga anche in presenza di Nap1. In un altro esperimento, è stato eseguito lo stesso protocollo per formare nucleosomi contenenti H2A marcato con Cy3, che ha prodotto risultati simili a quelli eseguiti con H4 marcato con LD655 (Figura 1G), indicando l'assemblaggio di ottameri intatti in nucleosomi.

Utilizzando la configurazione descritta nel passaggio 4 (Figura 2A), lo srotolamento del nucleosoma è stato visualizzato nel tempo su un chimografo all'aumentare della distanza del cavo (Figura 2B). In precedenza è stato riportato che gli ottameri istonici spesso rimangono legati al DNA dopo essere stati scartati30,31 e, pertanto, le traiettorie fluorescenti spesso persistono anche ad alte tensioni. Anche lo srotolamento dei nucleosomi è stato monitorato sulla curva FD associata (Figura 2C). Le caratteristiche quantificabili della curva FD includono la forza con cui i nucleosomi si srotolano (vedi "Transizione F" nel riquadro della Figura 2C) così come la lunghezza del DNA che è stato rilasciato dall'ottamero dell'istone (vedi "ΔL" nel riquadro della Figura 2C), che esiste in multipli di ~24 nm, coerente con lo srotolamento indipendente delle spire interne del DNA dei singoli nucleosomi27, 30. Questi parametri possono essere utilizzati per stimare il numero di nucleosomi formati su ciascun cavo o per ulteriori analisi a valle della meccanica dei nucleosomi. Pertanto, il numero di rotture del giro interno ottenute da esperimenti di trazione meccanica è stato confrontato con il numero stimato di copie di H4 marcate in ciascuna traiettoria del nucleosoma in base all'intensità del monomero, il che ha dimostrato che i numeri sono in gran parte coerenti (esempi mostrati nelle Figure 2D-G). Tuttavia, è stato notato che non corrispondono perfettamente a causa dell'efficienza marcata del ~70% della proteina H4 nel campione e di qualsiasi legame residuo dell'istone indipendente da Nap1 al DNA, come mostrato nella Figura 1F. Infine, come previsto, l'allungamento dei legami di DNA nudo legati a Nap1 (senza istoni) non genera transizioni indotte dalla forza (Figura 2H), indicando che Nap1 da solo non distorce significativamente il DNA.

Utilizzando la configurazione descritta nel passaggio 5 (Figura 3A), il legame dell'istone linker H1 alla cromatina è stato visualizzato come la comparsa di focolai fluorescenti verdi lungo il cavo della cromatina (Figura 3B). In particolare, i nucleosomi legati a H1 hanno generato traiettorie a doppio colore (vedi frecce bianche nella Figura 3B) che sono apparse stazionarie nel tempo. Inoltre, sono state osservate traiettorie H1 diffuse attraverso regioni di DNA prive di nucleosomi (vedi stelle verdi nella Figura 3B).

figure-results-1
Figura 1: Formazione di nucleosomi in situ mediati da Nap1. (A) Schema del setup sperimentale descritto nel protocollo di formazione dei nucleosomi in situ mediato da Nap1 (step 3). Un paio di perle sono state intrappolate otticamente nel capitolo 1 e una singola molecola di DNA λ è stata legata tra le perle attraverso il legame biotina-streptavidina nel capitolo 2. Il cavo è stato quindi spostato al canale 4, contenente ottameri istonici marcati con LD655 (rosso) e Nap1 per la formazione in tempo reale di nucleosomi attraverso il DNA. (B) Scansione 2D rappresentativa (a sinistra) e chimografo (a destra) di un cavo di DNA contenente nucleosoma marcato con LD655-H4. La lettura della forza associata (in basso) mostra un aumento della forza immediatamente quando il cavo viene spostato al canale 4 quando le posizioni OT sono mantenute costanti, indicando l'avvolgimento del nucleosoma. Traiettorie più luminose indicano più nucleosomi adiacenti situati entro il limite di diffrazione di ~300 nm. (C) Esempio di chimografo che mostra un evento di fotobleaching in 1 fase (freccia bianca) di un nucleosoma contenente LD655-H4. (D) Esempio di chimografo che mostra un evento di fotobleaching in 2 fasi (frecce bianche) di un nucleosoma contenente LD655-H4. (E) Frequenza relativa del numero di H4 marcati con LD655 per traiettoria stimata dalla loro intensità di fluorescenza. (F) Chimografo rappresentativo di un cavo legato con ottameri istonici in assenza di Nap1. La lettura della forza associata (in basso) rimane invariata anche se gli ottameri istonici legano il DNA. (G) Chimografo rappresentativo di un cavo di DNA contenente nucleosoma marcato con Cy3-H2A. La lettura della forza associata (in basso) mostra un aumento della forza immediatamente quando il cavo viene spostato al canale 4 (contenente ottameri e Nap1), poiché i nucleosomi si formano quando le posizioni OT vengono mantenute costanti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Saggio di srotolamento dei nucleosomi. (A) Schema della configurazione sperimentale descritta nel protocollo di srotolamento dei nucleosomi (fase 4). Il cavo di DNA contenente i nucleosomi è stato spostato al canale 3 contenente un tampone di immagine privo di proteine in cui la distanza tra le perline è stata aumentata e i nucleosomi sono stati scartati. (B) Chimografo rappresentativo di un cavo di DNA contenente nucleosoma tirato ad alte forze aumentando gradualmente la distanza tra le perline. La diminuzione dell'intensità della fluorescenza verso la perlina inferiore era probabilmente dovuta al fatto che il DNA si inclinava leggermente fuori linea dal fuoco di scansione. (C) La curva FD associata che mostra le transizioni indotte dalla forza dello srotolamento della curva interna che si verificano tra 8-37 pN. Il riquadro mostra una vista ingrandita di un esempio di transizione per la quale è possibile registrare e analizzare ulteriormente la distanza srotolata (ΔL = ~24 nm per il giro interno del DNA dei singoli nucleosomi) e la forza di transizione (transizione F). Per questo cavo, sono stati srotolati 26 nucleosomi e il cavo si è rotto a ~65 pN, come indicato dalla linea tratteggiata bianca nel chimografo. (D,E) Esempio: cavo contenente nucleosoma LD655-H4 tirato a forze elevate, in cui il numero di H4 per traiettoria è stimato tramite l'intensità della fluorescenza (indicata nel chimografo, D) e il numero di nucleosomi avvolti è stimato tramite la dimensione della variazione della distanza indotta dalla forza (indicata nella curva forza-distanza associata, E). (F,G) Un altro esempio come in (D,E). (H) Cavi di DNA (n = 5) tirati ad alte forze dopo essere stati incubati in un canale contenente solo Nap1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Visualizzazione dell'interazione proteina-cromatina. (A) Schema del setup sperimentale descritto nel protocollo di visualizzazione del legame proteico alla cromatina (fase 5). Il cavo di DNA contenente i nucleosomi è stato spostato al canale 5, contenente 10 nM di istone H1 linker marcato con Cy3 (verde). (B) Chimografo rappresentativo a due colori del legame di H1 a un cavo di DNA contenente nucleosomi. Gli eventi di colocalizzazione del nucleosoma H1 sono indicati con frecce bianche. La traiettoria del nucleosoma non legato è indicata con la freccia magenta. Le molecole H1 che si diffondono sul DNA nudo sono indicate con stelle verdi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il protocollo descritto offre diversi vantaggi per la ricostituzione dei nucleosomi, tra cui la riduzione al minimo dei reagenti e del tempo, nonché l'abilitazione della formazione di nucleosomi chaperone-dipendenti lungo qualsiasi sequenza di DNA (potenzialmente nativa). Inoltre, il metodo in situ consente un flusso di lavoro sperimentale più semplice e una comoda transizione verso saggi a singola molecola della meccanica dei nucleosomi e dell'interazione proteina-cromatina. D'altra parte, i limiti di questo approccio includono l'incapacità di dirigere il posizionamento dei nucleosomi lungo il DNA (anche con l'incorporazione di forti sequenze di posizionamento dei nucleosomi) e di controllare con precisione il numero di nucleosomi formati per cavo di DNA (anche se questo può essere regolato empiricamente standardizzando il flusso di lavoro sperimentale). In effetti, coloro che scelgono questo metodo scambiano con un controllo preciso del posizionamento e della densità dei nucleosomi per una maggiore facilità di flusso di lavoro e un basso fabbisogno di reagenti, la cui scelta dipende da ogni specifico esperimento. Si noti inoltre che la rotazione esterna del DNA non è risolta nel protocollo attuale a causa della lunga lunghezza del cavo (~48,5 kbps) e delle condizioni tampone32. Per ottenere informazioni sulla rotazione esterna del DNA e sull'impilamento internucleosomico, l'utente può scegliere di accorciare la lunghezza del DNA e caricare una maggiore densità di nucleosomi sul DNA e/o utilizzare il metodo della dialisi a sale per posizionare i nucleosomi su sequenze di posizionamento forti separate da lunghezze regolari di linker. Infine, è probabile che si verifichi un legame non specifico degli ottameri istonici al DNA; Pertanto, è importante considerare sia la fluorescenza che i segnali di forza nell'interpretazione dei risultati.

Un aspetto critico dell'attuale protocollo è garantire che l'utente abbia raggiunto un'elevata frequenza di marcatura fluorescente per gli ottameri istonici (se è richiesta la visualizzazione) in modo che la maggior parte, se non tutti, i nucleosomi possano essere rilevati visivamente. Un altro aspetto critico è la conferma che l'utente abbia scelto un tampone appropriato per il canale di imaging che sia compatibile con i nucleosomi e qualsiasi altra proteina di interesse. Le modifiche specifiche dell'utente al protocollo possono includere la coniugazione del fluoroforo con un istone diverso (vedi rapporti33,34 per esempi che utilizzano questo metodo per formare nucleosomi con H3 o H2B marcati), la scelta di un fluoroforo alternativo, l'incorporazione di cavi di DNA di diverse sequenze e lunghezze, l'aggiunta di un sistema di evacuazione dell'ossigeno per prolungare la durata dei fluorofori, la scelta di una diversa dimensione della perla, e utilizzando un sistema alternativo di coniugazione DNA-perlina (ad esempio, collegamento anticorpale digossigenina-anti-digossigenina).

In sintesi, il metodo descritto fornisce a smCFFM un approccio conveniente e versatile per generare cavi contenenti nucleosomi che possono essere facilmente impiegati per studiare un'ampia gamma di domande incentrate sulla cromatina in biologia. Le aree di ricerca applicabili includono la meccanica della cromatina regolata da varianti istoniche e modifiche post-traduzionali, l'impegno biofisico e la cinetica delle proteine leganti la cromatina e i processi di assemblaggio di ordine superiore diretti dai nucleosomi come la condensazione biomolecolare 35,36,37,38.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

G. N. L. C. riconosce il sostegno del National Institute of Mental Health del National Institutes of Health (NIH) con il numero di premio F31MH132306. S. L. è sostenuta dalla Robertson Foundation, dall'International Rett Syndrome Foundation e dal NIH (premio numero R01GM149862).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1x buffer HRN/AN/A30 mM  tris  acetato pH 7,5, 20 mM di acetato di magnesio, 50 mM di cloruro di potassio, 0,1 mg/mL BSA 
1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)N/AN/A137 mM di cloruro di sodio, 2,7 mM di cloruro di potassio, 10 mM di fosfato di sodio bibasico, 1,8 mM di fosfato di potassio monobasico.
Acido acetico, glacialeMillipore SigmaAX0074-6Utilizzare per fare il tris acetato
Biotina-11-dUTPJena BioscienceNU-803-BIOX-S
Biotina-14-dATPJena BioscienceNU-835-BIO14-S
Biotina-14-dCTPJena BioscienceNU-956-BIO14-S
Albumina sierica bovinaMillipore SigmaA9418-50GDissolvere in H2O e passare attraverso il filtro da 0,22 um
Cy3 Maleimmide Colorante mono-reattivoCytivaPA23031Maleimmide funzionalizzato Cy3 fluoroforo
dGTPNew England BiolabsN0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 RFisher Scientific05-414-051Centrifuga da banco con
raffreddamento Alcool etilico,Millipore puro Sigma459844
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Millipore SigmaE9884Dissolvenza in H2O a 0,5
M Ottamero istonico umano (H4, L50C; H2A, K119C) N/AN/A Leproteine istoniche ricombinanti e quelle che presentavano mutazioni marcanti sono state purificate internamente come descritto in precedenza (vedi rif. 33, 34, 35, 36). In breve, gli istoni ricombinanti sono stati espressi in cellule pLySS BL21 (De3) (Promega). I corpi di inclusione sono stati isolati dopo la sonicazione e gli istoni sono stati estratti in condizioni di denaturazione. Gli istoni sono stati dializzati nel tampone A (7 M urea, 10 mM tris cloridrato pH 8,0, 100 mM di cloruro di sodio, 1 mM EDTA e 5 mM 2-mercaptoetanolo) e la soluzione è stata aggiunta a una colonna gravitazionale caricata con Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). Il flusso è stato quindi aggiunto a una colonna a gravità caricata con SP Sepharose Fast Flow (Cytiva) e gli istoni sono stati eluiti dalla colonna aggiungendo il tampone A integrato con 600 mM di cloruro di sodio. Istoni che ospitano mutazioni marcanti (H4, L50C; H2A, K119C) sono stati purificati e quindi coniugati al fluoroforo desiderato tramite coloranti funzionalizzati con maleimmide (Cytiva, Lumidyne) utilizzando un rapporto molare colorante-proteina di 20:1 (vedi rif. 33, 34). Gli ottameri istonici sono stati assemblati aggiungendo un rapporto molare uguale di ciascun istone wild-type o marcato con fluoroforo in condizioni di denaturazione, dializzati in un tampone ad alto contenuto di sale contenente 2 M di cloruro di sodio e quindi purificati mediante cromatografia ad esclusione dimensionale come descritto in precedenza (vedi rif. 36, 37). In alternativa, singole proteine istoniche e ottameri istonici già pronti possono essere acquistati in commercio (ad esempio, Epicypher).
Tampone immagineN/AN/A20 mM tris cloridrato pH 8,0, 100 mM cloruro di sodio
Frammento di Klenow (da 3' a 5' exo-)New England BiolabsM0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)Thermo Fisher ScientificSD0021Senza metilazione λ DNA
LD655-MALLumidyne Technologies9Maleimmide funzionalizzato LD655 fluoroforo
Linker istone H1.4 (A4C)N/AN/AProteina ricombinante purificata prodotta internamente (vedi rif. 38)
LUMICKS C-Trap DymoLUMICKSN/AConfigurazione a doppia trappola; materiali standard per lo strumento forniti dal produttore
Soluzione di acetato di magnesioMillipore Sigma63052-100MLUtilizzare per realizzare il tampone HR
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SIncluso con il kit di frammenti Klenow
Pluronic F-127Millipore SigmaP2443-250GSciogliere in H2O e passare attraverso un filtro da 0,22 um
Cloruro di potassioMillipore SigmaP3911Utilizzare per produrre tampone PBS e HR
Fosfato di potassio monobasicoMillipore SigmaP0662Utilizzare per rendere PBS
S. cerevisiae Nap1N/AN/ANap1 è stato purificato internamente come descritto in precedenza (vedi rif. 33, 34). In alternativa, Nap1 può essere acquistato in commercio (ad esempio, Active Motif).
Acetato di sodioMillipore Sigma241245Dissolvere in H2O a 3 M
Cloruro di sodioMillipore SigmaS9888Utilizzare per fare PBS e tampone di immagine
Sodio fosfato bibasicoMillipore SigmaS9763Utilizzare per fare PBS
SPHERO Particelle rivestite di biotina (3,0-3,4 &; m)SpherotechTP-30-5
Thermo Scientific Spettrofotometro NanoDrop 2000/2000cFisher ScientificND2000NanoDrop Spettrofotometro
Tris BaseFisher ScientificBP152-500Dissolvere in H2O e regolare al pH appropriato; utilizzare per creare buffer di immagine e tris acetato

Riferimenti

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  3. Zhou, K., Gaullier, G., Luger, K. Nucleosome structure and dynamics are coming of age. Nat Struct Mol Biol. 26, 3-13 (2019).
  4. McGinty, R. K., Tan, S. Principles of nucleosome recognition by chromatin factors and enzymes. Curr Opin Struct Biol. 71, 16-26 (2021).
  5. Fierz, B., Poirier, M. G. Biophysics of chromatin dynamics. Annu Rev Biophys. 48, 321-345 (2019).
  6. Single-molecule techniques: A laboratory manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  7. Chua, G. N. L., Liu, S. When force met fluorescence: Single-molecule manipulation and visualization of protein-DNA interactions. Annu Rev Biophys. , (2024).
  8. Hashemi Shabestari, M., Meijering, A. E. C., Roos, W. H., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. Recent Advances in biological single-molecule applications of optical tweezers and fluorescence microscopy. Methods Enzymol. 582, 85-119 (2017).
  9. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Opt Lett. 11, 288(1986).
  10. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  11. Hansen, J. C., van Holde, K. E., Lohr, D. The mechanism of nucleosome assembly onto oligomers of the sea urchin 5 S DNA positioning sequence. J Biol Chem. 266, 4276-4282 (1991).
  12. Salt Peterson, C. L. gradient dialysis reconstitution of nucleosomes. CSH Protoc. 2008, 5113(2008).
  13. Leicher, R., Liu, S. Probing the interaction between chromatin and chromatin-associated complexes with optical tweezers. Methods Mol Biol. 2478, 313-327 (2022).
  14. Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442, 772-778 (2006).
  15. Ioshikhes, I. P., Albert, I., Zanton, S. J., Pugh, B. F. Nucleosome positions predicted through comparative genomics. Nat Genet. 38, 1210-1215 (2006).
  16. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J Mol Biol. 276, 19-42 (1998).
  17. Chipev, C. C., Wolffe, A. P. Chromosomal organization of Xenopus laevis oocyte and somatic 5S rRNA genes in vivo. Mol Cell Biol. 12, 45-55 (1992).
  18. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181, 1380-1394 (2020).
  19. Vlijm, R., et al. Comparing the assembly and handedness dynamics of (H3.3-H4)2 tetrasomes to canonical tetrasomes. PLoS One. 10, e0141267(2015).
  20. Mazurkiewicz, J., Kepert, J. F., Rippe, K. On the mechanism of nucleosome assembly by histone chaperone NAP1. J Biol Chem. 281, 16462-16472 (2006).
  21. Nakagawa, T., Bulger, M., Muramatsu, M., Ito, T. Multistep chromatin assembly on supercoiled plasmid DNA by nucleosome assembly protein-1 and ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor. J Biol Chem. 276, 27384-27391 (2001).
  22. Andrews, A. J., Chen, X., Zevin, A., Stargell, L. A., Luger, K. The histone chaperone Nap1 promotes nucleosome assembly by eliminating nonnucleosomal histone DNA interactions. Mol Cell. 37, 834-842 (2010).
  23. Wu, R., Taylor, E. Nucleotide sequence analysis of DNA. II. Complete nucleotide sequence of the cohesive ends of bacteriophage lambda DNA. J Mol Biol. 57, 491-511 (1971).
  24. King, G. A., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Unravelling the structural plasticity of stretched DNA under torsional constraint. Nat Commun. 7, 11810(2016).
  25. Paik, D. H., Roskens, V. A., Perkins, T. T. Torsionally constrained DNA for single-molecule assays: An efficient, ligation-free method. Nucleic Acids Res. 41, e179(2013).
  26. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).
  27. Diaz-Celis, C., et al. Assignment of structural transitions during mechanical unwrapping of nucleosomes and their disassembly products. Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2206513119(2022).
  28. Leicher, R., et al. Single-molecule and in silico dissection of the interaction between Polycomb repressive complex 2 and chromatin. Proc Natl Acad Sci USA. 117, 30465-30475 (2020).
  29. Chua, G. N. L., et al. Differential dynamics specify MeCP2 function at methylated DNA and nucleosomes. bioRxiv. , (2023).
  30. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1960-1965 (2002).
  31. McCauley, M. J., et al. Human FACT subunits coordinate to catalyze both disassembly and reassembly of nucleosomes. Cell Rep. 41, 111858(2022).
  32. Mihardja, S., Spakowitz, A. J., Zhang, Y., Bustamante, C. Effect of force on mononucleosomal dynamics. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15871-15876 (2006).
  33. Li, S., et al. Nucleosome-directed replication origin licensing independent of a consensus DNA sequence. Nat Commun. 13, 4947(2022).
  34. Li, S., et al. Origin recognition complex harbors an intrinsic nucleosome remodeling activity. Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2211568119(2022).
  35. Harada, B. T., et al. Stepwise nucleosome translocation by RSC remodeling complexes. Elife. 5, e10051(2016).
  36. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution. Methods Mol Biol. 119, 1-16 (1999).
  37. Rogge, R. A., et al. Assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning DNA. J Vis Exp. (79), e50354(2013).
  38. Leicher, R., et al. Single-stranded nucleic acid binding and coacervation by linker histone H1. Nat Struct Mol Biol. 29, 463-471 (2022).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Ricostituzione in situmicroscopia a singola molecolamicroscopia a forzameccanica della cromatinachaperon istonico Nap1ancoraggio del DNAsrotolamento del nucleosomalegame degli istoni linker

Articoli correlati